鐵死亡參與無機砷致人肝星狀細胞活化的研究

迪麗娜爾·亞爾麥麥提 黃 菲 丁關鑫 趙麗君 吳順華

無機砷(inorganic arsenic,iAs)是存在于環境中的Ⅰ類致癌物[1]。據2020年地下水砷污染預測模型估計,目前全球范圍內大約有2200萬人生活在高砷濃度水地區(砷含量>10μg/L),其中94%分布在亞洲[2]。iAs作為一種潛在環境致癌物對機體多器官、多系統產生不可逆的損害,嚴重危害身體健康。其中,肝臟是iAs代謝的主要靶器官。長期攝入iAs通過肝纖維化、肝衰竭和肝硬化最終導致肝臟發生癌變[3]。然而,iAs致肝纖維化的發病機制尚不明確。

近年來研究發現,鐵死亡(ferroptosis)是不同于細胞凋亡、壞死和自噬的由鐵依賴性脂質過氧化物大量聚集引起的新型細胞程序性死亡方式[4]。鐵死亡的典型形態特征是線粒體結構的改變而引起線粒體功能損傷。溶質載體家族7號成員11(solute carrier family number 7member 11,SLC7A11)作為細胞內谷氨酸和細胞外胱氨酸交換的閥門在鐵死亡中起重要作用。SLC7A11被抑制引起胱氨酸攝取減少進而降低細胞谷胱甘肽(glutathione,GSH)含量,導致谷胱甘肽過氧化物酶 4 (glutathione peroxidase 4,GPX4) 的功能受損并導致脂質過氧化引起細胞死亡[5]。越來越多的研究表明,鐵死亡與肝纖維化、癌癥、缺血性再灌注損傷等疾病關系密切[6～8]。但鐵死亡是否參與iAs致肝纖維化的研究鮮有報道。因此,本研究以人肝星狀細胞(LX-2)為觀察對象,探討亞砷酸鈉(NaAsO2)對LX-2細胞鐵死亡水平的影響,繼而從鐵死亡的角度進一步探討iAs致LX-2活化的可能機制。

材料與方法

1.主要試劑與儀器:LX-2細胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司,NaAsO2購自北京化學試劑三廠,高糖培養基DMEM、PBS、胰酶、胎牛血清購自美國Gibco公司,FerroOrange熒光探針和CCK-8檢測試劑盒購自日本同仁試劑公司,丙二醛(malondialdehyde,MDA)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所,BCA蛋白定量試劑盒購自美國Thermo Scientific Fisher公司,α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)購自英國Abcam公司,SLC7A11、GPX4、β-肌動蛋白(β-actin)抗體購自美國Proteintech公司,CO2培養箱購自美國Thermo Scientific Fisher公司,低溫離心機購自美國Sigma 公司,熒光顯微鏡購自德國Leica 公司,多功能酶標儀購自美國Thermo Scientific Fisher公司。

2.實驗分組:分為對照組、5μmol/L NaAsO2組、10μmol/L NaAsO2組和15μmol/L NaAsO2組。

3.細胞培養:在5% CO2和37℃條件下,采用含12%胎牛血清,1%雙抗的DMEM高糖培養基培養細胞。待細胞密度達到80%時,使用0.25%胰酶消化、離心最終收集細胞。按1∶3進行傳代培養。收集處于對數生長期且生長狀態良好的細胞進行后續實驗。

4.CCK-8檢測細胞增殖率:收集對數生長期的LX-2細胞,按5000 個細胞/孔,向96孔板每孔加入100μl細胞懸液,邊緣孔用 PBS填充。在CO2培養箱中孵育。12h后吸棄舊培養基,設NaAsO2不同濃度梯度(0μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L、20μmol/L、30μmol/L、40μmol/L、50μmol/L、60μmol/L),向每孔中100μl不同濃度NaAsO2溶液,同時設立對照組與空白組,繼續培養24h。次日,向每孔加入10μl CCK-8溶液,3h后用酶標儀測吸光度(A)值,并按公式計算細胞增殖率。細胞增殖率(%)=[A(實驗)-A(空白)]/[A(對照)-A(空白)]×100%。

5.透射電子顯微鏡(transmission electron microscopy,TEM)觀察LX-2細胞線粒體:NaAsO2處理LX-2細胞24h后收集細胞,用PBS沖洗3次,再用1mol/L磷酸緩沖戊二醛固定液固定2h。用磷酸鹽緩沖液漂洗3次,加入1%的四氧化鋨固定1.5h。丙酮梯度脫水,環氧丙烷包埋細胞并制作超薄切片。再分別用醋酸鈾、枸櫞酸染色切片,TEM觀察線粒體超微結構。

6.Fe2+檢測:LX-2細胞以1×104個/孔的密度接種于6孔板中,不同濃度NaAsO2干預LX-2細胞24h。次日用HBSS清洗2次,加入1μmol/L的FerroOrange熒光探針,在培養箱培養30min后用熒光顯微鏡觀察細胞熒光強度,用熒光酶標儀檢測胞內Fe2+的熒光強度,實驗獨立重復3次。

7.MDA含量檢測:按試劑盒說明書, 將不同NaAsO2染毒組細胞沉淀中加試劑五提取液0.5ml,混勻2min,將細胞破碎制成懸液,取樣0.1ml于1.5ml離心管中,向空白管、標準管分別加100μl無水乙醇和10nmol/ml標準品,旋渦混勻,95℃金屬浴40min,冷卻后,4000r/min(離心半徑13.5cm)離心10min,吸取0.25ml各管反應液加入到新的96孔板中,530nm測定各孔吸光度,并計算MDA含量,實驗獨立重復3次。MDA含量(nmol/mg protein)=[A(實驗)-A(空白)]/[A(標準)-A(空白)]×C標準/Cpr。

8.蛋白免疫印跡(Western blot)法檢測:收集 NaAsO2處理 24h 的細胞,RIPA 裂解液提取各組細胞總蛋白,通過BCA法進行細胞蛋白定量,對蛋白濃度進行統一化,取同質量蛋白上樣,經 SDS-PAGE 電泳、電轉、封閉、清洗3次、4℃一抗過夜孵育、清洗3次、室溫二抗孵育1h、超敏ECL發光液顯影。使用Image J軟件測量條帶的灰度值,并計算和分析每組蛋白的相對表達量。

結 果

1.NaAsO2對LX-2細胞增殖率的影響:不同濃度NaAsO2染毒液處理LX-2細胞24h,觀察到隨著NaAsO2染毒劑量升高,LX-2細胞增殖率逐漸下降,IC50為21.44 (18.88～24.22)μmol/L,R2=0.91。當60μmol/L NaAsO2干預LX-2細胞時,細胞增殖率為0(圖1)。因此,根據實驗需求取5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L 為后續實驗染毒劑量。

圖1 細胞增殖率曲線

圖2 TEM觀察LX-2細胞線粒體(×30000)

2.TEM觀察LX-2細胞線粒體:通過TEM觀察到,對照組LX-2細胞線粒體結構為雙層膜、光滑閉環且可清楚觀察到線粒體嵴。然而15μmol/L NaAsO2組LX-2細胞線粒體數量減少、線粒體雙層膜破壞、線粒體嵴減少,甚至觀察到線粒體腫大、空泡化線粒體嵴消失現象(圖2)。

3.Fe2+檢測:熒光顯微鏡觀察到不同劑量NaAsO2染毒LX-2 細胞24h后,Fe2+熒光強度隨著NaAsO2劑量的升高而逐漸升高(圖3)。不同劑量NaAsO2處理LX-2細胞組Fe2+水平比較,差異有統計學意義(F=10.77,P<0.05)。與對照組比較,NaAsO2染毒組Fe2+水平均升高(P均<0.05),且10、15μmol/L NaAsO2組Fe2+水平高于5μmol/L組(P均<0.05,圖4)。

圖3 熒光顯微鏡下LX-2細胞 Fe2+檢測結果(×100)

圖4 熒光酶標儀檢測Fe2+熒光強度(n=3)

4.MDA含量檢測:不同劑量NaAsO2處理LX-2細胞組MDA含量比較,差異均有統計學意義(F=7.18,P<0.01)。其中,與對照組比較,NaAsO2處理導致LX-2細胞MDA含量升高,5、15μmol/L NaAsO2處理組MDA含量均高于對照組(P<0.05)。然而10μmol/L NaAsO2組與對照組比較,差異無統計學意義(P>0.05)。此外15μmol/L NaAsO2組MDA含量高于10μmol/L 組(P<0.05,圖5)。

圖5 不同組LX-2細胞MDA含量檢測(n=3)

5.NaAsO2對LX-2細胞α-SMA、SLC7A11、GPX4 蛋白水平的影響:在不同 NaAsO2處理組,纖維化指標α-SMA蛋白表達水平比較,差異有統計學意義(F分別為782.86,P< 0.001)。其中,與對照組比較,5、10、15μmol/L NaAsO2組α-SMA蛋白水平均以劑量依賴方式升高(P<0.05)。此外,不同組間鐵死亡指標SLC7A11和GPX4 蛋白表達水平比較,差異有統計學意義(F分別為274.03、206.83,P均<0.001),其中,5、10、15μmol/L NaAsO2組SLC7A11和GPX4 蛋白表達水平均以劑量依賴方式下調(P<0.05,表1,圖6)。

表1 NaAsO2對LX-2細胞α-SMA、SLC7A11、GPX4 蛋白水平的影響

圖6 Western blot法條帶圖(n=3)

討 論

肝纖維化是由病毒、自身免疫性疾病、藥物或毒性化學物質、代謝性或全身性疾病等多種因素引起的彌漫性疾病[9]。從形態學上看,肝纖維化的特點是細胞外基質(extracellular matrix, ECM)的積聚,隨后形成纖維瘢痕和肝硬化。持續性肝損傷致肝星狀細胞(hepatic stellate cell,HSC)激活,上調α-SMA的表達并產生ECM引起肝纖維化[10]。Tao等[11]研究表明,NaAsO2處理 HSC-T6細胞24h觀察到細胞增殖率以劑量依賴性方式降低,然而α-SMA、TGF-β1表達上調證明HSC被NaAsO2激活。在本研究中用不同濃度NaAsO2干預LX-2細胞24h,發現隨著NaAsO2濃度的升高LX-2細胞增殖率逐漸下降。此外,α-SMA蛋白水平以NaAsO2劑量依賴方式上調。由此可認為,體外NaAsO2干預LX-2活化模型建立成功。

流行病學研究發現,長期飲用含砷水可引起肝纖維化[12]。從iAs毒性研究進展來看,凋亡、氧化應激、甲基化、自噬與砷致纖維化機制相關[13～15]。然而,iAs如何引起LX-2活化及肝纖維化尚不明了。隨著鐵死亡研究的進展,多項研究表明,鐵死亡參與肝纖維化過程。鐵死亡的特點是線粒體結構改變,脂質過氧化物的積累和Fe2+水平升高[16]。本研究中,首先采用TEM觀察到NaAsO2處理LX-2細胞導致線粒體雙層膜完整性破壞、線粒體脊減少,甚至觀察到線粒體腫大和空泡化線粒體脊消失等現象。由此推測,砷可能影響線粒體正常功能,從而導致細胞呼吸受損。研究表明,2.5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L亞砷酸鹽處理小鼠精母細胞時,細胞脂質過氧化產物MDA含量以劑量依賴性方式顯著升高,Fe2+含量也逐漸升高[17]。同樣,本研究結果顯示,與對照組比較,隨著NaAsO2染毒濃度的升高細胞MDA水平逐漸升高。此外,NaAsO2染毒的LX-2細胞內Fe2+水平也顯著升高。因此,iAs致LX-2線粒體損傷而可能引起MDA堆積,Fe2+水平升高,這可能與鐵死亡有關。

鐵死亡作為一種新型調節性細胞死亡方式,氨基酸代謝、鐵離子代謝、脂質過氧化物等多種通路及相關基因共同調控鐵死亡的發生[18]。其中,SLC7A11、GPX4在調控鐵死亡中起到重要作用。SLC7A11將胱氨酸運輸至細胞內并被還原為半胱氨酸合成細胞內主要的抗氧化劑GSH。GSH輔助GPX4還原脂質過氧化物為無毒脂質醇,發揮保護細胞膜結構及功能的作用[19]。研究發現,亞砷酸鹽急劇降低了PC-12 細胞和海馬組織中SLC7A11和GPX4的表達而觸發鐵死亡[20]。因此,暴露于iAs可能破壞胱氨酸/谷氨酸逆向轉運蛋白系統,進而抑制GPX4。GPX4 的消耗可導致脂質自由基的積累,引起細胞鐵死亡。Wei等[21]研究發現,NaAsO2誘導的非酒精性脂肪性肝炎中存在鐵死亡,當NaAsO2刺激肝細胞時可降低GPX4的表達,增加脂質過氧化產物進而引起鐵死亡。本研究結果顯示,與對照組比較,NaAsO2染毒的LX-2細胞SLC7A11和GPX4蛋白水平均隨著iAs劑量的升高而降低。提示NaAsO2處理LX-2細胞可能通過降低SLC7A11、GPX4引起脂質氧化物MDA水平升高而引起鐵死亡。

綜上所述,本研究在NaAsO2致LX-2細胞活化模型中發現,iAs致LX-2細胞線粒體損傷、鐵離子水平升高并促進鐵死亡水平升高。因此,靶向鐵死亡可能成為防治砷致肝纖維化的新方向。然而,本研究檢測指標有限,未檢測改變鐵死亡水平后對纖維化指標的影響。為此,需做大量研究工作來揭示iAs致肝纖維化與鐵死亡的關系。