肉蓯蓉不同提取部位對db/db小黑鼠降血糖作用

程世贊,廉婧,聶紫璇,蘇國明,常源,史輯,2,賈天柱,2

(1.遼寧中醫藥大學藥學院,遼寧 大連 116600;2.遼寧省中藥炮制技術產業創新中心,遼寧 大連 116600)

肉蓯蓉為列當科植物肉蓯蓉或管花肉蓯蓉的干燥帶鱗葉的肉質莖。春季苗剛出土時或秋季凍土之前采挖,除去莖尖,切段,曬干[1]。肉蓯蓉具有補腎陽、益精血、潤腸通便的功效,臨床上多用于腎陽不足、精血虧虛、陽痿不孕、腰膝酸軟、筋骨無力、腸燥便秘等。肉蓯蓉的藥理作用包括抗衰老、抗氧化、抗癡呆、抗疲勞以及潤腸通便等[2-3]。肉蓯蓉主要成分有苯乙醇苷類、環烯醚萜苷類、多糖等,其中苯乙醇苷類、多糖類成分為主要藥效物質[4]?，F代的藥理研究表明,肉蓯蓉多糖具有調節免疫活性、抗衰老、改善學習記憶能力、保護神經、抗肝損傷、抗病毒、抗腫瘤、影響腸道菌群等諸多藥理作用[5]。肉蓯蓉總苷具有滋補肝腎、益精血、抗氧化、抗衰老、免疫增強和神經保護作用[6]?！吨袊幍洹?020年版(一部)收載有肉蓯蓉片和酒蓯蓉兩個炮制品種,課題組前期研究發現,生品肉蓯蓉偏于潤腸通便,酒蓯蓉補腎助陽作用明顯增強。肉蓯蓉總苷和總多糖為補腎陽的有效部位,肉蓯蓉寡糖類成分為其潤腸通便的有效部位[7]。肉蓯蓉酒蒸過程中,苯乙醇苷類成分發生較大的變化,毛蕊花糖苷含量下降,而其同分異構體異毛蕊花糖苷含量明顯增加[8]。

2型糖尿病是由胰島素抵抗,伴隨胰島β細胞結構和功能性損傷,繼而導致胰島素分泌不足,以血糖升高為主要特征的代謝疾病[9]。中醫認為糖尿病往往與腎精有關,腎藏精,精虧則可誘發糖尿病,甚至會導致糖尿病腎病。2型糖尿病癥狀多表現為尿多、乏力、口渴喜飲、多食易饑等與腎陽虛類似癥狀,故中醫臨床治療糖尿病多以補腎固本、補益腎陽為主[10-11]。文獻報道,肉蓯蓉中的苯乙醇苷類成分,如松果菊苷和毛蕊花糖苷不僅能夠抑制餐后血糖水平的增加,而且能提高淀粉負荷小鼠的葡萄糖耐量[12-15]。這也提示著肉蓯蓉具有降血糖的作用。

db/db小黑鼠是由于瘦素(leptin)受體基因缺陷導致的先天肥胖性T2DM小鼠,其瘦素受體基因失去功能,在出生后2周內就發生高胰島素血癥,3～4周發展為肥胖,8周后就發展為非常嚴重的高血糖癥,期間伴有胰島素抵抗,β細胞功能衰竭[16-17],一般在8～10個月內死亡,可并發明顯的腎臟疾病[18]。本研究以db/db小黑鼠為實驗對象,分別富集肉蓯蓉和酒蓯蓉的總多糖、總寡糖和總苷類成分,并對不同提取部位的降血糖作用進行了比較研究,期望為肉蓯蓉酒蒸的炮制機理提供科學依據。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物自發性2型糖尿病小鼠模型的BKS.Cg-Dock7m+/+Leprdb/JNju(基因型:db/db糖尿病小黑鼠)雄性7周齡的小黑鼠,體重35～40 g,db/db m+(基因型:db/m+ 小黑鼠)雄性7周小黑鼠,體重量18～20 g,由南京大學-南京生物醫藥研究院,南京大學模式動物研究所提供。本研究方案通過遼寧中醫藥大學實驗動物倫理委員會審核,批準編號:2018YSDW-030-02。

1.2 藥物與試劑肉蓯蓉藥材于2019年5月采自內蒙古阿拉善(批號:20190508-1),經遼寧中醫藥大學藥學院翟延君教授鑒定為列當科植物肉蓯蓉(CistanchedeserticolaY.C.Ma) 的干燥帶鱗葉肉質莖,標本保存于遼寧省中藥炮制技術產業創新中心。

松果菊苷(echinacoside)對照品(批號:MUST-13080801,純度≥98%)、毛蕊花糖苷(verbascoside)對照品(批號:MUST-13122711,純度≥98%)、異毛蕊花糖苷(isoacteoside)對照品(批號:MUST-15081001,純度≥99.77%)、甜菜堿對照品(批號:894-200001,純度≥98%)均購自中國藥品生物制品檢定所;D101型大孔樹脂由成都曼斯特生物科技有限公司提供。

小鼠抗8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)單克隆抗體[批號:ab62623,艾博抗(上海)貿易有限公司];PAS(批號:G1281,北京索萊寶科技有限公司);抗熒光淬滅封片液(海碧云天生物技術有限公司);SP9001 兔SP檢測試劑盒(無錫傲銳東源生物科技有限公司);DAB、胰島素(INS)、糖化血紅蛋白(HbA1c)、甘油三酯(TG)、小鼠總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C)、尿酸(UA)、肌酐(Cr)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、尿微量白蛋白(mALB)試劑盒(上海朗頓生物技術有限公司)。膽固醇、二甲苯、無水乙醇、乙腈、甲醇為色譜純,水為超純水,其他試劑均為分析純。

1.3 主要儀器ACQUITY H-Class UPLC(美國Waters公司);血糖儀和血糖試紙條(拜耳醫藥保健有限公司);AE240型1/10萬電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司);FA1004型電子天平(上海精密科學儀器有限公司);BN-518生物組織自動包埋機(湖北伯納醫療科技有限公司);電熱恒溫干燥箱(忠偉電子儀表有限公司); Leica RM2245切片機(德國Leica Biosystems公司);pH酸度計(上海鵬順科學儀器有限公司);Milli-Q Integral 3 型凈水機 (法國Molsheim公司)。

2 實驗方法

2.1 肉蓯蓉炮制品制備肉蓯蓉:取肉蓯蓉藥材,洗凈雜質,上鍋常壓蒸制2 h,切成6 mm,70 ℃烘干。

酒蓯蓉:取肉蓯蓉飲片,加入適量黃酒拌勻,悶潤8 h(黃酒∶水=1∶1),高壓蒸制4 h,70 ℃烘干。(每100 g肉蓯蓉用黃酒30 mL)。

2.2 肉蓯蓉/酒蓯蓉不同提取部位富集取肉蓯蓉/酒蓯蓉粗粉30 g,加10倍量水加熱回流提取2次,每次2 h,合并提取液,濃縮,加乙醇至含醇量達60%,低溫沉淀12 h,抽濾,沉淀即為粗多糖部位。將上清液濃縮至適當濃度,上D101大孔吸附樹脂,依次用水和不同濃度的乙醇洗脫,收集水洗脫液,減壓濃縮至稠膏,即為總寡糖部位;40%乙醇洗脫液,減壓濃縮干燥,即為肉蓯蓉總苷部位。

2.3 肉蓯蓉/酒蓯蓉不同提取部位含量測定

2.3.1 肉蓯蓉/酒蓯蓉總多糖的含量測定稱取葡萄糖樣品20.00 mg于50 mL容量瓶中,制成0.4 mg·mL-1的葡萄糖標準溶液,分別吸取 3、4、5、6、7 mL置于50 mL容量瓶,用水定容至刻度,分別吸取各個濃度梯度的葡萄糖溶液2.0 mL于試管中,另取等量蒸餾水作空白對照,在各管加入1 mL 5%苯酚,搖勻,迅速加入5 mL濃硫酸,放置10 min,置40 ℃水浴中保持15 min,取出,迅速冷卻至室溫,在490 nm處測其吸光度值,以吸光度(A)為縱坐標,葡萄糖濃度(C)為橫坐標,繪制標準曲線,得回歸方程Y=8.37X-0.162 8(R2=0.994 6)。

精密稱取生、制品總多糖部分的粉末1.0 g,分別置于50 mL容量瓶中,加水溶解并定容至刻度,精密吸取2.0 mL于試管中,同標準曲線制備方法,測定,即得。

2.3.2 肉蓯蓉/酒蓯蓉中甜菜堿的含量測定

2.3.2.1 對照品溶液制備精密稱定甜菜堿對照品1.17 mg,放入5 mL量瓶中,加入50%甲醇溶解并定容,即得。

2.3.2.2 色譜條件色譜柱為Ecosil 120-5-AMINO色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),流動相:乙腈-水(99.5∶0.5),柱溫:30 ℃,檢測波長:194 nm,流速:0.6 mL·min-1,進樣量10 μL,色譜圖見圖1。

A.甜菜堿對照品;B.肉蓯蓉總寡糖部位;C.酒蓯蓉總寡糖部位

2.3.2.3 供試品溶液的制備精密稱取生、制品總寡糖部位的粉末1.0 g,分別置于5 mL容量瓶中,加蒸餾水溶解并定容至刻度,搖勻,過0.45 μL微孔濾膜,即得。

2.3.2.4 樣品含量測定精密吸取生、制肉蓯蓉中總寡糖供試品溶液,按“2.3.2.2”項下條件測定,計算樣品中甜菜堿含量。

2.3.3 肉蓯蓉/酒蓯蓉中松果菊苷、毛蕊花糖苷和異類葉升麻苷含量測定

2.3.3.1 對照品溶液的制備精密稱定松果菊苷4.50 mg、毛蕊花糖苷 4.80 mg、異類葉升麻苷5.05 mg分別放入5 mL容量瓶內,加50%甲醇溶解并定容至刻度,分別取各對照品溶液200 μL,置于進樣小瓶內,加400 μL 50 %甲醇,混勻,制成混合對照品溶液,搖勻,即得。

2.3.3.2 色譜條件色譜柱為Ecosil C18(4.6 mm×250 mm,5 μm),甲醇為流動相A,0.1%甲酸為流動相B,梯度洗脫,0～45 min,30% A→70% A,流速1.0 mL·min-1,柱溫30 ℃,檢測波長330 nm,進樣量10 μL,色譜圖見圖2。

A.混合對照品;B.肉蓯蓉總苷部位;C.酒蓯蓉總苷部位 1.松果菊苷;2.毛蕊花糖苷;3.異類葉升麻苷

2.3.3.3 供試品溶液的制備精密稱取生、制品總苷部分粉末1.0 g,分別置于100 mL容量瓶中,加50%甲醇溶解并定容至刻度,搖勻。各精密吸取 5 mL置于10 mL容量瓶中,加入50%甲醇定容,搖勻,過0.45 μm微孔濾膜,即得。

2.3.3.4 樣品含量測定精密吸取肉蓯蓉總苷樣品,按“2.3.3.2”項下條件測定。計算樣品中松果菊苷、毛蕊花糖苷以及異類葉升麻苷的含量。

2.4 動物分組、造模及給藥動物房為12 h光照、12 h黑暗,相對濕度為50%～70%,室溫為18～22 ℃。db/db小黑鼠和db/m小黑鼠(正常對照組)以普通飼料正常喂養,至9周齡開始實驗,除去正常對照組外,其余db/db小黑鼠根據血糖值及體重隨機分為8組,分別是模型組、陽性對照組、肉蓯蓉總多糖組、肉蓯蓉總寡糖組、肉蓯蓉總苷組、酒蓯蓉總多糖組、酒蓯蓉總寡糖組、酒蓯蓉總苷組。除正常對照組和模型組外,其余各組大鼠按2 mL/100 g的劑量連續4周灌胃給藥,藥液濃度均為4.1 g·kg-1,正常對照組和模型組同法同量灌胃生理鹽水。

2.5 肉蓯蓉不同炮制品提取部位對db/db小黑鼠血糖水平的影響

2.5.1 口服葡萄糖耐量(OGTT)檢測給藥26 d 后,禁食12 h,次日給藥60 min 后,各組小黑鼠分別給予2.0 g·kg-1的葡萄糖,分別于0、0.5、1.0、2.0 h尾靜脈取血測定血糖值,以血糖值為縱坐標,時間為橫坐標,制作血糖變化圖,并按公式計算各實驗組血糖曲線的線下面積(AUC,hmmoL·L-1)[19]。

AUC=A×0.25+B×0.50+C×0.75+D

式中:A、B、C、D分別為0、0.5、1.0、2.0 h 的血糖值。

2.5.2 胰島素抵抗指數及動脈硬化指數計算根據文獻方法計算胰島素抵抗指數[20]:HOMA-IR=Glucose×Insulin/22.5,HOMA-β=20×Insulin/(Glucose-3.5)×100%。IR是胰島素抵抗,β(%)是β細胞功能。葡萄糖的摩爾單位mmoL·L-1。胰島素以mU·L-1給出。葡萄糖和胰島素數字都是在禁食期間檢測。根據Zheng等[21]描述的方法計算動脈硬化指數(Atherogenic index),計算方法:Atherogenic index=(TC-HDL-C)/HDL-C。

2.5.3 肉蓯蓉/酒蓯蓉不同提取部位對db/db小黑鼠血清INS、HbA1c的影響取凍存血清樣品放至室溫后,用于INS、HbA1c酶聯免疫試劑盒的測試, 嚴格按照試劑盒說明書的方法及步驟進行操作。

2.6 肉蓯蓉/酒蓯蓉不同提取部位對db/db小黑鼠肝臟氧化應激水平影響取凍存血清樣品放至室溫后,用于MDA、SOD酶聯免疫試劑盒的測試, 嚴格按照試劑盒說明書的方法及步驟進行操作。

2.7 肉蓯蓉/酒蓯蓉不同提取部位對db/db小黑鼠肝臟脂肪代謝的影響大鼠血清TG、TC、HDL-C、LDL-C水平測定均采用相關試劑盒測定,具體測定步驟參考試劑盒說明書。

2.8 肉蓯蓉/酒蓯蓉不同提取部位對db/db小黑鼠血漿和尿液中UA、Cr以及mALB的影響取凍存血漿、尿液樣品放至室溫后,用于UA、Cr、mALB酶聯免疫試劑盒的測試,嚴格按照試劑盒說明書的方法及步驟進行操作。

2.9 HE染色法觀察胰腺和腎臟病理切片取出經10%多聚甲醛固定液浸泡24 h后的胰腺、腎臟組織,蒸餾水清洗組織后保存于70%乙醇中。取出組織樣品,經過梯度乙醇脫水、透明處理、石蠟包埋和切片處理,然后用蘇木精和伊紅染色(H&E染色)。待切片膠干后用高分辨率數碼成像系統觀察切片并拍照。

2.10 免疫組化法測定腎臟組織type-IV collagen的表達取腎臟切片脫蠟至水后進行抗原修復,10%山羊血清封閉,一抗4 ℃孵育過夜,洗滌后孵育二抗,現配溶液DAB顯色,洗滌、脫水、封片,于光學顯微鏡下觀察腎臟組織type-IV collagen蛋白表達。

2.11 統計學方法運用GraphPad Prism Version 5.01(2007,GraphPad Software inc)軟件分析數據,結果以mean±S.E.M.表示,兩組間差異進行One-way ANOVA(followed by Bonferroni′s compare selected pairs of column test)方法,P<0.05為差異顯著,具有統計學意義。

3 實驗結果

3.1 肉蓯蓉/酒蓯蓉不同提取部位含量測定結果按“2.3”項下條件測定,肉蓯蓉及酒蓯蓉不同提取部位含量測定結果見表1。

表1 肉蓯蓉/酒蓯蓉不同提取部位含量測定結果

3.2 藥理學指標測定結果

3.2.1 一般情況觀察動物實驗周期為4周,每周測定小黑鼠的空腹體重,結果見表2。灌胃實驗開始至結束,模型組小黑鼠的體重出現持續上升,符合2型糖尿病模型體重增加的特征。正常對照組大鼠的體重基本不變。不同給藥組對db/db小黑鼠灌胃1周后,與模型組相比,各給藥組大鼠體重增加的狀態均有不同程度改善,其中以酒蓯蓉總苷的改善作用最為明顯(P<0.05);不同給藥組對db/db小黑鼠灌胃2周和4周后,酒蓯蓉寡糖體重改善明顯(P<0.05或P<0.01)。以上結果表明,肉蓯蓉及酒蓯蓉不同提取部位對db/db小黑鼠有降低體重的作用,結果見表2。

表2 肉蓯蓉/酒蓯蓉不同提取部位對db/db小黑鼠體重的影響(g)

3.2.2 肉蓯蓉不同炮制品提取部位對db/db小黑鼠血糖水平的影響正常對照組db/db小黑鼠血糖均維持在一個正常水平(4.3～5.7 mmoL·L-1),而模型組小黑鼠血糖持續升高(P<0.01)。與模型組相比,給藥1周后,肉蓯蓉總多糖、總寡糖、總苷組及酒蓯蓉總多糖、總寡糖、總苷FBG降低(P<0.01);給藥2周后,酒蓯蓉總苷FBG降低(P<0.05);給藥3周后,肉蓯蓉總多糖和酒蓯蓉總寡糖FBG降低(P<0.05或P<0.01);給藥4周后,肉蓯蓉總多糖、總寡糖及酒蓯蓉總多糖、總寡糖、總苷FBG降低(P<0.05),結果見表3。

表3 肉蓯蓉不同炮制品及提取部位對db/db小黑鼠FBG值的影響(mmoL·L-1)

在口服葡萄糖耐量實驗(見表4)中,正常對照組小黑鼠的平均血糖水平在30 min時達到峰值,然后快速下降到正常水平。而模型組小黑鼠的平均血糖水平在30 min達到峰值后,繼續保持在較高的水平。與模型組相比,各給藥組小黑鼠血糖達到最高值后呈不同程度的下降趨勢,其中酒蓯蓉總多糖、總寡糖和總苷組下降速度較快。此外,根據計算得各組AUC,結果顯示各給藥組小黑鼠AUC均低于模型組,肉蓯蓉總多糖和酒蓯蓉總苷降低了給予葡萄糖后2個時間點(90、120 min)的血糖值(P<0.05或P<0.01),肉蓯蓉總寡糖和酒蓯蓉總多糖降低了給予葡萄糖120 min后的血糖值(P<0.05),酒蓯蓉總寡糖降低了給予葡萄糖后3個時間點(0、90、120 min)及曲線下面積(P<0.05或P<0.01)。結果表明,肉蓯蓉和酒蓯蓉可改善db/db小黑鼠的OGTT能力。

表4 肉蓯蓉不同炮制品及提取部位對db/db小黑鼠OGTT的影響

與正常對照組相比,模型組小黑鼠胰島素抵抗指數(HOMA-IR)、HbA1c水平升高(P<0.05),胰島β細胞分泌指數(HOMA-β)水平降低。與模型組相比,肉蓯蓉寡糖組、肉蓯蓉多糖組、酒蓯蓉寡糖組與酒蓯蓉總苷組血清HbA1c含量明顯降低(P<0.05);肉蓯蓉多糖組、酒蓯蓉多糖組、酒蓯蓉寡糖組與酒蓯蓉總苷組HOMA-IR指數明顯降低(P<0.05);經過給藥組干預4周后,與模型組相比,各給藥組小黑鼠胰島β細胞分泌指數水平均有不同程度的升高,結果見表5。

表5 db/db小黑鼠的HOMA-IR、HOMA-β和血清HbA1c、INS水平

胰島素屬于一種蛋白質激素,主要由胰腺組織中的胰島β細胞合成與分泌,參與機體的糖代謝,維持機體血糖平衡,血清INS水平可反映糖尿病治療的效果。從表5可知,與正常組相比,模型組小黑鼠的INS水平顯著降低(P<0.01)。經過給藥組干預4周后,與模型組相比,各給藥組小黑鼠空腹血清胰島素水平均有不同程度的升高,其中以肉蓯蓉和酒蓯蓉的總苷組升高最為明顯。結果表明,各給藥組可提高db/db小黑鼠的血清胰島素水平,促進胰島β-細胞分泌胰島素。

3.2.3 肉蓯蓉/酒蓯蓉不同提取部位對db/db小黑鼠肝臟氧化應激水平影響模型組小黑鼠肝臟MDA水平顯著高于正常組(P<0.05)。經過給藥組干預4周后,與模型組相比,各給藥組的MDA水平均出現不同程度下降(P<0.05),其中肉蓯蓉總多糖、肉蓯蓉總寡糖、肉蓯蓉總苷、酒蓯蓉總苷和酒蓯蓉總寡糖的小黑鼠肝臟組織MDA水平減少最明顯(P<0.05或P<0.01)。結果表明,肉蓯蓉對降低db/db小黑鼠肝臟組織MDA水平具有一定的效果,改善效果好于酒蓯蓉給藥組。

模型組小黑鼠肝組織中SOD活力低于正常對照組(P<0.05)。當給予肉蓯蓉和酒蓯蓉不同提取部位灌胃后,可提高db/db小黑鼠肝臟組織中SOD活力,與模型組相比,各給藥組均可恢復SOD活力,其中肉蓯蓉總苷組差異有統計學意義(P<0.05),結果見表6。

表6 db/db小黑鼠的肝臟重量、相對肝臟重量和肝臟SOD、MDA水平

3.2.4 肉蓯蓉/酒蓯蓉不同提取部位對db/db小黑鼠肝臟脂肪代謝的影響為評價肉蓯蓉/酒蓯蓉對db/db小黑鼠的血清血脂代謝水平影響,實驗檢測了糖尿病脂質代謝相關標志物。從表7可知,與正常對照組相比,模型組小黑鼠血清LDL-C水平顯著升高(P<0.05),HDL-C水平降低。經過給藥干預4周后,與模型組相比,肉蓯蓉總多糖、總寡糖和總苷組以及酒蓯蓉總多糖、總寡糖和總苷組的血清TG、TC和LDL-C水平均出現不同程度降低,HDL-C水平升高,其中肉蓯蓉總苷組有改善TC水平作用(P<0.05)。結果表明,肉蓯蓉和酒蓯蓉在一定程度上可改善db/db小黑鼠的脂代謝紊亂。

表7 db/db小黑鼠的肝臟TC、LDL-C、HDL-C和TG水平

表8 治療第28天db/db小黑鼠血漿和尿液中UA、Cr以及mALB水平

3.2.5 肉蓯蓉/酒蓯蓉不同提取部位對db/db小黑鼠血漿和尿液中UA、Cr以及mALB的影響給藥4周后,與模型組相比,肉蓯蓉總多糖、總寡糖以及酒蓯蓉總苷組的UA、Cr以及mALB水平均出現不同程度的降低,其中肉蓯蓉總苷組對血漿中的Cr以及尿液中的Cr、UA和mALB有降低作用(P<0.05或P<0.01),酒蓯蓉多糖組對尿液中的UA、Cr以及mALB水平改善作用(P<0.05或P<0.01),酒蓯蓉對血漿中UA水平有改善作用(P<0.05),肉蓯蓉總苷一定程度上可降低db/db小黑鼠血漿UA、Cr以及mALB水平。

3.2.6 肉蓯蓉不同炮制品及提取部位對db/db小黑鼠胰腺、腎臟組織病理學影響正常對照組小黑鼠胰腺組織無病理學損傷,胰島可見清晰邊緣,胰島細胞呈橢圓形且有序排列在胞漿中,細胞核呈圓形,胰島數量較多且體積較大。模型組小黑鼠胰腺組織無完整胰島,胰島邊緣不清晰且形狀不完整,胰島 β 細胞排列雜亂無章,數量較少,并出現萎縮現象,胰腺出現嚴重損傷。與模型組大鼠相比,經過肉蓯蓉/酒蓯蓉不同提取部位灌胃4周后,各提取部位給藥組的胰島組織部分恢復,胰島細胞體積出現不同程度變大,胰島細胞可見清晰的邊界,排列無序的狀況得到改善。其中,以肉蓯蓉和酒蓯蓉總苷組恢復的最好。

圖3 肉蓯蓉/酒蓯蓉不同提取部位對db/db小黑鼠胰腺病理學的影響(H&E,200 ×)

圖4 肉蓯蓉/酒蓯蓉不同提取部位對db/db小黑鼠腎臟病理學的影響(H&E,200 ×)

圖5 肉蓯蓉/酒蓯蓉不同提取部位對db/db小黑鼠腎臟type-IV collagen表達型膠原的表達結果

正常對照組小黑鼠的腎臟組織無明顯損傷,腎小球結構、形態以及與腎小球囊腔的比例正常,近端小管與遠端小管的管壁薄厚、管腔大小正常。模型組小黑鼠腎小球結構、形態、大小不規則,血管球萎縮、腎球囊腔消失,近端小管與遠端小管的管壁薄厚不勻、管腔大小不一、界限不清模糊,腫脹壞死,有大量的炎性細胞浸潤。與模型組大鼠相比,經過肉蓯蓉/酒蓯蓉不同提取部位灌胃4 周后,各提取部位給藥組的腎臟組織有所改善,腎小球結構、形態、大小接近正常,近端小管與遠端小管的管壁薄、管腔大小得到改善,腫脹減輕,有的部位仍可見少量的炎性細胞浸潤。其中以肉蓯蓉多糖組和酒蓯蓉多糖組恢復最好。

3.2.7 肉蓯蓉/酒蓯蓉不同提取部位對db/db小黑鼠腎臟組織中type-IV collagen表達與正常組相比,模型組小黑鼠腎臟type-IV collagen蛋白表達發生了明顯變化(P<0.05)。與模型組相比,各給藥組小黑鼠的平均腎膜基質面積增加,其中肉蓯蓉多糖組、酒蓯蓉寡糖組、酒蓯蓉總苷組中type-IV collagen的表達改善,而腎基膜中的type-IV collagen表達差異無統計學意義。

4 討論與結論

本文研究表明肉蓯蓉多糖部位經過酒蒸后含量下降,推測多糖在酒蒸過程中發生水解;肉蓯蓉寡糖部位中的甜菜堿經過酒蒸后含量增加,炮制過程中可能生成了甜菜堿類成分,而使甜菜堿含量增加;總苷類成分,松果菊苷的含量稍有下降,毛蕊花糖苷含量下降,異類葉升麻苷含量上升。

2型糖尿病(T2DM)的病因眾多,其病機是由于β細胞功能障礙和胰島素抵抗而引起糖、脂肪、蛋白質的代謝紊亂。其中基因、肥胖和體力活動顯然是2型糖尿病最重要的風險因素[22]。從中醫學角度分析,2型糖尿病屬于“消渴”范疇,而脾腎陽虛證是因為陽氣耗損,在脾陽虛的狀態下無法發揮滋補脾腎的作用,從而導致陽氣損傷的發生[23]。HbA1c是評價糖尿病血糖控制的“金標準”。英國前瞻性糖尿病研究發現HbA1c水平越高,糖尿病慢性并發癥發生風險越大。本實驗表明,肉蓯蓉多糖和寡糖及酒蓯蓉寡糖和總苷顯著降低HbA1c水平。

INS分泌相對不足是2型糖尿病的發病機制之一[24]。本研究證明,肉蓯蓉及酒蓯蓉各部位均能提高胰島素水平,說明生制肉蓯蓉不同提取部位可增加胰島素分泌。mALB對于早期腎損害具有重要參考意義,而尿Cr能準確反映腎功能狀態[25]。肉蓯蓉總苷和酒蓯蓉總多糖顯著降低了mALB水平,肉蓯蓉總苷、酒蓯蓉多糖和寡糖顯著降低了Cr水平,降低了腎功能損害。UA通過參與氧化應激,導致內皮功能障礙,加重胰島素抵抗[26]。肉蓯蓉總苷和酒蓯蓉總多糖顯著降低UA水平,使尿酸分泌減少,降低胰島素抵抗。

2型糖尿病血脂異常的主要表現為HDL-C、LDL-C、TG水平升高等,這些因素同樣是誘發動脈粥樣硬化的因素[27]。本實驗中,肉蓯蓉總多糖、總寡糖和總苷組以及酒蓯蓉總多糖和總苷組的血清HDL-C、LDL-C以及TG水平均出現不同程度降低,一定程度上可降低血脂從而促進降血糖作用。肉蓯蓉不同提取部位可顯著提高HDL-C/TC水平,降低動脈粥樣硬化指數。提示肉蓯蓉不同提取部位對糖尿病和心血管疾病的治療均有益處。

研究發現,MDA在糖尿病患者體內的表達水平比正常人高;超氧化物歧化酶SOD在糖尿病患者的活性比正常人低,提示氧化應激可能在糖尿病腎病的發生發展中起重要作用[28]。本實驗各給藥組的MDA水平均出現不同程度下降,SOD活力均有提高,提示在肉蓯蓉及酒蓯蓉各提取部位有抑制氧化應激的作用。

本文深入研究了肉蓯蓉不同提取部位的降血糖作用,發現肉蓯蓉和酒蓯蓉總苷具有較好的降血糖作用,酒蓯蓉多糖和寡糖也有一定的降血糖作用,為臨床合理應用肉蓯蓉及其炮制品提供可靠實驗依據。肉蓯蓉是我國著名的補益中藥,其藥理作用廣泛,在臨床疾病的預防和治療中發揮巨大的作用,其有很好的應用前景。然而,肉蓯蓉具有抗高血糖和降血脂作用的生物活性成分和機制有待進一步研究。