新型一氧化氮比率型納米探針的構建及性能研究

王曉麗，劉 浩，杜龍嘯，吳可馨，張雨婷，周楠迪

（江南大學 生物工程學院 糖化學與生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122）

一氧化氮（NO）是一種重要的氣體信號分子，由L-精氨酸在NO 合酶的作用下產生［1］。NO 在各種生理和病理進程中發揮重要作用，包括控制血管舒張、神經傳遞、血小板聚集、基因表達、免疫反應和細胞凋亡［2］。諸多研究表明，體內NO 水平的異常與多種疾?。ㄈ缧难芟到y疾病、中樞神經系統疾病及腫瘤）的發生發展密切相關［3］。因此，對NO 的相關研究逐漸成為尋求治療某些生理學病變新方法的契機。而如何高靈敏及高選擇性地動態監測NO水平，已成為研究人員亟需解決的首要問題［4］。

目前有多種檢測NO 的技術和方法，包括光譜分析、電化學傳感器、熒光法、電子順磁共振光譜法以及色譜法，它們大都需要復雜的儀器設備，操作繁瑣且耗時，因此難以達到快速和簡便檢測的目的［5-10］。表面增強拉曼散射（SERS）是一種具有分子指紋特性的振動光譜技術，具有操作簡單、快速、靈敏、原位和無損檢測等特點。更為重要的是，相對于熒光法，SERS具有出色的抗光漂白性和無自發熒光等顯著優勢，使其成為生物分子定量分析和成像的理想技術［11-13］。SERS的增強效果主要來自于貴金屬材料（如Au 和Ag）的局域表面等離子體共振效應（LSPR）介導的電磁增強。貴金屬材料的形貌、尺寸以及聚集狀態均對LSPR 效應有很大的影響，特別是在尖端、間隙、孔隙等納米尺度非常小的位置，會產生更顯著的電磁增強，這些區域常被稱為熱點，是SERS信號增強的主要來源［14］。

然而，NO作為一種無機分子，拉曼截面較弱，不易被SERS直接檢測［15］。研究發現，NO可和拉曼信號分子3，4-二氨基苯硫醇（DABT）上的鄰苯二氨基反應生成苯并三唑，從而造成拉曼信號的變化。Cui 課題組［16］利用鄰苯二胺修飾的金納米顆粒特異性檢測了活細胞的內源性NO，Li 等［17］通過氧化細胞色素c 在金納米粒子/甘氨酸/石墨烯量子點復合物上結構轉變引起的譜帶變化，發展了一種利用SERS檢測海水中NO 的新方法。Xing 等［18］開發了一種簡單而獨特的SERS 平臺，用于精確而靈敏地原位監測單個細菌釋放的NO。但現有檢測NO 的SERS 探針仍存在靈敏度不高、選擇性不強及背景信號干擾強烈等問題。此外，現有的SERS基底通常具有較差的SERS增強性能（Au）、較高的生物毒性（Ag）或易于不可逆聚集（Au和Ag）［19-20］。

本文結合納米Au 的良好生物相容性及納米Ag 的高SERS 增強性能，可控制備銀包金納米星（AuNSs@Ag）作為SERS基底。同時，利用DABT和NO反應前后未發生變化的拉曼特征峰作為內參，構建了一種比率型SERS 納米探針用于快速靈敏地檢測NO。首先以2-硝基-4-硫氰基苯胺為原料，通過兩步反應合成了可以與NO特異性反應的拉曼分子DABT（圖1A）。接著構建了比率型SERS納米探針（如圖1B），利用種子生長法以三水合四氯金酸為原料在檸檬酸三鈉還原下制備AuNSs，然后通過硝酸銀和抗壞血酸還原制備核殼結構的AuNSs@Ag，最后通過Ag—S鍵將DABT 修飾到AuNSs@Ag 表面，從而得到比率型納米探針AuNSs@Ag-DABT。當NO 存在時，DABT 與NO 發生反應并在541 cm-1附近出現一個新的三唑環的拉曼峰，而在1 078 cm-1處的C—S 離面彎曲拉曼峰的信號強度（I1078）保持不變。隨著NO 濃度的增加，比率型SERS 探針中541 cm-1處的拉曼信號強度（I541）逐漸增加，而I1078則不發生變化，因此可以根據I541/I1078的比值變化實現對NO 的定量檢測。比率型檢測具有內置校正達到避免環境干擾的目的，此外，由于DABT 對NO 的特異性識別，使得該傳感器在其他干擾物質存在下對NO 具有較高的特異性。

圖1 NO識別分子的合成路線（A）及SERS納米探針的構建（B）Fig.1 Synthesis route of NO recognition molecule（A） and construction of SERS nanoprobe（B）

1 實驗部分

1.1 材料、試劑與儀器

硝酸銀（AgNO3，≥ 99.7%）、抗壞血酸（≥ 99.7%）、檸檬酸三鈉（≥ 99.7%）、十二烷基硫酸鈉（SDS，≥ 99.5%）、2-硝基-4-硫氰基苯胺、連二亞硫酸鈉（≥ 99.7%）、氨水（NH3·H2O，≥ 99.8%）和氫氧化鉀（KOH，≥ 99.7%）購于國藥集團化學試劑有限公司；聚乙烯吡咯烷酮（PVP，≥ 99%）和三水合四氯金酸（HAuCl4·3H2O，≥99.9%）購于西格瑪奧德里奇中國有限公司；三-（2-羰基乙基）-磷鹽酸鹽（TCEP，BC grade）、壬酸二乙胺（DEA NONOate，≥97%）購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；其他試劑均為市售分析純。

ZEN3700 激光粒度儀（British Malvern Instruments Co.，Ltd.，ZEN3700）；透射電子顯微鏡（Japan Electronics Co.，Ltd.，JEM-2100）；紫外分光光度計（Hitachi，U-3900）；多功能酶標儀Biotek（United States Berton Instruments Co.，Ltd.，Synergy H4）；顯微拉曼成像光譜儀（Thermo Fisher Scientific，DXR2xi）。

1.2 實驗方法

1.2.1 DABT的合成與表征

稱取3.51 g 2-硝基-4硫氰基苯胺（18 mmol）分批加入到10 ℃含6 g KOH 的乙醇（100 mL）溶液中，室溫下攪拌30 min，然后加入含5%硫酸的乙醇溶液，混合物的顏色從深紫色變為橙色。將混合物傾入400 mL 水中，用3×100 mL 的乙酸乙酯（EA）萃取，合并有機層，用無水硫酸鎂干燥，過濾，旋蒸除去乙酸乙酯得到紅色固體4-氨基-3-硝基苯硫醇。將4-氨基-3-硝基苯硫醇（0.34 g，2 mmol）溶解在50%乙醇水溶液中（30 mL），然后將連二亞硫酸鈉（1.40 g，8 mmol）在20 min 內分批加入，混合物回流反應1 h，冷卻至室溫后將混合物傾入100 mL 水中，用3×30 mL 的氯仿萃取，合并有機層，用無水硫酸鎂干燥，過濾，旋蒸除去溶劑后得到粗產物，然后通過硅膠色譜法進行純化（MeOH∶EA=1∶5），得到黃色固體，產率74%。1H NMR（400 MHz，DMSO-D4）δ8.09（d，J= 2.1 Hz，1H），7，59（s，2H），7.50（dd，J= 8.8，2.1 Hz，1H），6.98（d，J= 8.9 Hz，1H），3.17（s，1H）。MS（ES+）：C6H8N2S 的m/z計算值為140.04，［M+H］+實測值為141.10。1H NMR和MS（ES+）的結果表明所得產物為目標化合物DABT。

1.2.2 比率型SERS納米探針AuNSs@Ag-DABT的制備與表征

AuNSs 按照文獻所報道的晶體生長法進行制備［12］，然后將10 mL AuNSs 溶液置于反應瓶中，室溫攪拌下，分別依次加入10 μL AgNO3溶液（0.1 mol/L）、抗壞血酸溶液（0.1 mol/L）和NH3·H2O 溶液（0.1 mol/L），溶液由藍色變為紫色后，加入400 μL SDS溶液（0.1 mol/L）保持其穩定性，繼續攪拌10 min后，通過4 500 r/min 離心10 min，重復離心3 次，收集得到的AuNSs@Ag 重懸于超純水中。接著，將10 μL DABT乙醇溶液（1 mg/mL）與200 μL AuNSs@Ag溶液充分混勻，在25 ℃下避光反應2 h，隨后5 000 r/min離心10 min，去除上清液，重復離心3 次，去除溶液中未結合的DABT 后得到AuNSs@Ag-DABT，并將其重懸于超純水中。利用DLS、TEM、UV-Vis 和拉曼光譜等技術對制備的比率型納米探針的粒徑大小、形貌及光學性質等進行表征。

1.2.3 實驗的可行性驗證

DEA NONOate 是一種NO 供體，將其加入比率型SERS納米探針中，緩慢產生NO，反應10 min后，利用拉曼光譜儀測量SERS納米探針在633 nm激發光下的拉曼光譜，觀察并比較拉曼峰值的變化。

1.2.4 實驗條件的優化

1.2.4.1 SERS 基底的優化 取10 μL DABT 溶液（1 mg/mL），分別加入到200 μL 的AuNSs 溶液與AuNSs@Ag溶液中，反應2 h后，5 000 r/min離心10 min，棄上清，離心3次，重懸于200 μL超純水中，混勻后利用拉曼光譜儀測量SERS納米探針在633 nm下的拉曼光譜，觀察拉曼特征峰值的變化。

1.2.4.2 SERS納米探針上DABT濃度的優化 取DABT固體粉末，分別加入乙醇配制成不同質量濃度（0.5~2 mg/mL）的DABT 溶液，取各濃度的DABT 溶液10 μL 加入200 μL AuNSs@Ag 溶液中，在25 ℃下反應2 h，5 000 r/min 離心10 min，棄上清，離心3 次后加入200 μL 超純水，混勻后利用拉曼光譜儀分別測量SERS 納米探針在633 nm 激光下的拉曼光譜，記錄拉曼特征峰值變化，對實驗結果進行比較，所有實驗結果均重復3次，選取最佳反應濃度。

1.2.4.3 AuNSs@Ag 與DABT 反應時間的優化 取6組200 μL AuNSs@Ag 溶液，加入10 μL DABT 溶液（1.5 mg/mL），分別在25 ℃反應3、2.5、2、1.5、1、0.5 h后，5 000 r/min離心10 min，棄上清，離心3次后加入200 μL超純水，混勻后利用拉曼光譜儀分別測量SERS納米探針在633 nm下的拉曼光譜，記錄拉曼特征峰值的變化，所有實驗結果均重復3次，對實驗結果進行比較，選取最佳反應時間。

1.2.5 比率型納米探針對NO的定量檢測

取10 μL 不同濃度（10~100 nmol/L）的DEA NONOate 溶液，分別加入到6 組200 μL 的比率型納米探針溶液，反應10 min 后，測量各組在633 nm 下的拉曼光譜強度，探究比率型SERS 納米探針的檢出限和檢測范圍。

1.2.6 比率型納米探針的選擇性及穩定性

使用6 種干擾物質：還原型（L-Cys、GSH）、氧化型（H2O2、NaClO）和同類分子型（NaNO3、NaNO2）評估比率型SERS納米探針的選擇性。取7組200 μL的比率型SERS納米探針溶液，6組分別加入10 μL 20 μmol/L 的上述干擾試劑，最后一組加入10 μL 的DEA NONOate 溶液（2 μmol/L）作為對照組，反應10 min 后，比較各組在633 nm 下的激光拉曼光譜強度，探究比率型SERS 納米探針的選擇性。將納米探針放置不同時間（1~7 d），然后和同一濃度的DEA NONOate 溶液（100 nmol/L）反應，通過比較各組在633 nm下的拉曼光譜強度，考察納米探針的穩定性，所有實驗均在3個平行樣品中進行。

2 結果與討論

2.1 納米探針AuNSs@Ag-DABT的表征

利用TEM 考察不同納米材料的形貌（如圖2A）。結果顯示，AuNSs 呈現典型的星狀，表面尖銳突出，大小較均勻。經過修飾后形成的AuNSs@Ag-DABT 也呈星形（圖2B），與初始狀態的AuNSs的形態和大小均相似，AuNSs@Ag-DABT 的表面突起稍微變鈍，以上表明修飾后納米探針的形貌未產生明顯變化。為探究經過每步修飾后納米顆粒的水合粒徑的變化情況及在水溶液中的分散情況，采用DLS 技術對不同的納米材料進行分析（圖2C），AuNSs、AuNSs@Ag 和AuNSs@Ag-DABT 的平均水合粒徑分別為76、90、105 nm，AgNSs經過每步修飾后，平均水合粒徑均略有增加。此外，AuNSs、AuNSs@Ag和AuNSs@Ag-DABT 3種納米材料的分散性指數（PDI）分別為0.128、0.221、0.129，均小于0.3，表明其在水溶液中能夠穩定存在，且具有良好的分散性。

圖2 納米材料的表征Fig.2 Characterization of nanomaterials

為進一步考察每步修飾之后納米材料電荷性質的變化，用Zeta 電位檢測儀分別測定了AuNSs、AuNSs@Ag 和AuNSs@Ag-DABT 的電勢（圖2D）。AuNSs 的電勢約為-24 mV，形成核殼結構后的電勢約為-31 mV，電負性增強，這是由于在制備核殼結構時使用SDS 溶液作為穩定劑，致使AuNSs@Ag 帶有更多負電荷。進一步修飾DABT后納米探針的電勢約為-27 mV，電負性降低，這是由于DABT含有的兩個—NH2可與水結合，并電離形成帶有正電的—NH3+；當修飾DABT后，DABT的正電荷導致AuNSs@Ag-DABT 的電勢上升。最后，通過酶標儀分別測定了3 種納米材料的UV-Vis 吸收光譜（圖2E），AuNSs 在720 nm處有較強的紫外吸收，而形成核殼結構后的AuNSs@Ag和AuNSs@Ag-DABT則在530 nm處產生特征吸收峰，且吸收峰明顯藍移，這是由于金核向銀殼層發生了獨特的電子轉移所致［21］。

2.2 實驗的可行性驗證

通過拉曼光譜的變化，本實驗探究了納米探針AuNSs@Ag-DABT 用于檢測NO 的可行性。DEA NONOate 作為一種外源性NO 供體可緩慢釋放NO，AuNSs@Ag-DABT 中的DABT 可與NO 反應生成苯并三唑，并產生三唑環的拉曼特征峰。如圖3A 所示，與NO 反應前，AuNSs@Ag-DABT 具有明顯的拉曼信號。經NO 處理后，拉曼光譜在541 cm-1處出現一個新的拉曼峰，這是由于NO 和DABT 中的兩個鄰苯二氨基發生特異性反應，生成苯并三唑，導致光譜出現三唑環的拉曼特征峰。此外，NO 反應前后1 078 cm-1處的C—S離面彎曲拉曼峰的強度基本無變化。以上結果表明，AuNSs@Ag-DABT 納米探針具有良好的NO響應能力，可以通過I541/I1078的變化實現NO的比率檢測。

圖3 AuNSs@Ag-DABT添加NO前后的拉曼光譜（A），AuNSs-DABT和AuNSs@Ag-DABT的拉曼光譜（B），AuNSs@Ag上DABT濃度（C）與反應時間（D）的優化Fig.3 Raman spectra of AuNSs@Ag-DABT before and after adding NO（A），Raman spectra of AuNSs-DABT and AuNSs@Ag-DABT（B） ，and optimization of concentration（C） and incubation time（D） of DABT on AuNSs@Ag

2.3 實驗條件的優化

為提高AuNSs@Ag-DABT 對NO 的檢測性能，對一系列關鍵實驗條件進行優化。首先對SERS 基底進行篩選，分別制備了納米探針AuNSs-DABT 和AuNSs@Ag-DABT，然后通過比較二者的拉曼光譜，探究其拉曼增強效應的強弱。結果如圖3B 所示，與AuNSs-DABT 相比，AuNSs@Ag-DABT 的拉曼信號顯著增強，表明AuNSs@Ag-DABT 具有更強的拉曼增強效應，因此選擇AuNSs@Ag-DABT 作為SERS基底進行后續實驗。DABT 在AuNSs@Ag 上的修飾量直接影響AuNSs@Ag-DABT 對NO 的檢測性能，因此對DABT 在AuNSs@Ag 上的反應濃度以及反應時間進行優化。隨著DABT 濃度的增加，AuNSs@Ag-DABT的拉曼信號強度逐漸增加，在DABT達到1.5 mg/mL時達到最大值，之后隨著DABT濃度的增加，SERS納米探針的拉曼信號強度逐漸下降（圖3C）。表明DABT濃度過低會導致拉曼信號強度降低，而濃度過高時可能會導致AuNSs@Ag-DABT 聚集，同樣使得拉曼信號強度降低，所以選擇1.5 mg/mL 作為DABT 的最佳反應濃度。進一步優化DABT 的反應時間（圖3D），可以觀察到納米探針的拉曼信號強度隨著反應時間的增加而逐漸增強，在2 h時達到峰值，之后隨著反應時間的變長，拉曼信號強度逐漸降低。這可能是由于反應時間過短時，只有少量DABT能結合到AuNSs@Ag上，導致AuNSs@Ag-DABT的拉曼信號強度較低；而反應時間過長時，則可能導致AuNSs@Ag-DABT 聚集，從而產生較低的拉曼信號。因此，實驗選擇2 h作為DABT的最佳反應時間。

2.4 納米探針對NO的定量檢測

為探究SERS 納米探針對NO 的動態響應范圍，在最優實驗條件下制備比率型SERS 納米探針AuNSs@Ag-DABT，然后分別與不同濃度（1~100 nmol/L）的DEA NONOate 反應，并在633 nm 下測定其拉曼光譜，根據拉曼信號強度與NO 濃度的關系分別繪制信號強度變化曲線及檢測線性曲線。如圖4A所示，隨著NO 濃度的增加，其在541 cm-1處的拉曼強度也逐漸增強，而在1 078 cm-1處的拉曼信號強度基本保持不變，二者的比率I541/I1078也不斷增大，證明比率型SERS 納米探針對NO 具有良好的響應。在10~60 nmol/L的動態范圍內，NO的濃度與I541/I1078之間具有一定的線性關系（如圖4B所示），線性回歸方程為y=0.001 84x+0.005 81（r2 =0.998 6），其中y為I541/I1078，x為NO 的濃度。根據線性方程，計算得到檢出限（LOD）為3.89 nmol/L，LOD = 3σ/k，其中σ為空白測量值（n=3）的標準偏差（SD），k為線性方程的斜率。

圖4 AuNSs@Ag-DABT與不同濃度NO反應的拉曼光譜（A） 以及I541/I1078與NO濃度間的線性關系（B）Fig.4 Raman spectra of AuNSs@Ag-DABT at different concentrations of NO（A） and linear relationship of NO concentration and I541/I1078（B）concentrations of NO（a-f）：10，20，30，40，50，60 nmol/L

2.5 納米探針的選擇性與穩定性

本文使用6 種干擾物質：可以還原NO 的物質（L-Cys、GSH）、可以氧化NO 的物質（H2O2、NaClO）和NO 的同類型分子（NaNO3、NaNO2）評估比率型SERS 納米探針的選擇性。將NO 和干擾物質分別反應（NO 的濃度為2 μmol/L，干擾物質的濃度為20 μmol/L），然后在633 nm 下測定其拉曼光譜。從圖5 可以看出，與NO 反應后，納米探針的比率峰（I541/I1078）的數值最大，而與干擾物質反應后，I541/I1078的數值較小，這表明比率型SERS 納米探針能夠特異性識別NO，而對其他干擾物質幾乎不響應。進一步考察SERS納米探針的穩定性，將納米探針放置不同時間（1~7 d）后，分別與NO反應，測定其拉曼信號比值的變化。結果顯示，放置不同時間的納米探針的I541/I1078的數值無明顯變化（如圖5 插圖），表明該SERS納米探針具有良好的穩定性。

圖5 比率型SERS納米探針的選擇性Fig.5 Selectivity of the ratiometric SERS nanoprobe insert：the stability of the nanoprobe

本研究與報道的其他檢測NO 的方法性能進行比較，結果如表1 所示。與其他NO 探針相比，該探針具有較低的檢出限。更重要的是，該探針采用比率模式進行檢測，大大降低了背景干擾且具有較高的特異性與穩定性，從而使檢測結果更可靠。

表1 本方法與其他NO檢測方法的比較Table 1 Comparison of the approach in this work and the relevant methods for detection of NO

3 結 論

本文構建了一種基于SERS 的比率型納米探針用于快速、靈敏地檢測NO。當存在NO 時，納米探針AuNSs@Ag-DABT 上的DABT 可以特異性地與NO 發生反應生成苯并三唑，并在541 cm-1處產生一個新的三唑環拉曼特征峰，而在1 078 cm-1處的C—S 離面彎曲特征峰的拉曼強度不變，基于此可實現對NO的比率型SERS檢測。在最優實驗條件下，納米探針對NO的線性響應范圍為10~60 nmol/L，檢出限為3.89 nmol/L。該納米探針具有較高的選擇性和良好的穩定性。這種新型比率型SERS 納米探針有望作為NO水平異常引起的疾病的基礎研究和臨床診斷的新工具。