鼠棒狀桿菌層析免疫檢測方法的建立及應用

余建國 朱樓英

(1.金華職業技術學院 浙江金華 321017；2.金華市實驗動物中心 浙江金華 321007）

鼠棒狀桿菌 （Corynebacterium kutscheri，CK）主要寄生于大小鼠上呼吸道，為動物源性致病菌，常為隱性感染[1]。 臨床上主要表現偽結核癥狀或化膿性炎癥，在鼠免疫功能損傷或抑制、外界環境改變時，可引起急性死亡[2]。

實驗動物國家檢測標準中， 鼠棒狀桿菌是清潔級大鼠、小鼠必須排除的項目[3]。 鼠棒狀桿菌調查診斷方法目前有病原菌分離培養方法、免疫學方法、分子生物學（PCR） 方法。 實驗動物的國家標準（GB/T14922-2011）中規定的檢測方法也是細菌學分離、血清學檢測，操作復雜、耗時長，容易造成漏檢。PCR法雖然靈敏、快速，但儀器設備要求高，檢測成本昂貴，不適合基層規模推廣應用。

單克隆抗體技術的發展及其優越性，在農業、醫學等生物技術領域得到了廣泛的應用。 在鑒定細菌種類方面， 單克隆抗體技術具有的高靈敏性和高特異性是其他方法無法比擬的。 以靈敏且特異度高的單克隆抗體， 構建出可用于臨床快速檢測的免疫層析學方法，對臨床鼠棒狀桿菌篩查具有積極的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 BALB/c 雌性小鼠（6～8 周齡），由金華市實驗動物中心提供；鼠棒狀桿菌純培養菌體，由浙江省實驗動物中心惠贈。

1.1.2 試劑 鼠棒ELISA 試劑盒、 牛血清白蛋白、卵清蛋白等，市售；鼠棒狀桿菌單克隆抗體、鼠棒狀桿菌單抗檢測試紙、 小鼠致敏血清，PBS、CBS 等緩沖液由實驗室制備。

1.2 方法

1.2.1 單抗效價和靈敏度測定 采用間接ELISA法， 測定雜交瘤細胞培養上清誘導小鼠產生的腹水效價， 抗體濃度依次為2×102、4×102、8×102、16×102、32×102、64×102、128×102。 配制濃度分別為200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.563 ng/mL 的CK 菌液懸液，用作靈敏度檢測。

1.2.2 抗體特異性的鑒定 以間接競爭ELISA 法，設定泰澤氏菌（BP）、巴氏桿菌（PMU）、沙門氏菌（SE）、弓形蟲（TO）為參照，檢測單抗與CK 類似物的交叉反應。

2 結 果

2.1 單抗的效價和靈敏度檢測結果 單抗效價檢測結果見表1，第4 次免疫10 d 后，4 只受免鼠均產生了血清學抗體，效價在1.6×103～1.28×104，抗體水平均值非常高。 免疫小鼠血清單抗靈敏度檢測結果見表2。

表1 單抗效價檢測結果

表2 單抗靈敏度檢測結果

2.2 鼠棒單抗（CK-mAb）特異性鑒定 3 號小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞SP2/0 融合后，經過有限稀釋法[4]亞克隆和ELISA 篩選，最后得到1 株能夠穩定分泌抗CK-mAb 的雜交瘤細胞09A2B5， 通過體內誘生腹水法批量制備出抗體。 間接ELISA 測定腹水效價， 細胞上清的效價為1:1 600； 腹水的效價為1.256×105。從特異性試驗結果可知（見表3），單抗與泰澤氏菌（BP）、巴氏桿菌（PMU）、沙門氏菌（SE）、弓形體 （TO） 的交叉反應比例分別為1.47%、0.91%、0.42%、0.06%。

表3 特異性試驗結果

2.3 膠體金-鼠棒狀桿菌抗原結合物的制備

2.3.1 膠體金制備 先將0.1 g/L HAuCl4在煮沸狀態下與10 g/L 檸檬酸三納結合， 后用0.2 mol/L K2CO3調整金溶膠pH 至8.2。之后加入制備的抗原，混勻后經離心處理，將沉淀物復溶于金稀釋液。

2.3.2 膠體金標記抗體制備 取制備的膠體金溶液1 mL， 用0.2 mol/L K2CO3溶液調節膠體金溶液pH至8.5。 加入0.01 mg 抗鼠棒狀桿菌單克隆抗體，輕微震蕩混勻，室溫下靜置1 h。再逐滴加入10%BSA 10 μL， 充分混勻后靜置10 min，4 ℃、12 000 r/min離心15 min。 棄上清，加入含0.1%BSA、0.01% Pro-Clin300 的 0.05 mol/L Tris -HCl 溶液（pH8.5）0.01 mL，使金-抗體復合物重懸，4 ℃保存備用。

2.3.3 試紙條組裝 以純化后的抗體各自作為包被抗體與標記抗體進行相互配對。試紙條由樣品墊、金標結合墊、硝酸纖維素膜、吸水濾紙和不干膠保護層組成。 金標結合墊浸著抗原，37 ℃烘干；硝酸纖維素膜分別用鼠棒狀桿菌抗原（0.01 mol/L PBS 液稀釋）和單克隆抗體包被成檢測線和質控線， 干燥后用含犢牛血清(10 g/L)的PBS 液封閉（37 ℃、30 min）。 于10 mL 金溶膠中加入300 μg 抗體蛋白， 充分攪拌、混勻； 約10 min 后用3%PEG20000 溶液作為穩定劑， 至PEG20000 終含量為0.05%， 再充分攪拌10 min，8 000 r/min 離心。離心后，保留管底疏松的粉紅色沉淀部分（膠體金標記的抗體），取2 mL 標記后的抗體，均勻涂在5 cm×5 cm 玻纖上，置于干燥房內風干，組裝試紙條進行檢測（見圖1）。

圖1 試紙條組裝示意圖

2.4 試紙條性能檢測

2.4.1 試紙條最低檢出限測試 將鼠棒狀桿菌標準菌株復蘇、增菌培養、測定細菌數量后，用PBS 稀釋至濃度為0、10-5、10-6、10-7、10-8CFU/mL， 分別取100 μL 加入至900 μL 抽提液（加入至抽提液后實際菌體濃度相應為0、10-4、10-5、10-6、10-7CFU/mL），反應5～10 min 后使用，并以其對試紙條（隨機選取1-4 號檢測條）最低檢出限進行檢定。 由表4 可知，1-4 號檢測試紙條均能與鼠棒狀桿菌稀釋液發生反應，10-4CFU/mL、10-5CFU/mL 兩個濃度均為陽性，10-7CFU/mL 均為陰性，10-6CFU/mL 菌液濃度75%為陽性， 判定試紙條檢測菌液濃度最低限為106CFU/mL。

表4 試紙條最低檢出限檢測結果

2.4.2 試紙條交叉反應測試 將鼠棒狀桿菌、 大腸桿菌、沙門氏菌標準株增菌培養。 測定細菌數量，均用PBS 稀釋至濃度為10-9CFU/mL， 分別取100 μL加入至900 μL 抽提液 （加入至抽提液后實際菌體濃度相應為10-8CFU/mL），反應5～10 min 后使用，隨機選取5 條檢測試紙， 并以上述菌液對試紙條有無交叉反應進行檢定。 由表5 可知， 試驗選取的5 條試紙均能與鼠棒狀桿菌菌液產生陽性反應。 對照所用大腸桿菌、沙門氏菌與試紙條均無反應，但與陽性對照能產生陽性反應。 表明項目選取的試紙條特異性好，與其他菌株不易產生交叉反應。

表5 試紙條交叉反應試驗結果

2.4.3 臨床應用及示范 在相關實驗動物中心進行鼠棒狀桿菌感染抽樣調查， 用同批次試紙條檢測隨機采集的50 份大鼠血清、50 份小鼠血清， 并以ELISA 法做平行對照。 ELISA 檢測方法按標準方法進行，經包被、洗滌、封閉、顯色；以終止液終止反應后， 調整酶標儀測吸光值A450；S/N≥2.1 判為陽性。以PBS 液將待檢血清按1:5 稀釋； 檢測時從加樣孔滴加2～3 滴待檢血清稀釋液，同時以標準陽性血清和陰性血清設陽性對照和陰性對照；2～5 min 內觀察結果；10 min 后觀察結果無效。 判定標準：檢測區（T 帶）、質控區（C 帶）均出現紅色判為陽性；僅質控區（C 帶）出現紅色判為陰性；T、C 均未出現紅色則試紙無效。 檢測結果見表6。

表6 小鼠、大鼠棒狀桿菌不同方法檢測結果

3 討論與分析

在單克隆抗體制備中， 高效價抗體的獲取相對簡易。 但抗體的特異性會因雜蛋白感染而呈現異常[5]。 本試驗制備的鼠棒狀桿菌單克隆抗體（CKmAb），具有良好的特異性，為構建血清學快速檢測方法（免疫層析檢測法）奠定了堅實的基礎。

本研究在篩選瘤細胞系過程中采用了有限稀釋法，該法的缺點是需要進行多次克隆。 有文獻提示，甲基纖維素半固體培養基法可以較好解決這一問題[6]，在未來的研究中，可以開展試驗探索。

實驗動物的快速檢測技術相對缺乏， 以小鼠棒狀桿菌單克隆抗體為基礎的快速檢測方法的構建，為實驗動物微生物評價和質量控制提供了一條新的途徑。尤其是在病毒測定中，快速檢測可以發揮積極的作用。