槲皮素通過p53-p21-Rb通路緩解慢性阻塞性肺疾病的肺衰老*

高露洋 羅丹 王文軍

(西南醫科大學附屬醫院呼吸與危重癥醫學科,四川 瀘州 646000)

慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一種以持續性氣流受限為特征的呼吸系統常見病,早期病變可能僅局限于肺部,但隨著病情進展,可逐漸累及全身多個系統[1],具有較高的致殘率和致死率。肺是與外界環境相通的器官之一,特別是中老年人,他們暴露于有害氣體或粉塵等外界環境的時間更長,同時個體進入老年期后神經體液因子及免疫調節功能等會逐步下降,這將導致肺部結構和功能發生與年齡相關的病理性變化[2],對COPD等慢性肺部疾病的易感性增加[3],使得COPD好發于中老年人,且發病率隨著年齡的增長而逐漸升高[4],均提示衰老與COPD等年齡相關性疾病的發生發展密切相關。目前臨床上COPD的治療藥物以支氣管擴張劑、糖皮質激素等為主,然而這些藥物只能緩解癥狀,不能抑制疾病進展[5]。COPD作為一種肺部加速衰老的疾病,肺中衰老細胞的積累會進一步促進疾病進展[6],清除衰老細胞可能是防治COPD的有效方法?？顾ダ纤幬?Senolytics)是一類能夠清除衰老細胞的化合物,已被發現的藥物有白藜蘆醇、槲皮素、非瑟酮、雷帕霉素、二甲雙胍、達沙替尼等[7]。槲皮素(Quercetin,Q)是一種自然界廣泛存在的黃酮類化合物,作為抗衰老藥物之一[8],其可有效清除衰老的巨噬細胞和脂肪細胞[9-10]。然而槲皮素能否通過減少COPD患者肺內的衰老細胞改善COPD病情進展尚不清楚。因此,本研究通過構建COPD小鼠模型,觀察槲皮素是否對COPD小鼠肺組織具有抗衰老的作用,并研究其可能的機制,從而為COPD的臨床治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 30只清潔級C57BL/6雄性小鼠,6～8周齡,體重20～25 g,自由飲水和進食,待適應性喂養一周后開始進行實驗。實驗方案通過動物倫理委員會批準,動物使用許可證號:SYXK(川)2018-17。

1.2 主要試劑 槲皮素、脂多糖(Lipase, LPS)(美國MCE公司);HE染色液(美國sigma公司);SA-β-gal染色試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司);Bcl-2抗體、Bax抗體(美國Abcam公司);RIPA裂解液、BCA試劑盒、ECL化學發光試劑盒(武漢阿斯本生物技術有限公司);兔抗p53抗體(武漢三鷹生物技術有限公司)、兔抗p21抗體(美國Abcam公司)、兔抗Rb抗體(美國CST公司)、兔抗β-actin抗體(武漢科鹿生物科技有限責任公司)、山羊抗兔HRP標記的IgG二抗(武漢阿斯本生物技術有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 COPD小鼠動物模型建立及分組 將小鼠隨機分為對照組、模型組、槲皮素組,每組10只。模型組和槲皮素組采用煙熏聯合氣道內滴注LPS的方法建立COPD小鼠模型,具體方法參考文獻[11]。在造模的第1、14 d氣管內滴入脂多糖(25 μg/50 μL),第2 ～30 d(除第14 d)進行被動吸煙,將小鼠放入煙熏裝置中,每次10支香煙,每天2次,每次持續30 min(兩次間隔4 h以上),共煙熏28 d。對照組在第1 d和第14 d經氣道內滴入相同量的生理鹽水,不做煙熏處理。通過肺組織HE染色判斷是否造模成功[12]。若實驗過程中造模失敗或有小鼠死亡,則重新補齊小鼠維持每組樣本量為10只。

1.3.2 給藥方式 造模成功后,槲皮素組給予槲皮素(50 mg/kg)灌胃給藥,1次/d,持續4周。對照組和模型組接受等體積生理鹽水溶液灌胃。

1.3.3 HE染色觀察小鼠肺組織病理變化 麻醉所有小鼠并處死,取出小鼠的左肺組織用4%多聚甲醛固定24 h,再用乙醇梯度脫水,包埋在石蠟中,制成厚度為2～3 μm的組織玻片標本。采用HE染色,中性樹膠封片,在光鏡下觀察組織切片,并進行肺組織病理損傷評分[13]。評分指標:①支氣管粘膜上皮纖毛病變:粘連、倒伏或脫失。②支氣管粘膜上皮病變:糜爛、脫落或鱗化。③支氣管粘膜杯狀細胞增生情況。④支氣管壁炎性細胞浸潤。⑤肺泡腔內炎性滲出。⑥肺泡氣腫或萎陷。評分標準:根據病變程度分為正常、輕度異常、中度異常、重度異常,分別評為0、1、2、3分。每個切片任取5個視野,根據以上指標對觀察到的病變進行評分,將各項分值相加,即為每個標本得分總分。

1.3.4 衰老相關β-半乳糖苷酶染色(SA-β-gal染色)法 將肺組織用4%多聚甲醛固定24 h后,再用30%蔗糖溶液4 ℃低溫脫水,取出后用OCT包埋劑在-40 ℃冷凍包埋后進行冰凍切片;取一張肺組織的冰凍組織切片室溫復溫,PBS洗滌后用β-gal染色固定液室溫固定,傾去固定液,PBS洗3次,每次5 min,滴加適量的β-gal染色工作液(A液10 μL+B液體10 μL+C液930 μL +X-Gal溶液50 μL),37 ℃孵育過夜后,傾去工作液,PBS洗后封片,將切片置于光鏡(200×)下觀察組織染色,藍染面積為陽性面積,每張切片隨機選擇5個視野,用Image-Pro Plus分析系統測定陽性面積的積分光密度(IOD)。

1.3.5 免疫組化染色檢測各組小鼠Bcl-2、Bax蛋白的表達 將肺組織用4%多聚甲醛固定24 h后取出,經脫水后進行石蠟包埋切片,肺組織的石蠟切片進行脫蠟和水化處理后,用檸檬酸鹽緩沖液進行熱抗原修復,冷卻至室溫后PBS洗3次,每次5 min,加3%的過氧化氫溶液封閉內源性過氧化氫酶,PBS洗3次,每次5 min,再進行一抗4 ℃過夜,二抗37 ℃孵育30 min,加入DAB顯色,最后用蘇木精復染后進行脫水封片。在光鏡下觀察呈棕黃色的陽性細胞,每張切片隨機選擇5個視野,采用Image-Pro Plus分析系統測定視野內陽性細胞的積分光密度(IOD)。

1.3.6 Western blot檢測各組小鼠肺組織p53、p21、Rb蛋白的表達 將3組的肺組織用PBS清洗3次,加入蛋白裂解液裂解提取總蛋白,使用BCA試劑盒測定樣品蛋白濃度。配制適宜濃度的SDS-PAGE膠,隨后進行上樣、電泳、轉膜、封閉,在4 ℃條件下孵育一抗過夜,用TBST洗3次后加入二抗室溫孵育1 h,最后滴加ECL進行曝光顯影。用AlphaEaseFC軟件對目的條帶和內參條帶的灰度值進行量化分析,并計算目的條帶和內參條帶灰度值的比值。

2 結果

2.1 各組小鼠肺組織病理學表現 HE染色結果顯示,對照組可見肺泡結構正常完整,支氣管形態規則,支氣管黏膜柱狀上皮細胞排列整齊,無杯狀細胞增生,管壁未見變厚,未見炎性細胞浸潤;模型組可見肺泡結構被破壞,肺泡腔內可見大量炎癥細胞浸潤和出血,支氣管管腔變形,管壁增厚,支氣管黏膜上皮變性、壞死或脫落,杯狀細胞增多,管壁周圍有大量炎癥細胞浸潤;槲皮素組肺組織損傷程度較模型組減輕(見圖1)。對照組、模型組、槲皮素組肺組織損傷評分分別為(1.40±0.55)分 、(12.00±1.58)分 、(7.20±0.84)分,經方差分析,差異均有統計學意義(F=120.743,P<0.001)。進一步兩兩比較結果:與對照組比較,模型組小鼠肺組織損傷評分顯著升高(P<0.05);與模型組比較,槲皮素組小鼠肺組織損傷評分均顯著降低(P<0.05),見圖2。

圖1 各組小鼠肺組織HE染色病理學表現(標尺=100 μm)Figure 1 Pathological changes of mice lung tissue in each group

圖2 各組小鼠肺組織損傷評分Figure 2 Lung tissue injury scores of mice in each group注:與對照組相比, ①P<0.05;與模型組相比,②P<0.05。

2.2 各組小鼠肺組織衰老相關-β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色陽性面積半定量分析 衰老細胞經SA-β-gal染色后呈藍色,在光鏡下觀察切片組織藍染的陽性細胞(見圖3)。與對照組相比,模型組藍染陽性面積IOD值明顯增加(P<0.05);與模型組相比,槲皮素組陽性面積顯著減少(P<0.05),這說明槲皮素能有效延緩肺組織的衰老。見表1。

表1 各組小鼠肺組織SA-β-gal染色陽性面積IOD值Table 1 IOD value of SA-β-gal staining area of mice lung tissue in each group

圖3 各組小鼠肺組織SA-β-gal染色(200×)Figure 3 SA-β-gal chemical staining of mice lung tissue in each group

2.3 各組小鼠肺組織中Bcl-2、Bax蛋白的表達 與對照組相比,模型組小鼠肺組織中Bcl-2表達明顯下降、Bax蛋白表達明顯升高,差異有統計學意義(P<0.05);與模型組相比,經給藥處理后,槲皮素組小鼠肺組織中Bcl-2表達顯著升高,而Bax蛋白表達降低(P<0.05)。見圖4、表2。

表2 各組小鼠肺組織Bcl-2、Bax蛋白表達的IOD值Table 2 IOD value of Bcl-2 and Bax protein expression in mice lung tissue of each group

圖4 各組小鼠肺組織Bcl-2、Bax蛋白免疫組化染色(200×)Figure 4 Immunohistochemical staining of Bcl-2 and Bax proteins in mice lung tissues of each group注:Bcl-2、Bax蛋白表達于胞質,陽性細胞呈棕黃色。

2.4 各組小鼠肺組織中p53、p21、Rb蛋白的相對表達量 各組小鼠肺組織中p53、p21、Rb蛋白的相對表達量比較,經方差分析,差異均有統計學意義(P<0.05)。進一步兩兩比較:與對照組相比,模型組小鼠肺組織中p53、p21、Rb蛋白相對表達量均明顯增高(P<0.05);槲皮素組中小鼠肺組織中p53、p21、Rb蛋白相對表達量均低于模型組(P<0.05)。見表3、圖5。

表3 各組小鼠肺組織 p53、p21、Rb蛋白的相對表達量Table 3 Expression of protein p53, p21 and Rb in each group

圖5 各組衰老相關蛋白western blot檢測Figure 5 Western blot detects expression of aging-related protein p53, p21, Rb注:A.對照組;B.模型組;C.槲皮素組。

3 討論

COPD是一種嚴重危害人類健康的常見慢性疾病,已成為全球第三大死因,COPD的發病率隨著年齡的增加呈上升趨勢[14],常常與其他年齡相關的疾病同時存在,如動脈粥樣硬化、2型糖尿病、慢性腎臟病、骨質疏松等[15-16],嚴重影響患者心理[17]及身體健康,且衰老對許多年齡相關疾病的發生發展具有一定影響。研究[18-19]發現,在COPD肺中氣道上皮細胞、肺泡上皮細胞等多種細胞中均顯示出細胞衰老增加,這說明細胞衰老在COPD的發病機制中起到至關重要的作用。研究[20]發現,在衰老小鼠模型中使用抗衰老藥物,能夠有效清除衰老細胞,從而起到治療作用。目前COPD仍缺乏有效的治療手段。因此,在COPD中給予抗衰老治療可能是一種很有潛力的治療方法?？顾ダ纤幬镩纹に芈摵线_沙替尼可通過消除衰老細胞改善小鼠與年齡相關的功能障礙并延長壽命[21],但目前聯合用藥的安全性尚不明確,槲皮素聯合達沙替尼使用仍為時過早[22]。近年來研究發現槲皮素單一用藥仍具有抗衰老的作用,在體內和體外實驗中已得到了驗證。在體外,槲皮素可清除衰老的人類主動脈內皮細胞減輕動脈粥樣硬化[23];在體內,其也可以通過減少肺中的衰老細胞改善博萊霉素誘導的老年小鼠肺纖維化[24]。本研究首先通過煙熏和氣道內滴注脂多糖構建COPD小鼠模型,并連續4周給予槲皮素以探究其對肺衰老的治療作用及可能機制。HE染色結果顯示,模型組小鼠肺泡結構被破壞,肺泡腔內可見大量炎癥細胞浸潤和出血,支氣管黏膜上皮變性、壞死或脫落,杯狀細胞增多,支氣管管壁增厚,周圍有大量炎癥細胞浸潤,且模型組小鼠肺組織損傷評分顯著升高,均提示COPD小鼠模型構建成功。SA-β-gal作為細胞衰老的標志之一,在衰老細胞中表達升高[25],模型組小鼠肺組織經SA-β-gal染色后的藍染陽性面積較對照組小鼠明顯增加,證實了COPD小鼠肺組織發生了衰老。給予槲皮素進行干預后,發現小鼠肺組織結構破壞程度和炎性細胞浸潤程度明顯減輕,小鼠肺組織病理損傷明顯減輕,SA-β-gal染色的陽性面積減少,但不能完全恢復到對照組的狀態,表明槲皮素只能起到緩解肺損傷、延緩衰老的作用。

細胞衰老與細胞凋亡是緊密相關的。Bcl-2蛋白家族介導細胞凋亡過程,Bcl-2是重要的抗凋亡蛋白,能阻遏細胞凋亡的發生,使得細胞存活;Bax為促凋亡蛋白,當其表達過量時,可促進凋亡的發生[26]。有研究發現,衰老小鼠的Bcl-2表達減少、Bax表達增加,這會促進細胞凋亡,使得組織功能受損。本研究結果顯示,與對照組相比,模型組的Bcl-2蛋白表達下降、Bax蛋白表達增高;給予槲皮素后能上調Bcl-2蛋白表達,下調Bax蛋白表達,說明槲皮素能夠有效抑制肺內的細胞凋亡,改善肺組織的結構和功能。

p53-p21-Rb信號通路是重要的細胞衰老信號傳導通路[27],p53是一種細胞周期調節劑,衰老狀態下,它可以激活下游的p21分子,而p21又能抑制CDK2/CyclinE復合體,使得磷酸化的pRb蛋白轉變為去磷酸化的Rb蛋白。去磷酸化的Rb蛋白結合轉錄因子E2F,抑制了E2F下游的基因轉錄,從而使阻滯細胞進入S期,使細胞退出細胞周期,啟動細胞衰老過程[28-29]。本研究顯示,與對照組比較,COPD模型組小鼠肺組織的p53、p21、去磷酸化Rb蛋白表達顯著增加,槲皮素能顯著降低p53、p21、Rb蛋白的表達,提示槲皮素可以下調p53-p21-Rb衰老信號通路,說明槲皮素緩解COPD小鼠肺衰老的機制可能與p53-p21-Rb信號通路有關。

4 結論

槲皮素可通過下調p53-p21-Rb信號通路,減輕肺組織病理損傷,抑制肺組織細胞凋亡,延緩肺組織的衰老,從而起到治療COPD的作用。