基于TCGA數據庫分析鐵死亡代謝和lncRNA在結直腸癌中的表達及臨床意義

潘 楠,唐桂艷,呂 楠,馬太原

(吉林大學第一醫院 結直腸肛門外科,吉林 長春130021)

結直腸癌是全世界范圍內最為常見的消化道惡性腫瘤。近年來,結直腸癌發病率和死亡率均表現為逐年升高的趨勢,嚴重威脅人類的身心健康,因為結直腸癌患者的早期臨床癥狀較隱匿,多無明顯癥狀,晚期則出現嚴重的癥狀,如貧血和體重減輕,多數患者自己察覺并至醫院專業診斷時已至中晚期,到目前為止根治性的手術仍然是治療結直腸癌的首選方案,但術后的高復發率、高轉移率和低生存率等問題一直沒有很好的解決,結直腸癌患者的預后仍然很差,因此尋找新的診斷和治療方法是目前的首要任務[1-3]。2012年,Dixon等將由鐵依賴脂質過氧化物累積導致細胞死亡方式命名為“鐵死亡”[4]。鐵死亡是程序性細胞死亡的形式之一,它不同于細胞凋亡、自噬,有其獨特的形態學和生物代謝方面的變化,其特征在于鐵依賴性的脂質過氧化物(LOS)積累使氧化還原反應平衡被破壞,最終導致細胞死亡[5]。已與研究發現鐵死亡代謝與各種人類疾病和腫瘤發生均密切相關[6-7]。近年來發現核苷酸長度大于200nt的非編碼RNA(LncRNA)與各種癌癥相關的過程(例如增殖,侵襲,轉移和代謝)都起著新作用,目前已發現多種LncRNA在不同腫瘤組織的表達具有顯著差異性,在腫瘤發生發展過程中,LncRNA參與調控多種生物功能而發揮重要的作用,例如乳腺癌,消化道腫瘤,呼吸系統腫瘤和泌尿系統腫瘤[8-10]。為探索可靠的鐵死亡代謝相關基因和lncRNA對于結直腸癌預后評估的意義,本研究下載分析TCGA數據庫中結直腸癌患者的高通量測序數據和臨床數據,分析鐵死亡代謝和lncRNA在結直腸癌中的表達及臨床意義,為結直腸癌患者新的診斷、治療和預后提供新的建議。

1 材料與方法

1.1 數據下載與處理

通過TCGA數據(https://portal.gdc.cancer.gov/repository)下載結直腸癌患者mRNA表達譜數據和臨床數據,該數據集包括 385例患者腫瘤組織和39例正常組織的的測序信息(表1),并利用R語言(R 3.6.3,https://www.r-project.org/)對數據進行提取和標準化處理。由于TCGA數據庫是公開獲取資源,因此本研究免于倫理委員會的批準。

表1 本研究使用的肝癌患者的基本特征

1.2 相關基因的提取與處理

以(cor>0.6和P<0.05)為篩選標準,檢索獲得與結直腸癌中鐵死亡代謝相關的219個基因信息,檢索獲得了與結直腸癌相關的1346個lncRNA基因信息,篩選差異表達的基因(DEGs),DEGs的篩選通過GEO2R[11]在線工具識別,FDR(false discovery rate)表示錯誤發現率,它是通過p value進行校正得到的,是DEGs篩選的關鍵指標。logFC<0的DEGs被認為是下調基因,而logFC>0的DEGs被認為是上調基因,對篩選出的DEGs并進行GO[12]聚類分析(圖1a)和KEGG[13]富集分析(圖1b),初步判斷DEGs的主要功能和參與的代謝途徑。

圖1a 鐵死亡代謝相關DEGs的GO分析

1.3 lncRNA預后風險評分模型構建

LASSO回歸分析再次篩選基因。對篩選到的目標基因在正常和腫瘤組織中的差異進行表達量的分析,利用Kaplan-Meier(K-M)生存分析評估目標基因對生存率的影響。為了進一步分析目標基因與不同臨床病理特征的關系,選取年齡、性別、病理分期等臨床信息均采用單因素和多因素Cox回歸對預后模型進行分析。使用GSEA中的Hallmarker探究目標基因可能作用的機制。

2 結果

2.1 結直腸癌關鍵lncRNA基因的確定

通過GEO2R在線工具識別篩選肝癌代謝相關差異表達的lncRNA,結果發現共有582個DEGs,其中上調表達的有531個DEGs,下調表達的有51個DEGs。進一步通過單因素Cox回歸對篩選得到的肝癌代謝相關的差異表達的lncRNA基因進行分析(P<0.05),共篩選獲得AC107308.1等36個lncRNA基因,圖2對這36個差異表達的lncRNA基因進行單因素回歸分析,其中AC104819.3和AL137782.1的風險數值均小于1,分別為0.154和0.497。

圖2 單因素Cox回歸分析篩選結直腸癌中的lncRNA相關基因

并以LINC01857等12個lncRNA基因構建結直腸癌患者預后風險多因素Cox回歸分析(圖3),根據每個基因的表達值,熱圖分析表明這些lncRNA基因的高表達都與肝癌的不良預后相關,其中AC104819.3和AL137782.1的表達量較低,與單因素Cox回歸分析結果一致。根據風險模型,可得到所有結直腸癌患者的風險值,并將所有患者風險值的中位值設為閾值,根據此閾值將患者區分為高風險組和低分險組,用Kaplan-Meier法繪制生存曲線(圖4),現有的生存分析表明,高、低風險組的生存相比較,差異顯著,具有統計學意義(P<0.001),隨著時間的慢慢延長,生存率也是在逐漸的降低,低風險組的死亡病例數要低于高風險組,但是總體生存率較短的患者要高于高風險組,最后高、低風險組持平。通過時間依賴性ROC曲線評估風險評分的預測性能,曲線下面積(AUC)在1年時為0.777,在2年時為0.752,在3年時為0.758,整體呈現一個下降趨勢,但在2年和3年的時候趨于平穩(圖5)。結果顯示,LINC01857等9個lncRNA基因構建的風險模型中高低風險組患者的預后存在統計學差異。

圖3 多因素Cox回歸及熱圖分析篩選結直腸癌中的lncRNA相關基因

圖4 高低風險組的生存曲線分析

圖5 ROC曲線分析圖

2.2 結直腸癌關鍵lncRNA基因的風險評分模型的獨立預后價值

評估預后風險評分模型能否成為獨立預后預測因子,在單因素Cox回歸分析中發現發現分期(stage)與結直腸癌患者的預后風險顯著相關(P<0.001)(圖4),在多因素Cox回歸分析中發現,年齡和分期(stage)與結直腸癌患者的預后風險顯著相關(P<0.001)(圖 4),單因素Cox分析中HR值(風險評分)為1.099,95%的置信區間范圍為從1.075到1.123(圖6a),多因素Cox回歸分析中HR值(風險評分)為1.097,95%的置信區間范圍為從1.072到1.123(圖6b),因此,風險評分應該能夠成為評估結直腸癌患者的獨立預后因素。

(a) 單因素獨立預后分析森林圖

(b) 多因素獨立預后分析森林圖

進一步使用GSEA中的Hallmarker探究12個lncRNA基因可能的作用機制,在高風險組,這些lncRNA基因在肥厚性心肌病(Hypertrophic Cardiomyopathy,HCM)信號通路中顯著富集(圖7a);在低風險組,這些lncRNA基因在檸檬酸循環(Citrate cycle)信號通路中顯著富集(圖7b)。

(a) lncRNA基因高風險組的作用機制預測圖 (b) lncRNA基因低風險組的作用機制預測圖

2.3 結直腸癌鐵死亡代謝和lncRNA基因的關系網絡互作

利用STRING數據庫生成12個lncRNA基因(綠色)與鐵死亡代謝基因(紅色)的蛋白網絡互作圖(圖8),發現lncRNA基因中AL137783.1和AP001160.4起關鍵的調控作用,與鐵死亡代謝的大多數DEGs密切相關,但LINC01857比較特殊,僅與鐵死亡代謝CDO1密切相關?？傊伟┲械蔫F死亡代謝和lncRNA基因兩者的關系密切。

圖8 鐵死亡代謝和lncRNA基因的關系網絡互作圖

3 討論

目前已有關于結直腸癌預后基因篩查的文獻,但本研究使用分析方法不同,本研究中,通過生物信息學方法對TCGA數據庫中結直腸癌的mRNA表達譜數據和臨床數據進行篩選整合分析,共鑒定篩選到結直腸癌鐵死亡代謝相關68個的DEGs,其中上調表達的有42個DEGs,下調表達的有26個DEGs,GO分析發現這些DEGs主要參與氧化應激反應等生物過程,參與黑色素體等細胞組分的構建,參與陰離子跨膜轉運蛋白活性、鐵離子結合、抗氧化活性、和氨基酸跨膜轉運蛋白活性等分子功能,KEGG的分析結果與GO分析結果一致,DEGs主要富集到癌癥中的MicroRNA、鐵死亡、谷胱甘肽代謝、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝等氨基酸代謝途徑。

進一步通過生物信息學分析與結直腸癌患者預后相關的lncRNA基因,根據單因素CoX回歸分析初步確定了36個lncRNA基因,進一步利用多因素CoX回歸分析確定了12個關鍵的lncRNA基因。進一步使用GSEA中的Hallmarker探究12個lncRNA基因可能的作用機制,發現在高風險組,這些lncRNA基因在肥厚性心肌病信號通路中顯著富集;在低風險組,這些lncRNA基因在檸檬酸循環信號通路中顯著富集;因此推斷結直腸癌與肥厚性心肌病的發病機理有一定的相似之處。

在結直腸癌鐵死亡代謝和lncRNA基因的關系網絡互作分析中發現lncRNA基因中AL137783.1和AP001160.4起關鍵的調控作用,其中AL137783.1和AP001160.4均是核糖體蛋白的lncRNA基因,但關于AL137783.1和AP001160.4參與癌癥的預后不良的調控未見報道,可以作為結直腸癌患者新的診斷、治療和預后提供新的核心lncRNA基因。已有研究發現lncRNA基因LINC01857在乳腺癌中表達水平升高,并可能發揮類癌基因作用[15];LINC01857在胰腺癌中表達水平升高,并可能作為診斷胰腺癌的潛在生物標志物[16];LINC01857通過調節miR-1281/TRIM65軸促進神經膠質瘤的生長、遷移和侵襲[17];LINC01857通過調節miR-200b促進胃癌的發展[18];干擾LINC01857表達可降低宮頸癌細胞增殖、遷移及侵襲能力[19];研究發現血清中半胱氨酸雙加氧酶-1(CDO1)基因啟動子甲基化與多種腫瘤的發生密切相關,特別是肝癌、肺癌、膠質瘤和膽囊癌等[20-24]。本研究發現結直腸癌中LINC01857基因和鐵死亡代謝CDO1基因互作,且與結直腸癌的預后密切相關,可以作為診斷結直腸癌的潛在生物標志物。