表面偶極離子親水磁珠固定化異檸檬酸裂解酶及其表征

段昌園， 姜 雪， 曾宏威， 楊曉蘭

（重慶醫科大學檢驗醫學院，重慶 400016）

目前，結核病的發病率雖已下降，但日益增加的耐藥菌，尤其是多藥耐藥（MDR）和超級耐藥（XDR）結核分枝桿菌，給結核病治療帶來了巨大的挑戰[1]。 另外，結核分枝桿菌被巨噬細胞吞噬后，可在巨噬細胞內乏氧和碳源缺乏下進入生長靜止的休眠狀態，在宿主免疫力低下時大量生長，成為繼發性結核的潛在來源。 而現有抗結核藥物對休眠期結核分枝桿菌無作用。

異檸檬酸裂解酶（isocitrate lyase，ICL）是乙醛酸循環的關鍵限速酶[2]，也參與了甲基檸檬酸循環。 乙醛酸循環和甲基檸檬酸循環對以脂肪酸或膽固醇為首選碳源的休眠期結核分枝桿菌的存活至關重要[3-4]，而ICL 催化的乙醛酸循環在宿主細胞中并不存在[5-6]。 有研究表明，MtICL 在乏氧環境的結核分枝桿菌中高表達[7]；敲除MtICL 基因的結核分枝桿菌持留性和毒力降低[8]。 因此，MtICL 是清除休眠期結核分枝桿菌的理想藥物靶點[3]。 早期的ICL 抑制劑結構類似于底物異檸檬酸或產物琥珀酸和乙醛酸，包括衣康酸（itaconic acid，IA）[9]、3-溴丙酮酸（3-bromopyruvic acid，3-BP）[10]、3-硝基丙酸（3-nitropropionic acid，3-NP）[11]。 目前仍未有針對ICL抑制劑類藥物進入臨床[12]。 以MtICL 為靶點的化合物庫[13-14]和天然產物庫[15]通過高通量篩選獲得潛在抑制劑，但抑菌作用不理想；對465 種中藥提取物篩選獲得針對MtICL 的IC50低于0.05 mg/mL 的兩種提取物，但其實際活性成分未知。 故針對天然產物中MtICL 抑制劑結構的發現具有重要意義，但急需有效可靠的方法。

天然產物中活性成分往往含量很低，現有混合物篩選方法包括親和層析、配體捕獲、親和電泳、磁分離篩選，以及熒光偏振和表面等離子共振等[16-18]，但對于篩選天然產物中微量活性成分的作用有限[19]。固定化酶具有穩定性強、重復性好、易于分離等特點，已廣泛應用于天然產物的抑制劑篩選[20-22]。 作者所在課題組前期建立的基于磁珠固定靶蛋白親和迭代篩選方法[23-24]，可望發現復雜混合物中極低含量的有效成分，已初步成功應用于組合合成小庫的高親和力配體發現。 為探索適用于親和富集篩選的磁珠固定化MtICL 靶酶，本研究中選用的兩種親水磁珠MSP-NTA（Ni2+-NTA 磁珠）和MSP-COOH-F1（羧基磁珠），其表面含大量兩性基團，具有親水性，對疏水小分子和蛋白質的非特異結合均較低（見圖1）[25]，比較兩種磁珠固定化MtICL 并優化，以期獲得迭代篩選所需固定化MtICL， 為最終實現天然產物中MtICL 抑制劑的發現打下基礎。

圖1 磁珠固載蛋白質示意圖Fig. 1 Diagram of immobilization of protein on magnetic beads

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

重組質粒6×His-pET28a-ICL委托中美泰和生物技術有限公司構建；大腸桿菌E.coliBL21（DE3）、硫酸卡那霉素、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、咪唑、2-嗎啉乙磺酸（MES）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）：北京鼎國昌盛生物技術有限公司；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉：重慶澤恒生物科技有限公司；鎳離子瓊脂糖凝膠層析介質：GE Healthcare 公司；NADH：北京索萊寶科技有限公司；異檸檬酸：Acros公司；LDH：Sigma 公司；3-嗎啉丙磺酸（MOPS）、IA：Adamas-beta 公司；羧基磁珠（MSP-COOH-F1）、Ni2+-NTA 磁珠（MSP-NTA）：重慶博藍鷹生物技術有限公司；N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）：上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 重組蛋白質的表達純化將攜帶目的基因的重組質粒6×His-pET28a-ICL轉入至感受態細胞E.coliBL21（DE3）中培養，單克隆測序鑒定。 蛋白質表達純化方案參考文獻[26]。 鎳離子瓊脂糖凝膠層析柱純化重組蛋白質。 洗雜液為含有10、40 mmol/L的咪唑緩沖液，洗脫液為含500 mmol/L 的咪唑緩沖液。 用1 mol/L Tris-HCl 緩沖液（pH 7.4），通過Millipore氮氣正壓（0.15~0.20 MPa） 超濾濃縮洗脫3 次至5 mL 左右。 純化產物用Bradford 法測定蛋白質質量濃度，120 g/L SDS-PAGE 分析蛋白質純度。

1.2.2 重組蛋白質的酶學性質表征

1）酶活力測定 參考文獻[26]并適當修改。300 μL 的反應體系中含有50 mmol/L 的MOPS 緩沖液 （含5 mmol/L MgCl2、5 mmol/LL-半胱氨酸、1 mmol/L EDTA，pH 6.8）、2 mmol/L 的異檸檬酸和一定量的純化重組蛋白質， 混勻后于37 ℃孵育20 min，添加2 U LDH 和0.2 mmol/L 的NADH，混勻后在室溫于340 nm 波長下間隔10 s 監測3 min 內的吸光度減少值。 底物NADH 的消光系數為6.22 L/（mmol·cm），按照以下公式計算酶活力[2]。

式中：Ea為酶活力，U/mL；△A為吸光度的減少值；t為反應時間，min；ε 為NADH 的消光系數，L/（mmol·cm）；L為比色皿光徑， 本文中為1 cm；VT為反應總體積，mL；V為測定時樣品所用體積，mL；D為樣品稀釋倍數。

2）最適pH 測定 配制pH 4.0~10.0 的MOPS緩沖液，測定酶活力，并以吸光度的改變速率v表征酶活力。 以pH 和改變速率v作圖，得出最適pH，為后續的磁珠固定和混合物篩選提供最適反應pH。

式中：v為吸光度改變速率，min-1；△A為吸光度減少值；t為反應時間，min。

3）重組蛋白質質量濃度與活性關系 于300 μL的酶反應體系中加入不同終質量濃度的重組蛋白質（0.004~0.040 g/L），以改變速率v和重組蛋白質質量濃度作圖，獲得線性范圍。

4）米氏常數測定 改變底物異檸檬酸終濃度（0.1~1.0 mmol/L），分別測定MtICL 酶活力。 以改變速率v的倒數1/v和底物濃度S的倒數1/S作圖，確定MtICL 對底物異檸檬酸的表觀Km。

5）游離酶對抑制劑3-BP 的響應 配制0~20 mmol/L 的3-BP 母液。 在300 μL 的反應體系中，加入10 μL 的3-BP 和適量游離酶，37 ℃孵育10 min后加入底物再次孵育20 min， 后續步驟同1.2.2 中的酶活力測定。以3-BP 對MtICL 的抑制率和3-BP的終濃度對數值作圖，用軟件Origin 2018 擬合抑制率與3-BP 終濃度對數值響應曲線，并計算3-BP 對游離酶的IC50。

1.2.3 重組蛋白質MSP-NTA 固定及表征取MSP-NTA 懸液（100 g/L），磁力去上清液，用固定緩沖液 （20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.4） 洗滌3 次后重懸至7 g/L。將不同質量重組蛋白質用固定緩沖液重懸至40 μL，緩慢滴入10 μL 的磁珠懸液，加完后立即溫和混勻以免團聚； 于冰上以200 r/min 速率固定30 min，期間每隔8~10 min 顛倒混勻一次；磁分離保留上清液，磁珠用固定緩沖液洗滌3 次后再次重懸至7 g/L，冰上保存備用。 重組蛋白質加入質量與上清液中重組蛋白質質量相減可得磁珠固載量（n=3），并通過最高固載量求得磁珠表觀固載量。

式中：C為MSP-NTA 的表觀固載量；m1為最高固載量，mg；m0為磁珠加入量，g。

1）MSP-NTA 固定化酶酶活力表征 300 μL 反應體系中加入70 μg 磁珠固定化酶，與底物在37 ℃孵育20 min，磁分離取上清液測酶活力，根據實際固定化酶量求得磁珠固定化酶表觀保留比活，同時與未加磁珠的等量游離酶比活相比求得磁珠固定化酶的相對表觀保留比活。

2）金屬離子對游離酶酶活力的影響 100 μL的酶反應緩沖液中加入不同終濃度的Ni2+、Fe3+（0~20 nmol/L）和一定量的MtICL，于冰水浴中混合振搖30 min 后，取1/10 加入300 μL 的酶反應體系中，后續步驟同1.2.2 中的酶活力測定。

1.2.4 重組蛋白質MSP-COOH-F1固定及表征取MSP-COOH-F1 懸液（20 g/L）， 用pH 6.0 的20 mmol/L 的MES 緩沖液洗滌3 次，磁力去上清液，加入EDC、NHS（25 g/L，溶于pH 6.0 的20 mmol/L 的MES 緩沖液）各100 μL，室溫持續混合振搖30 min。 磁力去上清液，加入預冷至0 ℃的pH 7.4、20 mmol/L 的MES 緩沖液重懸至6 g/L。重組蛋白質用pH 7.4、20 mmol/L 的MES 緩沖液重懸至100 μL，振蕩的情況下將100 μL 磁珠懸液緩慢滴入重組蛋白質溶液中，冰上混合反應30 min。 磁分離保留上清液，磁珠用pH 7.4、20 mmol/L 的MES 緩沖液洗滌3 次并重懸至12 g/L，0 ℃保存備用。 固載量及表觀保留比活測定同1.2.3，并與MSP-NTA 的固載量和表觀保留比活比較。

重組蛋白質MSP-COOH-F1 固定化前后對抑制劑IA 的響應：300 μL 的反應體系中，加入不同終濃度的IA（10.0~170.0 μmol/L）和適量磁珠固定化酶或游離酶，37 ℃孵育10 min， 后續步驟包括數據處理同1.2.2 中的游離酶對3-BP 抑制劑的響應。

1.2.5 游離MtICL 和磁珠固定化MtICL 的穩定性將游離酶用MOPS 緩沖液稀釋10 倍， 兩種磁珠固定化酶分別于25 ℃室溫和0 ℃冰水浴中靜置保存，每隔一段時間測其吸光度改變速率v，以改變速率v和時間作圖，考察游離酶和兩種磁珠固定化酶在不同溫度下的穩定性。

1.3 數據處理

每個實驗重復3 次，使用軟件Origin 2018 處理數據，結果以平均值±標準差表示。 統計學分析采用軟件SPSS 25.0，固定化酶前后的IC50采用配對樣本T檢驗分析，P<0.05 為具有統計學差異。

2 結果與分析

2.1 重組蛋白質的表達和純化

重組質粒6×His-pET28a-ICL轉化后單克隆菌經測序比對發現， 與GenBank 中結核分枝桿菌（H37Rv）堿基序列Rv0467 一致，對應氨基酸序列同源性達100%。MtICL 表達純化后，在相對分子質量50 000 處有一條明顯的目標蛋白質條帶 （見圖2），純度較高，滿足磁珠固定化要求。 純化蛋白質總收率約為50 mg/L（以LB 培養基體積計）。

圖2 MtICL 的表達Fig. 2 Expression of MtICL

2.2 重組蛋白質的酶學性質表征

異檸檬酸裂解酶可催化異檸檬酸生成琥珀酸和乙醛酸，而乙醛酸在LDH 和NADH 的作用下，還原生成甘醇酸酯， 通過實時監測NADH 在340 nm處吸光度（A）的減少，取線性范圍內吸光度變化速率，按底物（NADH）消光系數確定酶活力。按照方法1.2.2 中測定MtICL 酶活力，并計算MtICL 的比活為（350.0±10.0） mmol/（min·g）。

MtICL 在pH 4.0~10.0 的MOPS 緩沖液中測定其最適pH（見圖3），發現其在pH 7.4 時活性最高（以吸光度的改變速率v來間接表征酶活力的變化趨勢）。 故后續磁珠固定和混合物篩選緩沖液采用pH 7.4。

圖3 MtICL 酶活力的pH 效應Fig. 3 Effect of pH on enzymatic activity of MtICL

在一定酶質量濃度范圍內，測得的酶改變速率與加入的酶質量濃度成正比，在0.004~0.040 g/L 呈線性響應（見圖4）。 根據雙倒數作圖法求得底物異檸檬酸的表觀Km為（0.56±0.02） mmol/L（見圖5）。

圖4 MtICL 改變速率對酶質量濃度響應Fig. 4 Response of reaction rate to concentration of MtICL

圖5 MtICL 對異檸檬酸的表觀KmFig. 5 Apparent Km of MtICL to isocitrate

2.3 MSP-NTA 固定MtICL 及表征

MSP-NTA 加入量為70 μg，當重組蛋白質加入量從5 μg 增加到35 μg 時，固載量逐步增加并達到平衡（見圖6）。在重組蛋白質加入量為25 μg 時，固載量達到飽和，最高固載量約為9.3 μg，由此可得MSP-NTA 磁珠表觀固載量為（132.8±3.9） mg/g（以磁珠質量計，n=3）。 固定化酶的相對表觀保留比活在重組蛋白質加入量為5~20 μg 時僅約20%，當重組蛋白質加入量增加到25 μg 時， 酶活力顯著下降。 在重組蛋白質加入量為10 μg 時達到最高表觀保留比活，為游離酶的23%，此時的表觀固載量為（40.4±1.7） mg/g（以磁珠質量計，n=3）。 可見，MSPNTA 的固載量較高，但是酶活力保留卻很低，可能是磁珠懸液中游離的金屬離子Ni2+、Fe3+對酶活力產生影響。

圖6 MSP-NTA 固定MtICL 的固載量和相對表觀保留比活Fig. 6 Immobilization quantity and relative apparent retention specific activity of MtICL on MSP-NTA

經實驗發現 （見圖7）， 金屬離子濃度在0~20 nmol/L 時，Fe3+對MtICL 酶活力基本無影響， 而Ni2+卻明顯抑制酶活力。 在Ni2+濃度為8 nmol/L 時，對MtICL 的酶活力抑制達45%。由此可知，導致固定化酶酶活力下降的主要原因可能是固定化體系中游離的二價鎳離子[27]。

圖7 Ni2+、Fe3+對MtICL 酶活力影響Fig. 7 Effects of Ni2+ and Fe3+ on enzymatic activity of MtICL

2.4 MSP-COOH-F1 固定MtICL 及表征

2.4.1 MSP-COOH-F1 固定MtICL 固載量及表觀保留比活如圖8 所示，活化MSP-COOH-F1 的加入量為600 μg，重組蛋白質加入量在0~200 μg 時，磁珠固載量逐漸增加。當重組蛋白質加入量為250 μg時，達到飽和固載，即600 μg 活化磁珠的最大固載量約為9.5 μg， 計算磁珠表觀固載量約為 （15.8±1.0） mg/g（以磁珠質量計，n=3）。 隨著重組蛋白質加入量的增加，表觀保留比活逐漸降低。 在重組蛋白質加入量為10 μg 時，表觀保留比活最高，約為游離酶的85%， 此時的表觀固載量為（7.2±0.2） mg/g（以磁珠質量計，n=3）。MtICL 的活性位點結合口袋較小，底物小分子不易有效到達活性位點[28]，當重組蛋白質加入量增多時，磁珠表面可能偶聯了多個蛋白質，蛋白質大分子之間的空間位阻阻礙了底物進入蛋白質活性中心，使得酶活力下降。 與MSP-NTA相比，MSP-COOH-F1 的表觀固載量較低，但固定化酶表觀保留比活明顯優于前者。 為了使固定化酶在后續的應用中有最大的保留酶活力， 采用MSPCOOH-F1 固載重組蛋白質， 且控制重組蛋白質與磁珠投料質量比為1∶60。

圖8 MSP-COOH-F1 固定MtICL 的固載量和相對表觀保留比活Fig. 8 Immobilization quantity and relative apparent retention specific activity of MtICL on MSP -COOH-F1

2.4.2 MtICL 固定化前后對抑制劑的響應游離酶對抑制劑3-BP 和IA 的IC50分別為 （63.6±2.8）、（38.6±0.8） μmol/L（n=3，見圖9）。 MSP-COOH-F1固定化MtICL 對IA 的IC50為（42.5±1.4） μmol/L（n=3，見圖9（b）），與游離酶相比無顯著差異（P>0.05），且與文獻報道相符[29]。

圖9 MSP-COOH-F1 固定化酶和游離酶對抑制劑的響應曲線Fig. 9 Responsing curve of MSP-COOH-F1 immobilized enzyme and free enzyme to inhibitors

2.5 游離MtICL 和磁珠固載MtICL 的穩定性

混合物篩選中，為了實現基于親和力的配體捕獲，需要保證固定化酶的酶活力穩定。 作者所在課題組建立的迭代篩選方法中磁珠和重組蛋白質的固定化過程是30 min，前后處理過程約2 h。 因此，分別考察固定化酶和游離酶在不同溫度下的穩定性。游離酶在0 ℃、4 h 活性下降5%，25 ℃活性顯著下降（見圖10（a））。 MSP-COOH-F1 固定化酶在0 ℃和25 ℃下18 h 內活性無顯著變化 （見圖10（b））。而MSP-NTA 固定化酶在0 ℃和25 ℃時2 h 內活性分別下降8%、44%（見圖10 （c））。 故MSPCOOH-F1 固定化酶的穩定性明顯優于MSP-NTA固定化酶和游離酶。

圖10 游離酶和固定化酶穩定性Fig. 10 Stability of the free and immobilized enzymes

3 結 語

通過構建N 端帶6×His 標簽的MtICL 表達載體pET28a，在E.coliBL21（DE3）中表達并純化，獲得表達量、純化率及酶比活均較高的MtICL，可望實現大量可溶表達，滿足磁珠固定化并采用迭代篩選體系篩選天然產物對蛋白質質量的要求。 對比兩種磁珠對MtICL 的固載量、表觀保留比活及穩定性發現，MSP-NTA 表面修飾有Ni2+， 可通過MtICL 上的6×His 標簽選擇性地固定蛋白質（見圖1（a）），表觀固載量約是MSP-COOH-F1 的8 倍，而表現保留比活卻顯著下降， 在25 ℃放置2 h 酶活力下降44%。共價結合固定化酶是目前應用最廣泛的固定化酶方法之一[30]。 MSP-COOH-F1 表面修飾的羧基官能團，經過EDC 和NHS 活化后，可與蛋白質表面的游離氨基形成酰胺鍵而共價固定化 （見圖1（b））。MtICL 由4 個相同的亞基組成， 其晶體結構（PDB：1F8M） 顯示，表面分布有28 個賴氨酸殘基，活性位點內部無賴氨酸殘基。 因此，理論上羧基磁珠固定化MtICL 不會影響MtICL 酶活力。 通過對MSPCOOH-F1 固定化體系的優化， 其表觀固載量可達（15.8±1.0） mg/g（以磁珠質量計），相對表觀保留比活最高為85%。 MSP-COOH-F1 固定化MtICL 在0 ℃和25 ℃下保存18 h，酶活力無顯著改變，相對表觀保留比活及穩定性均滿足迭代篩選要求。 此外，MtICL 用MSP-COOH-F1 固定化前后對抑制劑IA 的IC50也無顯著差異。

親和迭代指數富集篩選方法的應用依賴于大量的固定化酶，而MSP-COOH-F1 固定化MtICL 達到最高表觀保留比活時表觀固載量僅有 （7.2±0.2）mg/g（以磁珠質量計），而基于6×His 標簽的固定化可大大提高MtICL 的固載量，但因金屬離子鎳對保留酶活力的潛在影響，后續可考慮更換靶酶融合標簽。作者所在課題組報道了GST 標簽的親和標記試劑[31]，將其修飾于磁珠表面便可實現磁珠對GST 標簽融合酶的固定化，此基于標簽的磁珠固定化策略有望提高固載量的同時保留最高酶活力。

綜上所述， 相比于MSP-NTA 通過金屬螯合固定，MSP-COOH-F1 的共價修飾固定MtICL 的效果更優， 適用于天然產物中ICL 抑制劑的親和富集篩選。