301例重度及極重度非綜合征型耳聾患兒耳聾基因結果分析

侯小娟 楊 麗 丁 偉 劉 靜 吳 梅

兒童聽力殘疾多以重度和極重度感音神經性聾居多[1]。耳聾病因中60%以上與遺傳因素有關,在我國人群中耳聾基因變異主要來自于GJB2、SLC26A4、線粒體 12SrRNA及GJB3等4個熱點基因[2]。目前針對新疆維吾爾自治區耳聾基因方面的檢測工作大部分集中在GJB2(35delG、176 _ 191del16、235delC、299_300delAT)、SLC26A4(2168A>G,IVS7-2A>G)、mt12SrRNA(1494C>T,1555A>G)、GJB3(538C>T) 4個基因的9個位點上,而在非綜合征型耳聾患者中這9個突變位點的檢出率在18%左右,大部分非綜合征型耳聾患者無法分析相關的耳聾致病基因,因此有必要增加耳聾基因突變位點的篩查,為更多的患者明確致病基因提供依據[3,4]。

對于重度和極重度耳聾患兒來說,遺傳因素的差異也會影響人工耳蝸植入后的康復療效,尤其在語前聾患者中, 基因突變是致聾的關鍵因素[5,6]。因此本研究將對重度及極重度非綜合征型耳聾患兒的耳聾基因檢測結果進行分析,可以更好的評估術后康復效果,為指導康復提供依據。

資料與方法

1.研究對象:收集2017～2019年在筆者醫院耳鼻喉診療中心就診的重度及極重度非綜合征型耳聾患兒,對所有患者耳聾病史和用藥史等進行詳細詢問并登記,排除耵聹栓塞、外傷、中耳疾病導致的聽力下降以及綜合征型耳聾,最終入選301例患兒。其中男性166例,女性135例,患兒平均年齡4.48±2.58歲。包含漢族51例,維吾爾族224例,哈薩克族20例,回族6例。遵循知情同意原則,收集所有患兒基本信息資料、聽力學結果及耳聾基因檢測結果。本研究通過新疆維吾爾自治區人民醫院醫學倫理學委員會審核通過(倫理學審批號:2017005)。

2.聽力測試方法:所有聽力檢測項目均在隔聲屏蔽室內進行。所有患者在檢測前均采用電耳鏡檢查鼓膜及外耳道,清除外耳道耵聹。嬰幼兒需自然入睡后或根據體重給予10%水合氯醛溶液口服入睡后方可進行聽力學檢測。聲導抗測試采用Titan聽力測試平臺,1歲以上患者采用226Hz探測音,1歲以下采用226Hz和 1000Hz探測音;耳聲發射采用CAPELLA診斷型耳聲發射儀,采用畸變產物耳聲發射(distortion product otoacoustic emission,DPOAE);聽性腦干反應(auditory brainstem response,ABR)采用瑞索Neuro-Audio腦干誘發電位儀,交替短聲刺激速率為21.1次/秒,分析時間為15ms,帶通濾波(50～3000)kHz,疊加1024次,刺激聲選用短聲和短純音(0.5kHz和1.0kHz),重復性佳的V波作為反應閾值。短聲聽性腦干反應(click-ABR)V波反應閾值≤30dBnHL為正常診斷標準。短純音聽性腦干反應(Tb-ABR) V波反應閾值≤40dBnHL為正常診斷標準。若患兒兩耳聽力損失程度不同時,以聽力損失較輕耳來計算。聽力損失分級標準(500、1000、2000、4000Hz平均值):輕度(26～40dBHL),中度(41～60dBHL),重度(61～80dBHL),極重度(≥81dBHL)。

3.耳聾基因檢測:采集非綜合征型耳聾患者的外周靜脈血2ml于EDTA 抗凝管中,利用基因組提取試劑盒從患者全血中提取基因組DNA(內含線粒體DNA);以基因組DNA為模板利用所設計引物進行PCR 擴增、產物純化和sanger測序工作(測序儀為3130DX),根據測序結果進行目標位點多態性的分析。檢測位點包括GJB2:c.35delG、c.167delT、c.176_191del16、c.235delC、c.299_300delAT;SLC26A4:c.281C>T、c.589G>A、c.IVS7-2A>G、c.1174A>T、c.1226 G>A、c.1229C>T、c.IVS15+5G>A、c.1975G>C、c.2027T>A、c.2162C>T、c.2168A>G;mt12S rRNA:c.1494C>T、c.1555A>G、c.1585A>G、c.1047A>G、c.1095T>C、c.960_961insC/961delT;OTOF:c.4023G>A、c.4819C>T;SLC17A8:c.824C>A。

結 果

對301例就診非綜合征型耳聾患兒進行耳聾致病基因檢測,共計篩查出陽性突變患者80例,總檢出率為26.58%(80/301),其中純合突變35例,雜合突變29例,復合雜合突變12例,雙基因雜合突變4例。

GJB2基因總突變率為10.96%(37/301),主要突變形式為c.235delC,占突變人數的37.50%(30/80),其中純合突變占突變人數的20.00%(16/80),攜帶雜合突變占突變人數的17.50%(14/80);其次突變率較高的為c.35delG,占突變人數的8.75%(7/80),其中純合突變占突變人數的5.00%(4/80),攜帶雜合突變占突變人數的3.75%(3/80)SLC26A4基因總突變率為12.62%(38/301),主要突變形式為c.IVS7-2A,占突變人數的26.25%(21/80), 其中純合突變占突變人數的2.50%(2/80),攜帶雜合突變占突變人數的23.75%(19/80)。其次突變率較高的為c.1174 A>T,占突變人數的11.25%(9/80),其中純合突變占突變人數的2.50%(2/80),攜帶雜合突變占突變人數的8.75%(7/80)。

mt12SrRNA基因總突變率為4.32%(13/301)。主要突變形式為c.960_961insC/961delT,占突變人數的7.50%(6/80), 其中純合突變占突變人數的5.00%(4/80),攜帶雜合突變占突變人數的2.50%(2/80)。同時還有c.1555A>G,占突變人數的5.00%(4/80), 其中純合突變占突變人數的3.75%(3/80),攜帶雜合突變占突變人數的1.25%(1/80)。各突變位點在非綜合征型耳聾患者中的檢出情況如表1所示。

表1 301例重度及極重度非綜合征型耳聾患者中耳聾基因突變位點匯總表

4例雙基因雜合突變包括2例c.235delC/c.IVS7-2A>G突變;1例c.IVS7-2A>G/c.2027 T>A/c.960_961insC/961delT突變;1例c.235delC/c.1555A>G突變。1例c.1555A>G純合突變患兒同時攜帶c.1226 G>A和c.2027 T>A雜合突變, 1例c.1585A>G純合突變患兒同時攜帶c.2027 T>A雜合突變,1例c.960_961insC/961delT純合突變患兒同時攜帶c.IVS7-2A>G 雜合突變;1例c.960_961insC/961delT純合突變同時攜帶c.176_191del16雜合突變。未檢測出OTOF中的c.4023G>A、c.4819C>T突變和SLC17A8中的c.824C>A突變。

將GJB2、SLC26A4、線粒體12SrRNA基因中各突變位點在漢族和維吾爾族中的分布情況進行比較,詳見表2,漢族中突變位點的總檢出率極顯著高于維吾爾族(χ2=19.064、P<0.001)。在漢族和維吾爾族中突變頻次最高的是235delC和 IVS7-2A>G位點,235delC位點(χ2=14.824、P<0.001)、IVS7-2A>G位點(χ2=11.225、P=0.003)和2168 A>G位點(P=0.006)在漢族中的分布極顯著高于維吾爾族,兩個民族其他突變位點比較,差異無統計學意義。

表2 各突變位點在漢族和維吾爾族中的檢出情況[n(%)]

討 論

本研究通過對301例重度和極重度非綜合征型耳聾患兒進行耳聾基因篩查,陽性率達26.58%,與前期本地區檢出情況比較檢出比率有所提高,與增加了耳聾基因篩查位點有關[3,4]。其中GJB2、SLC26A4為主要的突變基因,突變率分別為10.96%和12.62%。由于哈薩克族和回族患兒樣本量較少,筆者僅對漢族和維吾爾族患兒檢測結果進行了對比,漢族中突變位點的總檢出率極顯著高于維吾爾族,由于這兩個民族在常見耳聾基因的突變譜中差異很大,維吾爾族中可能存在其他突變熱點,有待后續進一步研究[3]。

GJB2基因編碼縫隙連接蛋白Cx26,并與相鄰細胞的縫隙連接蛋白組成通道,是電解質、第二信使和代謝產物在細胞間轉換的重要通道[7]。該基因的突變,會影響縫隙連接蛋白通道的正常開閉,使K+回流入內淋巴液的循環受阻,導致毛細胞的損傷,從而引起聽力損失,GJB2突變的患者聽力損失程度大多表現為重度或極重度耳聾[8]。GJB2相關性耳聾者的外毛細胞退化,血管紋發育不全,但螺旋神經節細胞的數量正常,因此CI術后能夠獲得滿意聽覺和言語康復效果具有理論基礎以及實踐經驗,故明確的基因突變致聾對重度或極重度耳聾患耳的治療和CI術后康復有重要意義[9,10]。GJB2突變的主要形式為c.235delC和c.35delG。劉海燕等[11]在對天津市重度和極重度非綜合征型聾患兒常見耳聾基因篩查時發現GJB2突變的主要形式為c.235delC和c.299-300deiT,這種差別可能與新疆維吾爾自治區為少數民族聚居區有關。楊曦等[3]研究顯示,新疆維吾爾自治區少數民族c.35delG的突變率較高。

SLC26A4 也是一種常見的遺傳性耳聾基因,與前庭水管綜合征和Pendred 綜合征密切相關[12]。SLC26A4基因的突變會導致其編碼的突變體蛋白不能到達細胞膜,而是停留在細胞內,使氯離子轉運障礙,破壞內淋巴液平衡,引起液體儲留在內淋巴囊以及骨質結構的破壞導致非綜合征型聾[13]。本次研究中SLC26A4突變的主要形式為c.IVS7-2A和c.1174A>T,但以雜合突變的形式居多,需進一步進行SLC26A4測序來明確致病原因。關于SLC26A4 突變與CI 植入術后療效相關性的研究結果也存在差異性[14,15]。后續本研究也將在擴大樣本量的基礎上進行深入研究。

mt12SrRNA基因是引起氨基糖苷類抗生素耳毒性和非綜合征性聾的熱點突變區域[16]。線粒體基因具有母系遺傳特點,對突變攜帶者,指導其母系家庭成員安全用藥,可在一定程度上避免或減緩聾病發生或發展,逐步降低藥物性聾的發生率。mt12SrRNA主要突變形式為c.960_961insC/961delT和c.1555A>G,分別占突變人數的7.50%和5.00%。線粒體12SrRNA c.A1555G 突變在耳聾患者人群中的檢出率有所降低,與耳毒性藥物使用量降低有關。

本研究中就診的患兒平均年齡為4.48±2.58歲,大部分為初次就診,而在嬰幼兒聽力損失診斷與干預指南中要求篩查未通過的嬰兒,應該在出生后3個月內接受全面的聽力學及醫學評估;確診為永久性聽力損失的嬰兒均應該在6個月內盡快接受干預服務[17]。本研究中患者的平均確診年齡與指南中要求有差距,因此提高聽力篩查未通過嬰幼兒的隨訪率、及早對聽力損失患兒進行確診和早期干預是我們新生兒聽力篩查工作中的重點。同時開展耳聾基因篩查可以將患兒聽力診斷時間縮短,更利于早發現、早干預[18]。對于重度及極重度耳聾患兒進行基因檢測還可以更好地評估CI術后康復效果,為指導耳聾治療及康復提供依據。