基于IL-6/STAT3信號通路探討山楂酸對小鼠結腸癌CT26細胞增殖、凋亡的影響

李智,陳莉

(福建中醫藥大學藥學院,福建 福州 350122)

結腸癌(colorectal cancer,CRC)是一種常見的胃腸道惡性腫瘤,為世界范圍內五大主要癌癥之一,中國結腸癌發病率位居全國第 3 位,死亡率居于全國第5位,且發病率和死亡率仍在逐年上升[1]。結腸癌的發病與遺傳、飲食、腸道的慢性炎癥等因素相關,由于其發病早期癥狀較隱匿,加大了早期發現、治療的難度,晚期生存預后較差。目前,放療、化療、手術治療是 CRC 的主要治療方法[2],近年來許多研究表明,中藥中的有效成分能抗腫瘤增殖及減少腫瘤的轉移,有利于提高患者生存期,改善預后,提高患者生存質量等優點,成為當下結腸癌新藥探索開發的熱點[3]。

山楂酸(maslinic acid,MA)是一種五環三萜酸,存在于山楂、橄欖等多種天然植物中,具有豐厚的藥用價值。近年來,相關研究顯示其具有抗腫瘤、抗炎等生物活性[4-5]。已有研究表明,山楂酸在體內外表現出對結腸癌的治療作用,山楂酸可通過 AMPK/mTOR 信號通路抑制結腸癌細胞HCT116與SW480的增殖與遷移[6],阻滯人結腸癌 HT29 細胞周期至G1期[7],激活caspase-8和caspase-3,誘導腫瘤細胞凋亡[8];同時,山楂酸也能降低1,2-二甲基肼誘導的結腸癌大鼠模型中腫瘤前生物標志物的含量[9]。信號轉導及轉錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription,STAT3)與多種惡性腫瘤的發生、發展關系最為密切,備受研究者的關注[10]。但目前國內外暫未有研究報道山楂酸對小鼠結腸癌CT26細胞中STAT3信號通路的影響。本研究基于STAT3 信號通路,探討山楂酸對小鼠結腸癌 CT26 細胞增殖、凋亡的影響,為深入研究山楂酸在抗結腸癌的基礎研究和臨床應用提供理論和實驗依據。

1 實驗材料

1.1 實驗細胞小鼠結腸癌細胞(CT26)購自武漢普諾賽生物科技有限公司。

1.2 實驗試劑山楂酸(寶雞市辰光生物科技有限公司);磷酸酶抑制劑正釩酸鈉(Selleck公司);磷酸鹽緩沖液、青-鏈霉素、1640培養基等試劑(Hyclone公司);胎牛血清(Vivacell公司);IL-6(PeproTech公司);DMSO(Sigma公司);CCK-8試劑盒、細胞凋亡檢測試劑盒(大連美侖生物技術有限公司);STAT3、磷酸化 STAT3(p-STAT3)、B淋巴細胞瘤-2 基因(Bcl-2)抗體(Cell Signaling Technology公司);內參肌動蛋白(Actin)抗體(Cohesion Biosciences公司);二抗(Merck Millipore公司);RNA抽提試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司);逆轉錄試劑盒(賽默飛公司);RT-PCR熒光染料定量預混液(南京諾維贊生物科技有限公司);無蛋白快速封閉液(上海雅酶生物科技有限公司)。

1.3 實驗儀器AUWD120電子分析天平(島津公司); MILLI-Q超純水裝置(Millipore公司);Tri-Gas INCuRATOR/三氣培養箱(上海力申科學儀器有限公司);Infinite M200 Pro多功能酶標儀(Tecan公司);小型槽式轉印系統、電泳槽(Bio-Rad公司);化學發光成像儀(Amersham Pharmacia Bioscience公司);流式細胞儀(安捷倫公司)。

2 實驗方法

2.1 細胞培養小鼠結腸癌CT26細胞用含10% FBS和1%青-鏈霉素雙抗的1640培養基培養于37℃、5% CO2的恒溫培養箱中,胰酶消化傳代。

2.2 CCK-8法檢測細胞活力將處于對數生長期的 CT26 細胞消化,收集細胞計數。調整細胞濃度后以 5 000/孔的密度接種到 96 孔板中(100 μL/孔),放回培養箱中繼續培養過夜。次日,吸棄培養基,分為空白對照組、山楂酸(10、20、30、35、40、45、50 μmoL·L-1)組每孔加入100 μL相應濃度的藥物。放回培養箱中繼續培養24 h 后,每孔加入100 μL 10%的CCK-8工作液, 再放回培養箱繼續孵育,1 h后使用酶標儀在450 nm波長下檢測每孔的吸光度(OD)值并根據公式計算細胞活力。

細胞活力=給藥處理組吸光度值/未給藥空白組吸光度值×100%

2.3 流式細胞術檢測細胞凋亡率將處于對數生長期的CT26細胞消化,收集細胞并計數。調整細胞濃度后以3×105孔的密度接種到 12 孔板中,放回培養箱中繼續培養過夜。次日,吸棄培養基,分為空白對照組、山楂酸(10、20、30、35、40 μmoL·L-1)組,加入藥物干預24 h后收集細胞,根據細胞凋亡檢測試劑盒說明書進行染色,避光染色一段時間后上機檢測細胞凋亡率。

2.4 RT-PCR檢測mRNA表達水平將處于對數生長期的CT26細胞消化,收集細胞并計數。調整細胞濃度后以3×105孔的密度接種到12孔板中,讓細胞生長貼壁過夜后,吸棄原培養基,分為空白對照組、山楂酸(10、20、30、35、40 μmoL·L-1)組,加入藥物處理24 h后用 RNA 抽提試劑盒提取細胞總RNA。測定RNA 濃度后,取適量RNA進行逆轉錄,逆轉錄取cDNA上樣檢測。

2.5 Western blotting檢測細胞蛋白表達水平將處于對數生長期的CT26 細胞消化,收集細胞并吹打混勻,制備成單細胞懸液并計數。調整細胞濃度后以8×105/孔的密度接種于 6孔板中,放回培養箱中繼續培養過夜。次日,吸棄培養基,分為空白對照組、山楂酸(10、20、30、35、40 μmoL·L-1)組,加入藥物干預24 h后收集細胞,裂解后提取細胞總蛋白,測定濃度后加入5×蛋白上樣緩沖液,于100 ℃變性10 min后,根據蛋白濃度定量結果吸取蛋白樣品經SDS-PAGE凝膠電泳,電泳結束后將蛋白轉膜至PVDF膜上,無蛋白快速封閉液封閉15 min,封閉結束后加入相應的一抗, 4 ℃孵育過夜。次日,使用TBST緩沖液洗膜10 min×3次,室溫孵育二抗2 h,TBST緩沖液洗膜10 min×3次。滴加ECL顯影液曝光顯影,使用Imagine Lab軟件分析條帶灰度值。

2.6 統計學方法實驗數據計量資料均以均數±標準差(Mean±SD)表示,并采用 SPSS 26.0 軟件進行分析。各組數據符合正態性檢驗時,組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA); 各組數據不符合正態性檢驗時,組間比較采用非參數檢驗。P<0.05,表示具有顯著差異;P<0.01,表示具有極顯著差異。

3 實驗結果

3.1 不同濃度山楂酸對CT26細胞活力的影響與空白組相比,CT26細胞經不同濃度山楂酸處理24 h后,細胞增殖活力降低且呈現劑量依賴性,20、30、35、40、45、50 μmoL·L-1濃度的山楂酸能降低CT26細胞活力(P<0.05)。

3.2 不同濃度山楂酸對CT26細胞凋亡的影響如圖1所示,與空白組相比,CT26細胞經不同濃度山楂酸處理24 h后,30、35、40 μmoL·L-1山楂酸能顯著增加CT26細胞凋亡率(P<0.05),低濃度山楂酸(10、20 μmoL·L-1)則對細胞總凋亡率無顯著影響。

圖1 山楂酸對CT26細胞凋亡的影響

3.3 不同濃度山楂酸對CT26細胞中IL-6 mRNA表達水平的影響與空白組相比,CT26細胞經不同濃度山楂酸處理24 h后,IL-6 mRNA 表達水平降低且呈現劑量依賴性,30、35、40 μmoL·L-1濃度的山楂酸能顯著降低CT26細胞中IL-6 mRNA的表達水平(P<0.05)。

3.4 不同濃度山楂酸對CT26細胞中p-STAT3、STAT3蛋白表達水平的影響如圖2所示,與空白組相比,CT26細胞經不同濃度山楂酸處理24 h后,30、35、40 μmoL·L-1山楂酸能顯著降低細胞中p-STAT3蛋白的表達(P<0.05)。同時,如圖3所示山楂酸也能夠抑制IL-6刺激后CT26細胞中p-STAT3蛋白的表達水平,且在35、40 μmoL·L-1有顯著差異。

圖2 山楂酸對CT26細胞中p-STAT3蛋白表達水平的影響

圖3 山楂酸對IL-6誘導的CT26細胞中p-STAT3蛋白表達水平的影響

3.5 不同濃度山楂酸對CT26細胞中p-JAK2、JAK2、Bcl-2蛋白表達水平的影響如圖4～5所示,與空白組相比,CT26細胞經不同濃度山楂酸處理24 h后,CT26細胞中p-JAK2、JAK2蛋白表達水平沒有明顯變化,35、40 μmoL·L-1濃度的山楂酸能顯著降低Bcl-2蛋白的表達水平。

圖4 山楂酸對CT26細胞中p-JAK2蛋白表達水平的影響

圖5 山楂酸對CT26細胞中Bcl-2蛋白表達水平的影響

3.6 磷酸酶抑制劑正釩酸鈉影響山楂酸對CT26細胞中p-STAT3蛋白水平的抑制作用如圖6所示,與單用山楂酸組相比,40 μmoL·L-1山楂酸+50 μmoL·L-1正釩酸鈉組細胞中p-STAT3蛋白的表達水平有所憂復,且與空白組細胞中p-STAT3蛋白表達水平相當。

圖6 山楂酸、正釩酸鈉對CT26細胞中p-STAT3蛋白表達水平的影響

4 討論

結腸癌是第三種最常見的惡性腫瘤,影響著全球數百萬人。美國癌癥協會發表的統計數據顯示:結腸癌的發病率為 6.1%,死亡率已經達到了9.2%[11]。腫瘤細胞的異常增殖和凋亡減少是其惡性發展的基礎,故腫瘤治療的關鍵是抑制其增殖和促進其凋亡[12]。本研究結果顯示經山楂酸處理后的CT26細胞活力降低,細胞增殖抑制率呈濃度依賴性升高;流式細胞術結果顯示經山楂酸處理后的CT26細胞凋亡率增加,同時Western blotting結果顯示山楂酸能夠顯著下調STAT3下游抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白的表達水平。以上結果說明山楂酸可影響CT26細胞的惡性生物學,能夠抑制其異常增殖并誘導凋亡,且有一定的濃度依賴性。

吸煙、飲酒過度、食炎癥性腸病等是誘發結腸癌的危險因素,這其中慢性炎癥與結腸癌的發病密切相關。有研究發現在結腸癌患者的血清和腫瘤組織中發現了高表達的 IL-6,且其表達水平與患者的腫瘤大小、轉移情況、預后和生存率均有關[13]。IL-6 是一種促炎性細胞因子,與細胞表面的 IL-6結合受體蛋白(interleukin-6 binding receptor protein,IL-6R)結合后可引發經典信號通路途徑,在細胞質中募集并激活 JAK 激酶蛋白,而后磷酸化其受體酪氨酸殘基,繼而激活 STAT3 的磷酸化,磷酸化的 STAT3 形成同源二聚體并發生核轉位后,可結合并激活靶基因的轉錄,最終調節 STAT3 靶基因的表達,實現其各種生物學功能[14]。STAT3的異?；罨c多種惡性腫瘤的發生與發展密切相關,已有大量研究表明抑制STAT3活化已成為抗腫瘤治療有效手段的潛力。本研究結果顯示,CT26細胞經山楂酸處理后,細胞中IL-6 mRNA的水平降低,同時細胞中p-STAT3蛋白的表達水平顯著下降,這提示山楂酸能夠降低細胞中IL-6的表達水平,并進一步抑制STAT3的活化。同時山楂酸也能夠有效抑制IL-6所誘導的CT26細胞中的STAT3磷酸化。

STAT3在許多血液性和實體腫瘤中高度活化。腫瘤細胞中的蛋白酪氨酸激酶(RTK)直接募集Janus激酶(JAK)使JAK發生磷酸化而活化,隨后活化的JAK促使STAT3的Y705位點磷酸化而活化[14]。為了進一步深入探究山楂酸是如何影響STAT3的活化,本研究檢測了經山楂酸處理的CT26細胞中STAT3上游激酶p-JAK2、JAK2蛋白的表達水平,結果顯示山楂酸對上游激酶p-JAK2、JAK2的蛋白表達水平沒有影響。于是后期實驗引入了磷酸酶抑制劑正釩酸鈉進一步探究山楂酸對STAT3活化的影響,結果顯示磷酸酶抑制劑可以逆轉山楂酸對STAT3活性抑制,顯著上調p-STAT3蛋白的表達水平。以上實驗結果提示山楂酸抑制STAT3的活化可能是通過促進磷酸酶降解p-STAT3蛋白來實現的,與上游激酶JAK2無關。

綜上所述,山楂酸能夠抑制CT26細胞增殖,誘導細胞凋亡,且呈現一定的濃度依賴性,其可能是通過抑制STAT3信號通路相關蛋白的活化來實現的。這為山楂酸體外抗結腸癌提供了一定的實驗依據,但其體內外抗結腸癌活性與機制值得進一步深入探究。