高效液相色譜測定青金桔中19種酚類物質方法的研究

劉帥光,張紅建,馬澤威,王青松,吳 豪,鄭聯合

海南省糧油科學研究所 (瓊海 571400)

酚類是一種廣泛存在于果蔬中的功能活性物質,主要包括酚酸和類黃酮。柑橘中含有諸如橙皮苷、根皮素、柚皮苷、山奈酚等多種酚類物質[1],具有抗氧化、消炎、抗癌、降血脂、腸道保護、心血管保護等生理作用[2-6],因此,天然柑橘多酚類展現出了作為食品添加劑和功能性食品強化劑的巨大潛力,相關研究已被廣泛報道并為大眾所接受。

青金桔是一種蕓香科柑橘族金柑屬作物,主要分布于我國海南、臺灣兩省及越南、馬來西亞等東南亞地區[7,8],其口感酸爽、香味清新而備受當地消費者歡迎。青金桔果實中富含芹菜素、牡荊苷、橙皮苷、對香豆素等多種功能活性成分[9,10],海南省年產量可達20萬t左右,但開發利用率低,缺乏精深加工產品。目前青金桔相關基礎研究較少,其中多酚類化合物組成、定量研究更是鮮有報道。因此,探究青金桔果實中多酚的含量及組成對于青金桔的開發及高值加工利用具有一定的指導意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青金桔,購自海南省瓊海市嘉積鎮中心市場;地奧司明、橙皮苷、柚皮苷、柚皮素、川陳皮素、桔皮素、新西蘭牡荊苷、圣草次苷、綠原酸、7-羥基香豆素、龍膽酸、檸檬苦素、沒食子酸,均為分析標準品,HPLC≥98%,上海源葉生物科技有限公司;根皮素-3′,5′-二-C-β-葡萄糖苷、金柑苷、牡荊素-2″-O-鼠李糖苷、Isomargaritene、Margaritene,均為分析標準品,HPLC≥98%,武漢天植生物技術有限公司;根皮苷,分析標準品,HPLC≥98%,阿拉丁試劑有限公司;乙腈、甲醇,色譜純,德國CNW公司;甲酸,色譜純,上海麥克林生化科技有限公司;二甲基亞砜,色譜純,上海阿拉丁試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

XPR105型十萬分之一電子天平,Mettler Toledo公司;LGJ-10NS/GC型冷凍干燥機,北京亞星儀科科技發展有限公司;UltiMate 3000型高效液相色譜儀(配備賽默飛DAD檢測器),美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1樣品制備

青金桔樣品前處理:新鮮青金桔全果洗凈晾干后分離出果皮、果肉、果汁。將果皮、果肉冷凍干燥后研磨成均勻粉狀,取果皮、果肉凍干粉0.2 g準確加入10 mL 70%甲醇水溶液,混合均勻后于360 W、50 ℃條件下超聲提取30 min,提取液于5 000 r/min條件下離心10 min,取上清液過0.22 μm濾膜,4 ℃貯存備用。果汁于5 000 r/min條件下離心10 min,取上清液過0.22 μm濾膜,4 ℃貯存備用。樣品稀釋至適當濃度后進行測定。

1.3.2高效液相色譜條件

經過前期實驗調整并參考Russo[11]等人方法略作改動,確定高效液相色譜分離條件如下:流動相A為乙腈∶甲酸(99.9∶0.1,v/v),流動相B為水∶甲酸(99.9∶0.1,v/v);柱溫30 ℃;進樣量10 μL;波長210 nm。梯度洗脫程序:0 min:5%A;40 min:25%A;60 min:100%A;70 min:100%A;73 min:5%A;80 min:5%A。

1.3.3標準曲線的建立

將1.1材料與試劑中19種標準物質利用甲醇-二甲基亞砜溶液,梯度配置成質量濃度范圍為0.2～200 μg/mL的混合標準溶液。在1.3.2條件下進樣測定,以標準物質質量濃度為橫坐標,以峰面積為縱坐標繪制標準曲線及線性回歸方程。

1.3.4方法學考察

1.3.4.1 檢出限及定量限

取配置的混合標準溶液,逐級進行梯度稀釋并按照1.3.2條件測定,以3倍信噪比(S/N)確定檢出限濃度,以10倍信噪比確定定量限濃度。

精密度:取同一濃度混合標準溶液,按照1.3.2方法連續進樣測定6次(n=6),計算19種多酚物質的含量及保留時間的計算相對標準偏差(relative standard deviation,RSD)。

1.3.4.2 回收率實驗

按照1.3.1進行樣品制備時按照5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL的3個濃度加入混合標準溶液,進樣后計算不同濃度下的加標回收率。平行3次測定,并計算RSD。

1.3.4.3 穩定性、重復性實驗

穩定性:取同一待測樣品,與室溫條件下(約25 ℃)避光貯存0、3、6、9、12、24 h后,按照1.3.2方法連續進樣測定,并計算各多酚物質含量的RSD。

重復性:取同一樣品,按照1.3.1平行6次進行樣品制備(n=6),并測定樣品中各多酚含量RSD。

1.3.5數據處理與分析

實驗中所有指標平行3次測定。高效液相色譜結果采用變色龍7.0軟件進行處理,使用SPSS Statistics 23對各組均值進行單因素方差分析和顯著性分析,以P<0.05表示顯著性水平。

2 結果與討論

2.1 混合標準溶液圖譜及線性方程

混合標準溶液高效液相色譜圖如圖1所示,保留時間依次是沒食子酸8.95 min、綠原酸21.15 min、龍膽酸21.78 min、新西蘭牡荊苷26.03 min、牡荊素-2″-O-鼠李糖苷33.97 min、圣草次苷34.49 min、7-羥基香豆素35.42 min、根皮素-3′,5′-二-C-β-葡萄糖苷36.42 min、柚皮苷41.57 min、地奧司明41.95 min、Margaritenen 42.43 min、橙皮苷42.77 min、根皮苷46.17 min、Isomargaritene 46.96 min、金柑苷48.64 min、柚皮素51.69 min、檸檬苦素54.51 min、川陳皮素55.47 min、桔皮素57.09 min。各標準物質目標峰之間分離情況良好,可用于樣品的進一步定性分析。

注:1.沒食子酸;2.綠原酸;3.龍膽酸;4.新西蘭牡荊苷;5.牡荊素-2″-O-鼠李糖苷;6.圣草次苷;7.7-羥基香豆素;8.根皮素-3′,5′-二-C-β-葡萄糖苷;9.柚皮苷;10.地奧司明;11.Margaritenen;12.橙皮苷;13.根皮苷;14.Isomargaritene;15.金柑苷;16.柚皮素;17.檸檬苦素;18.川陳皮素;19.桔皮素。

以各標準物質的質量濃度與峰面積繪制線性方程,結果如表1所示。各標準物質在線性濃度范圍內相關系數在0.993～0.999之間,呈現較好的線性關系,可用于樣品的定量分析。

表1 標準曲線回歸分析

2.2 方法檢出限、定量限與精密度

以3倍信噪比和10倍信噪比確定19種多酚物質的檢出限、定量限如表2所示,檢出限范圍為0.052～2.344 μg/mL,定量限范圍為0.173～7.813 μg/mL。該方法所測定19種多酚保留時間RSD在0.01%～0.32%,峰面積RSD在0.84%～4.74%,檢測精密度良好。

表2 方法檢出限、定量限與精密度

2.3 加標回收率

樣品中5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL這3個濃度的加標回收率濃度如表3所示,19種多酚的平均加標回收率在95.54%～101.64%,RSD在0.11%～4.83%,加標回收效果良好。

表3 樣品加標回收率

2.4 方法穩定性和重復性

本實驗方法穩定和重復性情況分別見表4、表5。樣品在0～24 h內測定結果的穩定性較好,19種多酚物質含量穩定性RSD在0.66%～3.79%。同一樣品6次平行實驗的多酚含量RSD在0.38%～2.22%。

表4 方法穩定性

表5 方法重復性(n=6)

2.5 樣品中多酚含量

青金桔果實中果皮、果肉、果汁中的多酚含量如表6所示。青金桔果皮、果肉、果汁中19種多酚及檸檬苦素化合物含量差異顯著(P<0.05),主要的多酚物質以黃酮類為主,分別為根皮素-3′,5′-二-C-β-葡萄糖苷、橙皮苷、新西蘭牡荊苷、圣草次苷、牡荊素-2″-O-鼠李糖苷。根皮素-3′,5′-二-C-β-葡萄糖苷是青金桔中最為主要的多酚類物質,在果皮、果肉、果汁中的含量分別為3 053.667 mg/100 g、811.671 mg/100 g、288.332 μg/mL,遠高于其他酚類物質。此外,果皮中仍具有較高含量的金柑苷、根皮苷、川陳皮素、桔皮素、Isomargaritene等酚類,而果肉中則相對表現出較低水平。果汁中除根皮素-3′,5′-二-C-β-葡萄糖苷外含有較高的新西蘭牡荊苷(56.665 μg/mL)。

表6 樣品中多酚含量

由表6可知,青金桔果皮中各多酚含量均多于果肉,且多酚種類多于果肉及果汁。沒食子酸在青金桔果皮、果肉、果汁中均未檢出,7-羥基香豆素在果肉中未檢出,根皮苷、Isomargaritene在果肉及果汁中均未檢出。就果皮、果肉、果汁而言,檸檬苦素多集中于果皮之中。

3 結束語

柑橘中大多數酚酸通過形成酯或糖苷鍵與果實中的細胞壁結合[12],大量研究表明柑橘屬植物含有豐富的黃酮苷,如柚皮苷、橙皮苷等,但C-糖苷類化合物卻含量較少且并不常見,本研究中青金桔果皮、果肉、果汁中均含有十分豐富的根皮素-3′,5′-二-C-β-葡萄糖苷(DGPP),并且與Lou等[13]人在相似金桔品種中的DGPP含量的檢測結果相似.。DGPP屬于二氫查爾酮衍生物[14],可以通過競爭性抑制對酪氨酸酶具有良好的抑制效果[15],這展現出其在于美白化妝品方向上的廣闊前景。

此外,青金桔多酚化合物的提取方式上可進一步優化。Yu-M等使用HPLC法測定了Calamondin(加利蒙地亞桔;四季桔)皮的熱水提取物,檢測出了主要類黃酮物質為根皮素-3′,5′-二-C-β-葡萄糖苷(DGPP)、柚皮苷、橙皮苷、川陳皮素和桔皮素[16]。另有研究表明,Calamondin桔皮的熱水提取物(90 ℃)中DGPP含量高于有機溶劑提取物,桔皮提取物的總多酚、總黃酮、酚酸含量高于果肉且具有更好的抗氧化性,這也說明其中多酚化合物多具有親水性[17,18]。高溫提取可增加多酚提取量,但會使DGPP、橙皮苷等部分黃酮產生降解[18]。本研究采用70%甲醇對青金桔果皮、果肉進行提取,后期可對比熱水提取、甲醇-二甲基亞砜提取效果,探求最佳提取方式。

橙皮苷是青金桔含量中僅次于DGPP的多酚黃酮類化合物,具有多種生物活性,如:抗氧化[19]、抗癌[20]、消炎抗潰瘍[21]等。青金桔果皮、果汁中圣草次苷是一種黃烷酮糖苷,主要存在于檸檬、酸橙類水果中,具有抗氧化、抗過敏、抗腫瘤、降血脂等廣泛的生物活性[22]。青金桔果皮中川陳皮素和桔皮素含量顯著高于果肉(P<0.05),川陳皮素和桔皮素屬于多甲氧基黃酮(PMFs),多存在于果皮之中,具有抗氧化、抗癌、調節代謝、神經保護、免疫調節、腸道菌群調節的多種生理活性[23-25]。檸檬苦素是一種三萜類化合物,是柑橘苦味的主要來源之一。由于檸檬苦素獨特的抗腫瘤、抗蟲、抗炎、抗病毒等生理活性而被用于食用或藥用[26]。青金桔的果皮、果肉、果汁中均檢測出含量較為豐富的檸檬苦素,這同時也展現出青金桔具有良好的功能活性價值。

青金桔中多酚含量及種類可能受果實成熟度的影響,Hsu等[27]研究表明未成熟的Calamondin果皮中的總多酚和類黃酮含量高于成熟的,未成熟的果皮提取物抗氧化活性和DPPH自由基清除率(56.9%～64.3%)也遠高于成熟的(35.0%～48.9%)。在青金桔的開發過程中可根據加工要求的不同而選取合適成熟度的果實加以利用。

青金桔中豐富的多酚類化合物尤其是DGPP具有應用于保健食品、藥品和化妝品的巨大潛力,但提取方法、生物活性應用效果及作用機制仍待進一步探索。青金桔皮中多酚化合物含量顯著多余其他部位,因此在青金桔的加工中應注意果皮的利用。此外,本研究中青金桔果皮、果肉、果汁HPLC檢測中均另有幾個峰面積較大的未知峰,而柑橘類果實中較為常見的如:新橙皮苷、蘆丁、橙皮素、阿魏酸等多酚類物質因實驗條件限制未得全部測定,對于未知峰具體成分以及青金桔不同成熟期的多酚化合物成分及含量變化情況也需進一步探討。

本實驗采用高效液相色譜法建立了一套青金桔果皮、果肉、果汁中19種多酚及檸檬苦素的測定方法,在線性濃度范圍內各標準物質線性相關系數在0.993～0.999,檢出限在0.052～2.344 μg/mL,定量限在0.173～7.813 μg/mL,保留時間RSD在0.01%～0.32%,峰面積RSD在0.84%～4.74%,該方法具有良好的線性關系和精密度。各標準物質回收率在95.54%～101.64%,回收率RSD在0.11%～4.83%,回收率良好。24 h內各標準物質含量穩定性RSD在0.66%～3.79%,同一樣品6次平行實驗的多酚含量RSD在0.38%～2.22%,表明該方法穩定性、重復性均符合要求。該方法可用于青金桔樣品中19種多酚及檸檬苦素物質的定性和定量分析。青金桔果皮、果肉、果汁中主要多酚物質為根皮素-3′,5′-二-C-β-葡萄糖苷(DGPP)、橙皮苷、新西蘭牡荊苷、圣草次苷、牡荊素-2″-O-鼠李糖苷,其中DGPP含量尤為豐富。果皮中的19種多酚及檸檬苦素種類及含量顯著高于果肉及果汁。青金桔中豐富的多酚及檸檬苦素具有良好的食用及藥用價值和較大開發利用前景。綜上所述,本研究建立一套青金桔中19種多酚及檸檬苦素的高效液相色譜檢測方法,并首次測定了青金桔中多酚及檸檬苦素的組成及含量,為青金桔進一步開發利用提供基本的理論借鑒和參考。