清解化攻方調控NLRP3/TLR4/NF-κB信號通路對重癥急性胰腺炎小鼠模型胰腺組織的保護作用

馮敏超， 秦百君， 羅 芳， 李 凱， 王 寧， 陳國忠， 唐曦平

1 廣西中醫藥大學第一臨床醫學院， 南寧 530000

2 廣西中醫藥大學第一附屬醫院消化內科， 南寧 530023

3 廣西醫科大學附屬腫瘤醫院內鏡中心， 南寧 530021

急性胰腺炎（acute pancreatitis，AP）是一種與胰腺組織損傷、水腫和壞死有關的炎癥性疾病。隨著時間的推移，全球AP的發病率不斷上升，中國的發病率為27/10萬，發達國家則高達每34/10萬［1］。AP引發炎癥介質和細胞因子的釋放，可加劇全身炎癥反應和多器官功能障礙，最終導致潛在的致命后果，臨床中20%～30%患者進展為重癥急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP），病死率達30%［2］。目前SAP的臨床治療方式包括補液療法、抗生素和抑制劑、引流感染及手術干預［3］。然而，最近研究［4］表明，早期積極的液體復蘇有較高的液體超負荷概率，預防性抗生素治療的臨床療效不佳。因此，迫切需要可靠和有效的補充與替代療法來治療SAP。中醫治療與SAP類似的疾病有數千年歷史，《中國急性胰腺炎診治指南（2021）》明確指出中醫可以有效改善胰腺的病理狀態。

清解化攻方在廣西中醫藥大學第一附屬醫院已被廣泛用于治療SAP，并獲得國家發明專利（批號：ZL201811021893.2）。在筆者的臨床研究［5-6］中，初步觀察到清解化攻方具有較強的抗炎作用，能促進AP患者淀粉酶、脂肪酶的降低，并能減少并發癥的發生。在機制研究方面，筆者前期研究［7-9］證明清解化攻方可抑制細胞凋亡和炎癥反應，有效地改善胰腺損傷，降低壞死程度，可能是通過Toll樣受體（TLR）、TNF-α/NF-κB等經典通路實現。然而，清解化攻方治療SAP 的詳細機制尚不清楚。研究［10］表明，TLR4/NF-κB 信號通路調控多種炎癥介質和細胞因子的表達，從而激活NOD 樣受體蛋白3（NODlike receptor protein3，NLRP3）途徑釋放一系列炎癥介質再度激活TLR4/NF-κB 信號通路來放大炎癥級聯反應。因此，本研究采用逆行胰膽管注射?；悄懰徕c構建了SAP 小鼠模型，以探索清解化攻方調控NLRP3/TLR4/NF-κB信號通路對胰腺組織的保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF 級C57BL/6J 雄性小鼠36 只，8 周齡，體質量20～25 g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，實驗動物生產許可證號：SCXK（湘）2019-0004。飼養于廣西中醫藥大學第一附屬醫院醫學分子生物學實驗中心實驗室，實驗動物使用許可證號：SYXK（桂）2019-0001。小鼠在24～26 ℃、12 h 光照晝夜循環的室內環境中，適應性喂養1周后進行實驗。

1.2 實驗藥材 柴胡（批號：17010267），黃芩（批號：16182144），厚樸（批號：16060431），丹參（批號：16060117），大黃（批號：16060431），枳實（批號：16080375），甘草（批號：17010163）。由廣西仙竹中藥科技有限公司提供，并經廣西中醫藥大學中藥鑒定技術中心鑒定為正品。

1.3 藥品與試劑 ?；悄懰徕c（美國Sigma公司，批號：S0900000）；蘇木精和伊紅（HE）染色試劑盒（北京索萊寶公司，批號：G1120）；通用二步法試劑盒、DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋公司，批號：PV-9000、ZLI-9018）；逆轉錄試劑盒（北京全式金生物技術股份有限公司，批號：AE301-02）；脂肪酶、α-淀粉酶、IL-18 ELISA 試劑盒（美國CUSABIO 公司，批號：CSB-E16930m、CSB-EL001689MO、CSB-E04609m）；IL-1β、IL-6 和TNF-α ELISA 試劑盒（武漢三鷹生物技術有限公司，批號：KE10003、KE10007、KE10002）；IL-8 ELISA 試劑盒（上海愛必信公司，批號：abs520017）；RIPA 裂解液（上海碧云天公司，批號：P0013）。NLRP3 抗體、NF-κB 抗體、TLR4 抗體、IL-1β 抗體、IL-6 抗體、GAPDH 內參（武漢賽維爾公司，批號：GB114320、GB11997、GB11519、GB11113、GB11117、GB11002）；注射用烏司他?。◤V東天普生化藥業公司，批號：032005103）。

1.4 儀器設備 高速離心機、PCR 儀（珠海黑馬公司，型號：TGL-16R、GeneAmp PCR System 2400）；酶標儀［賽默飛世爾（上海）儀器有限公司，序列號：3530910449］；組織切片機（德國Leica 公司，型號：RM2016）；電泳儀（北京百晶生物技術有限公司，型號：BG-Power 600i）；垂直電泳槽（上海天能科技有限公司，型號：VE180）；光學顯微鏡（日本Olympus公司，型號：BX43）。

1.5 實驗方法

1.5.1 清解化攻方的制備 清解化攻方含有7 種中藥材，即柴胡12 g，黃芩10 g，厚樸8 g，丹參9 g，大黃6 g，枳實10 g，甘草5 g。按照中醫煎藥的方法制備清解化攻方：（1）加入600 mL蒸餾水浸泡30 min，大火煮沸后再小火煮沸30 min，濾出藥液，保留藥渣；（2）加入300 mL 蒸餾水，再次煎煮0.5 h；（3）將兩次煎煮的藥液混合，過濾后用旋轉蒸發儀濃縮，制備1 g/mL的原藥溶液（100%濃度）。

1.5.2 動物造模及干預分組 按隨機數字表法，小鼠被分為以下6 組：正常組，模型組，清解化攻方低、中、高劑量組和西藥組（每組6只）。SAP模型建立方法參考相關文獻［11］。根據小鼠和人類體表面積的換算，清解化攻方低、中、高劑量組分別用1、2、4 g/kg的清解化攻方灌胃7 d。西藥組小鼠腹腔注射烏司他?。?×104U/kg）［12］。其余組小鼠用等量生理鹽水處理。藥物干預后，通過吸入3%的異氟醚對小鼠進行麻醉。在無菌條件下，收集血液，分離并儲存在-20 ℃環境中。取出小鼠胰腺組織，用4%多聚甲醛固定或在-80 ℃下冷凍保存。

1.5.3 HE 染色觀察胰腺組織病理變化 取小鼠胰腺組織，用4%多聚甲醛固定并包埋在石蠟中，然后制備切片（厚5 μm）。后用二甲苯和無水乙醇脫蠟和水合，根據試劑制造商說明，使用HE 染色。在光學顯微鏡下觀察SAP小鼠胰腺組織的病理變化。

1.5.4 ELISA法檢測小鼠血清α-淀粉酶、脂肪酶、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-18、TNF-α水平 小鼠眼球取血，血液樣本在室溫下靜置2 h，然后在高速離心機中以3 000 r/min、4 °C下離心15 min。去除血清上層，并根據制造商的說明，使用酶標儀在450 nm處測量α-淀粉酶、脂肪酶、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-18、TNF-α的光密度值（OD值），繪制樣品標準曲線并換算濃度。

1.5.5 免疫組化檢測胰腺組織NLRP3、TLR4、NF-κB蛋白表達 取胰腺組織切片、脫蠟、水化，高壓檸檬酸鈉溶液100 ℃修復，室溫下用10%牛血清白蛋白封閉30 min，加入NLRP3（1∶100）、TLR4（1∶100）、NF-κB（1∶100）一抗孵育4 ℃過夜，二抗孵育20 min，PBS溶液洗滌3次后，用蘇木精復染，封片后，在400倍放大率的光學顯微鏡下觀察胰腺組織切片。ImageJ Toolbox 軟件對陽性結果進行半定量分析。

1.5.6 RT-qPCR 法檢測胰腺組織NLRP3、TLR4、NF-κB mRNA 表達 按照說明書，使用TRIzol 試劑從每組小鼠胰腺組織中提取總RNA。根據操作說明，使用逆轉錄試劑盒生成cDNA。反應條件如下：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性40個循環15 s，60 ℃退火延伸34 s。使用2-ΔΔCt方法計算相對基因表達水平（GAPDH 作為參考基因）。引物由廣州德威佳生物科技有限公司合成，詳細信息見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.5.7 Western Blot 法檢測NLRP3、TLR4、NF-κB、IL-1β、IL-6 蛋白表達 RIPA 緩沖液提取小鼠胰腺組織總蛋白，BCA試劑盒檢測蛋白濃度，電泳分離蛋白質后，轉移到聚偏氟乙烯膜上，用5%的脫脂牛奶溶液封閉1 h，NLRP3、TLR4、NF-κB、IL-1β、IL-6（1∶1 000）一抗孵育（4 ℃過夜），二抗室溫孵育1 h，采用ECL 試劑盒對條帶進行顯影，用AIWBwellTM軟件分析條帶的灰度值。

1.6 統計學方法 使用SPSS 25.0 和GraphPad Prism 9.0軟件進行統計分析。計量資料以±s表示，多組間比較采用方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 清解化攻方對小鼠胰腺組織病理變化的影響HE 染色結果顯示，與空白組相比，SAP 模型組胰腺組織結構的彌漫性破壞、胰腺小葉間隔的局灶性擴張、腺泡萎縮和炎癥細胞浸潤更多。此外，西藥組與清解化攻方各劑量組處理的SAP 模型小鼠胰腺組織更緊密、完整，胰腺腺泡細胞排列有序，炎癥細胞浸潤和水腫較少，胰腺小葉出血灶較少，清解化攻方中劑量組改善情況稍優于其他劑量組（圖1）。

圖1 各組小鼠胰腺組織的病理變化（HE染色，×200）Figure 1 Pathological changes of the pancreatic tissue of mice in each group（HE，×200）

2.2 清解化攻方對小鼠血清α-淀粉酶、脂肪酶、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-18、TNF-α的影響 各組小鼠血清炎癥因子表達水平詳見表2。與空白組比較，SAP 模型組α-淀粉酶、脂肪酶、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-18、TNF-α 的含量均升高（P值均＜0.05）；與SAP 模型組比較，清解化攻方各劑量處理組不同程度地降低了α-淀粉酶、脂肪酶、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-18、TNF-α 的表達（P值均＜0.05），其中清解化攻方中劑量組的抑制效果最顯著；西藥組的抑制效果與清解化攻方中劑量組相仿。

表2 各組小鼠血清炎癥因子表達水平比較Table 2 Expression levels of serum inflammatory factors in different groups of mice

2.3 清解化攻方對小鼠胰腺組織NLRP3、TLR4、NF-κB蛋白表達的影響 經免疫組化染色后，光鏡下顯示胰腺組織中NLRP3、TLR4、NF-κB蛋白陽性表達為大量棕黃色的顆粒。與空白組相比，SAP 模型組的NLRP3、TLR4、NF-κB蛋白表達更高（P值均＜0.05）；與SAP模型組相比，清解化攻方和西藥治療組均抑制NLRP3、TLR4、NF-κB蛋白的表達（P值均＜0.05），西藥組胰腺組織NLRP3蛋白表達水平較清解化攻方中劑量組有降低趨勢，但差異無統計學意義（P＞0.05），清解化攻方中劑量組對TLR4、NF-κB蛋白表達的抑制作用比西藥組稍強（P值均＜0.05）；在清解化攻方各劑量組中，中劑量組比低、高劑量組降低NLRP3、TLR4、NF-κB 蛋白表達的效果更明顯（P值均＜0.05）（圖2，表3）。

圖2 各組小鼠NLRP3、TLR4、NF-κB蛋白表達水平 （免疫組化染色，×400）Figure 2 NLRP3， TLR4， and NF-κB protein expression in each group of mice （immunohistochemistry， ×400）

表3 各組小鼠胰腺組織中NLRP3、TLR4、NF-κB蛋白表達平均光密度Table 3 Average optical density of NLRP3， TLR4， and NF-κB protein expression in the pancreatic tissue of mice in each group

2.4 清解化攻方對小鼠胰腺組織NLRP3、TLR4、NF-κB mRNA的影響 與空白組相比，SAP模型組NLRP3、TLR4、NF-κB mRNA 的表達均明顯上調（P值均＜0.05）；與SAP模型組比較，清解化攻方各劑量組和西藥組NLRP3、TLR4、NF-κB mRNA 均有不同程度的降低（P值均＜0.05），其中清解化攻方中劑量組與西藥組發揮的抑制效果類似（P＞0.05）；清解化攻方各劑量組對比，低劑量組與高劑量組對NLRP3、NF-κB mRNA 的抑制效果一致，而中劑量組降低NLRP3、TLR4、NF-κB mRNA 表達的效果最明顯（P值均＜0.05）（表4）。

表4 各組小鼠NLRP3、TLR4、NF-κB mRNA表達情況比較Table 4 Expression of NLRP3， TLR4 and NF-κB mRNA in different groups of mice

2.5 清解化攻方對小鼠胰腺組織NLRP3/TLR4/NF-κB信號通路相關蛋白的影響 胰腺組織NLRP3、TLR4、NF-κB、IL-1β、IL-6 在SAP 模型組表達較空白組升高（P值均＜0.05）；與SAP 模型組比較，清解化攻方各劑量組NLRP3、TLR4、NF-κB、IL-1β、IL-6 表達水平均降低（P值均＜0.05）；清解化攻方各劑量組對比，低劑量組與高劑量組降低NLRP3、NF-κB蛋白表達的效果相近，而中劑量組降低NLRP3、TLR4、NF-κB、IL-1β、IL-6 表達水平最明顯（P值均＜0.05）；西藥組抑制TLR4、NF-κB、IL-1β、IL-6表達的效果與清解化攻方中劑量組一致，兩者差異無統計學意義（P值均＞0.05）；與西藥組比較，清解化攻方中劑量組明顯降低NLRP3表達（P＜0.05）（圖3）。

圖3 各組小鼠NLRP3/TLR4/NF-κB信號通路相關蛋白的表達Figure 3 Expression of NLRP3/TLR4/NF-κB signaling pathway related proteins in each group of mice

3 討論

許多研究表明，SAP 發病機制與炎癥反應、胰酶自身消化、Ca2+失調、線粒體功能障礙等相關，其中促炎細胞因子，如IL-1β、IL-6 和TNF-α 等的釋放程度是影響SAP 病情發展的關鍵，可觸發、擴大和延續SAP 中的炎癥反應［13-15］。促炎與抗炎失衡導致大量炎癥介質浸潤胰腺組織，甚至可能導致患者因多器官功能衰竭而死亡，抑制炎癥級聯反應可降低死亡率。中醫認為SAP 的病機關鍵為“濕、熱、毒、瘀”，并呈動態性變化過程，治以清熱解毒，化濕攻下，活血化瘀。清解化攻方是遵從病機、治則在承氣湯基礎上創立，長期廣泛使用且確有療效的臨床協定處方。清解化攻方由柴胡、黃芩、厚樸、丹參、大黃、枳實、甘草組成，方中以大黃、枳實、厚樸互配為小承氣湯蕩滌腸胃，瀉熱通腑予邪有出路；配柴胡、黃芩疏通少陽氣機，清泄濕熱，輔承氣湯同解少陽、陽明之邪氣蘊結；丹參合大黃，一破一化，精于通暢，推陳致新；柴胡、黃芩、丹參、甘草同用調氣活血止痛，氣血同調；全方共奏清熱解毒，活血化瘀，攻下存陰之功效。據現代研究［16］表明，清解化攻方具有抗炎，改善腸黏膜屏障損傷，降低胰腺及胰周感染率等作用。

在本研究中，逆行胰膽管注射?；悄懰徕c構建了SAP小鼠模型，模型組小鼠胰腺組織病理結構明顯發生變化，血清α-淀粉酶、脂肪酶、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-18、TNF-α處于高表達水平。在清解化攻方處理后明顯減輕炎性介質釋放入血并抑制了炎癥級聯反應，有效改善了胰腺組織損傷。這些結果表明清解化攻方具有保護胰腺組織和抗炎的作用，與前期研究結果一致。據報道［17-18］，NLRP3作為NOD 樣受體家族成員，在SAP 促炎與抗炎平衡過程中起關鍵媒介，抑制NLRP3的激活，能降低小鼠胰腺組織中性粒細胞浸潤，可能是SAP 的潛在治療靶點。TLR4/NF-κB的激活先前被證明是誘導NLRP3表達的傳統起始信號之一，但最近研究［19］表明NLRP3 炎癥小體激活釋放IL-1β、IL-6、IL-18等細胞因子可導致TLR4/NF-κB 信號通路再度激活，促進炎癥因子瀑布式的釋放或誘發細胞炎性程序性死亡-細胞焦亡。研究［20］表明，TLR4廣泛分布在胰腺組織中，與炎癥造成胰腺組織損傷有關，TLR4通過外部信號的級聯擴增來介導NF-κB激活。NF-κB是一種促炎轉錄因子，活化的NF-κB從細胞質進入細胞核，并啟動促炎基因的轉錄和表達，如TNF-α、IL-6，激活或放大炎癥反應［21］。在本研究中，模型組小鼠胰腺組織的NLRP3/TLR4/NFκB處于激活狀態，說明SAP的發生可能與NLRP3/TLR4/NF-κB 的激活有關，而清解化攻方治療組與之相反，可一定程度降低NLRP3、TLR4、NF-κB、IL-1β、IL-6的表達，減輕炎癥反應，尤以清解化攻方中劑量組效果最明顯，故后續實驗可采用此劑量作為中藥治療組的干預劑量。此外，在一定的劑量范圍內，清解化攻方各劑量組治療SAP 的效應尚未出現明顯的線性量效關系，未來將深化清解化攻方量效關系的研究，更好服務于臨床應用。

綜上所述，SAP 可能與NLRP3/TLR4/NF-κB 炎癥信號通路的激活有關，清解化攻方能改善SAP 小鼠胰腺組織損傷，抑制炎癥介質的釋放，防止炎癥級聯反應增強，其機制可能是通過抑制NLRP3/TLR4/NF-κB 信號通路發揮作用，本實驗為清解化攻方在炎癥級聯反應方面提供了重要的實驗基礎。令人遺憾的是，本實驗沒有涉及NLRP3/TLR4/NF-κB 與細胞焦亡的相互作用，此外，亦沒有探索與SAP 相關的肺損傷，有待開展進一步相關研究。

倫理學聲明：本研究方案于2022 年1 月23 日經由廣西中醫藥大學實驗動物福利倫理委員會審批，批號：DW20220310-020，符合實驗室動物管理與使用準則。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻聲明：馮敏超、羅芳負責設計論文框架，起草論文；秦百君、王寧負責實驗操作和研究過程的實施；李凱負責數據收集，統計學分析，繪制圖表；唐曦平負責論文修改；陳國忠負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。