液液萃取/氣相色譜-串聯質譜法測定人尿中16種羥基多環芳烴

鮑 珊，錢柬坤，2，付 慧，邱 天，陸一夫，3*

（1.中國疾病預防控制中心環境與人群健康重點實驗室，中國疾病預防控制中心環境與健康相關產品安全所，北京 100021；2.中國醫科大學 公共衛生學院，遼寧 沈陽 110122；3.南京醫科大學 公共衛生學院全球健康中心，江蘇 南京 211166）

多環芳烴（PAHs）是一類廣泛存在的環境污染物，主要來自化石能源燃燒、汽車尾氣排放、煙草燃燒、食物加工等過程中有機物的熱解或不完全燃燒，通過消化道攝入、呼吸道吸入和皮膚接觸等途徑進入人體［1-4］。PAHs 暴露引起的健康風險已受到國際上廣泛關注，國際癌癥研究中心（IARC）的研究證實PAHs是一類具有致癌、致畸、致突變毒性的化學物質［5-7］。根據其在環境中的分布、人群暴露和健康風險，美國國家環境保護局（USEPA）將萘、芴、菲、芘、熒蒽、苯并［a］芘等16種PAHs列入優先控制污染物名錄［8］，我國原環境保護部會同工業和信息化部、衛生健康委將萘、蒽、苯并［a］蒽、苯并［a］菲、苯并［a］芘、苯并［b］熒蒽等8種PAHs列入《優先控制化學品名錄》。

PAHs 進入人體內經細胞色素P450 催化反應生成羥基化代謝產物（OH-PAHs），最后通過尿液排出體外［6，9］。目前研究表明人尿中OH-PAHs 含量能夠全面地反映PAHs 的暴露水平，美國和加拿大已對普通人群尿中OH-PAHs 負荷水平和變化趨勢進行長期監測［10］，我國2016 年起組織實施的國家人體生物監測項目也將尿中OH-PAHs納入監測指標［9］。

目前測定尿中OH-PAHs常用的前處理方法主要有液液萃?。↙LE）和固相萃?。⊿PE）［4，11］，LLE因其成本較低、操作簡便等優點更適用于大批量樣品的檢測。液相色譜-質譜聯用法（LC-MS）和氣相色譜-質譜聯用法（GC-MS）是常用于尿中OH-PAHs的儀器分析方法［12-15］。LC-MS具有無需衍生化且操作步驟相對簡單等特點，但此類方法無法實現2-羥基芴和9-羥基芴、2-羥基菲和3-羥基菲等同分異構體的分離，同時存在較強的基質效應和靈敏度相對較差等問題［16-17］。GC-MS相比LC-MS 具有更好的分離能力，且氣相色譜-串聯質譜（GC-MS/MS）的多反應監測模式（MRM）可進一步提高羥基熒蒽、羥基苯并［a］芘和羥基苯并［a］蒽等痕量目標物的靈敏度［1，11，18-20］。

本研究通過對實驗條件的優化選擇，建立了一種可同時測定人尿中16 種OH-PAHs 的液液萃取/氣相色譜-串聯質譜法（LLE/GC-MS/MS）。該方法已應用于我國國家人體生物監測項目中，通過監測人群尿中OH-PAHs負荷水平和變化趨勢，可全面評估PAHs暴露對人群健康的影響。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Trace 1310-TSQ 9000 氣相色譜-串聯質譜儀（美國Thermo Fisher 公司），TG-5SilMS 色譜柱（美國Thermo Fisher 公司）；FV64 氮吹儀（廣州得泰儀器科技有限公司），DT5-4B 離心機（河北醫眾醫療器械有限公司）。

16 種OH-PAHs 標準溶液（天津阿爾塔科技有限公司，質量濃度均為100 mg/L），10 種13C 標記的同位素定量內標溶液和回收內標（美國Cambridge Isotope Laboratories 公司，質量濃度均為50 mg/L），4 種氘代標記的同位素定量內標標準物質（純度＞98%，加拿大Toronto Research Chemicals 公司），其詳細信息見表1。正己烷（農殘級，美國Fisher 公司），正戊烷（色譜純，德國默克公司），甲苯（色譜純，美國Tedia 公司），正十二烷（色譜純，比利時Acros 公司），β-葡萄糖苷酸酶/硫酸芳酯酶（β-葡萄糖苷酸酶活度單位≥300 000 U/g，硫酸芳酯酶活度單位≥10 000 U/g，德國默克公司），N-甲基-N-（三甲基硅烷）三氟乙酰胺（MSTFA）、雙（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（BSTFA）（色譜純，美國Sigma-Aldrich 公司），其他試劑均為分析純。實驗用水均為純水。

表1 16種羥基多環芳烴及其同位素內標的儀器分析參數Table 1 Instrument analysis parameters of 16 OH-PAHs and their internal standards

1.2 溶液配制

1.2.1 抗壞血酸溶液稱取適量抗壞血酸用水溶解稀釋為0.25 mg/L的抗壞血酸溶液。

1.2.2 硝酸銀溶液稱取適量硝酸銀用水溶解稀釋為1 mol/L的硝酸銀溶液。

1.2.3 酶溶液稱取適量無水乙酸鈉用水溶解稀釋為1 mol/L 的乙酸鈉溶液（乙酸調至pH 5.5），再取適量β-葡萄糖苷酸酶/硫酸芳酯酶溶于乙酸鈉溶液中得到β-葡萄糖苷酸酶濃度為3 000 U/mL，硫酸芳酯酶濃度為100 U/mL的酶溶液。

1.2.4 標準使用溶液用甲苯分別稀釋配制質量濃度為1 mg/L 的混合標準使用溶液（1-羥基萘和2-羥基萘的質量濃度為5 mg/L），質量濃度為25 μg/L 的混合同位素定量內標使用溶液，以及質量濃度為100 μg/L的回收內標使用溶液。

1.3 尿樣采集

本研究依托國家人體生物監測項目共采集529 名調查對象的尿樣，該項目已獲中國疾病預防控制中心環境與健康相關產品安全所倫理委員會批準（批準號：201904）。

1.4 樣品前處理

1.4.1 酶解尿樣解凍后取1 mL 于12 mL 玻璃管中，依次加入80 μL 定量內標使用溶液、10 μL 抗壞血酸溶液和1 mL酶溶液后振蕩混勻，于37 ℃下避光酶解至少12 h。

1.4.2 液液萃取酶解液中加入2 mL水后，加入5 mL甲苯-正戊烷（1∶4）振搖10 min后，3 500 r/min離心10 min，取上層有機相轉移至另一玻璃管中，酶解液中再加入5 mL 甲苯-正戊烷（1∶4）重復提取一次，合并兩次提取的上層有機相后加入1 mL 硝酸銀溶液，振搖5 min 后，3 500 r/min 離心5 min，取上層有機相于60 ℃氮吹至近干。

1.4.3 衍生化向氮吹試管中加入20 μL 甲苯復溶后轉移至已加入10 μL 回收內標使用溶液和10 μL MSTFA的棕色進樣小瓶中，震蕩混勻后，60 ℃避光放置50 min后待測。

1.5 儀器分析條件

氣相色譜條件：進樣口溫度：300 ℃；進樣方式：不分流進樣；載氣（氦氣）流量：恒流模式，0.9 mL/min；進樣量：1 μL；升溫程序：起始溫度95 ℃，保持1 min，以15 ℃/min 升溫至195 ℃，再以2 ℃/min升溫至206 ℃，保持5 min，再以40 ℃/min升溫至300 ℃，保持8 min。

質譜條件：EI 離子源溫度為300 ℃；傳輸線溫度為300 ℃；多反應模式（MRM）掃描，碰撞氣為氬氣，溶劑延遲時間5 min。

2 結果與討論

2.1 衍生化反應條件的選擇

由于目標物中含有極性較強的羥基官能團，易與氣相色譜柱填料相互作用形成氫鍵，影響色譜柱的解吸能力，因此在儀器分析前需通過甲硅烷基化反應取代羥基進行衍生化以提高分析靈敏度［21］。MSTFA 和BSTFA 是最常用的衍生化試劑，已有研究表明基于MSTFA 進行甲基硅烷化生成的衍生物可獲得更高的豐度，因此本研究使用MSTFA 作為衍生化試劑［22］。衍生化反應的溫度和時間是影響結果的主要因素，既往研究根據反應速率和化學平衡證實60 ℃是最佳溫度［19，23］。本研究在此溫度條件下比較了基質樣品目標物質量濃度為2 μg/L（1-羥基萘和2-羥基萘為10 μg/L）時不同反應時間（20、30、40、50、60、70 min）對實驗結果的影響。結果表明，當衍生化反應時間為50 min 時目標物響應達到峰值。因此本研究選擇衍生化反應時間為50 min。

2.2 儀器條件的優化

本研究使用常用的95%二甲基聚硅氧烷（5%二苯基）固定相填料的TG-5SilMS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）弱極性色譜柱，通過優化進樣口溫度、柱流速、升溫程序等色譜條件，確保各目標物的分離度良好。圖1為16種目標物的色譜圖。

圖1 16種OH-PAHs混合標準溶液的色譜圖Fig.1 Chromatogram of 16 OH-PAHs mixed standard solution the numbers denoted are the same as those in Table 1；mass concentrations of 14 OH-PAHs were 20 μg/L，those of 1-NAP and 2-NAP were 100 μg/L

采用多反應監測模式（MRM）對標準溶液進行全掃描，以目標物三甲基甲硅烷基衍生物的分子離子為母離子確定保留時間，根據裂解規律選擇M-30（-2［·CH3］）、M-31（-［·CH3+ CH4］）和M-89（-OSiC3H9）等質荷比大且響應值高的特征基團作為其產物離子［1，19，21］，得到3~5個備選離子對組合，再進一步優化其碰撞能量。由于尿樣基質復雜，為避免實際樣品檢測過程中離子對的基質干擾，按照“1.4”和“1.5”的方法測定基質加標樣品，確定最優的定量、定性離子對。最后優化并確定傳輸線和離子源溫度等質譜參數。儀器條件參數見表1。

2.3 酶加入量的選擇

OH-PAHs在尿中主要與葡萄糖苷酸和硫酸鹽以偶聯形式存在，因此測定時首先需要通過酶水解法將目標物從偶聯結合態轉化為游離態后再進行提?。?4］。β-葡萄糖苷酸酶/硫酸芳酯酶加入量是影響酶水解效率的關鍵因素，一般酶解效果隨著酶加入量的增加而提升。本研究比較了質量濃度為2 μg/L（1-羥基萘和2-羥基萘為10 μg/L）基質樣品選擇3種不同酶加入量（1 500（50）U、3 000（100）U和4 500（150）U）時對目標物響應強度的影響。結果表明，當β-葡萄糖苷酸酶/硫酸芳酯酶加入量達到3 000（100）U 時，目標物的響應強度達到峰值。因此本研究選擇1 mL 尿樣中加入3 000（100）Uβ-葡萄糖苷酸酶/硫酸芳酯酶。

2.4 提取溶劑的選擇

OH-PAHs 的pKa值為8.0~9.2，這類弱極性有機物通常采用非極性或極性較小的溶劑進行提?。?2］。本研究比較了體積均為10 mL 的正己烷、正戊烷和甲苯-正戊烷（1∶4）3 種不同提取溶劑的提取效率（ER），按照“1.4”步驟處理空白基質加標樣品，通過公式ER（%）=A1/A2×100%對結果進行評價，其中A1為樣品前處理前基質加標測得的目標物定量離子對的峰面積，A2為樣品前處理后基質加標測得的目標物定量離子對的峰面積。結果如圖2所示，采用10 mL甲苯-正戊烷（1∶4）進行提取時的提取效率最高。

圖2 提取溶劑對16種OH-PAHs提取效率的影響（n=6）Fig.2 Effect of extraction solvent on extraction rate of 16 OH-PAHs（n=6）

2.5 基質效應

人尿樣品基質復雜，液液萃取過程中除目標物外，部分雜質會同時被提取。本研究使用硝酸銀溶液進行除雜，以減少儀器分析時雜質對色譜柱效和質譜離子化效率的影響，降低基質效應的干擾。為評估基質效應對檢測結果的影響，本研究使用同位素標記物作為定量內標，13C12-PCB105 作為回收內標（RS），分別評估了外標法和內標法的基質效應［1］，其中外標法基質效應通過公式ME-ES（%）=（1-Aem/Aeo）×100%進行評估，式中Aem為基質中目標物與RS 峰面積比，Aeo為溶劑中目標物與RS 峰面積比；內標法基質效應通過公式ME-IS（%）=（1-Aim/Aio）×100%進行評估，其中Aim為基質中目標物與內標峰面積比，Aio為溶劑中目標物與內標峰面積比。當|ME| < 20%時說明基質效應較弱，不影響檢測結果準確性。如表2 所示，所有目標物的ME-ES 范圍為-7.2%~-37.7%，ME-IS 范圍為-3.3%~-11.1%。表明因為同位素內標物與目標物具有相似的理化性質，本研究采用內標法定量可有效補償基質效應的干擾。

表2 16種OH-PAHs的基質效應Table 2 Matrix effects of 16 OH-PAHs

2.6 方法檢出限與定量下限

采用甲苯配制目標物質量濃度分別為0.125、0.625、1.25、6.25、12.5、62.5、125 μg/L（1-NAP和2-NAP 為此質量濃度的5倍），定量內標質量濃度為6.25 μg/L，回收內標質量濃度為25 μg/L 的標準系列溶液。該標準系列中目標物換算為人尿中的質量濃度分別為0.02、0.1、0.2、1、2、10、20 μg/L（1-MAP 和2-HAF 為此質量濃度的5倍）。按照“1.4.3”衍生化后使用“1.5”方法進行測定，以目標物峰面積和對應定量內標峰面積的比值為縱坐標，其濃度的比值為橫坐標，繪制標準曲線。如表3 所示，所有目標物在0.02~ 20 μg/L（1-NAP 和2-NAP 為0.1~100 μg/L）范圍內線性關系良好，相關系數（r2）均大于0.99。

表3 16種OH-PAHs的線性范圍、相關系數（r2）、方法檢出限及定量下限Table 3 Linear ranges，correlation coefficients（r2），method detection limits（MDLs），and limits of quantitations（LOQs） of 16 OH-PAHs

根據“1.5”方法測定標準溶液的3 倍信噪比預估方法檢出限。重復測定7 次濃度為5 倍方法檢出限的基質加標樣品，計算測定結果的標準偏差，方法檢出限為3 倍標準偏差，方法定量下限為10 倍標準偏差［25］。如表3所示，本方法檢出限為0.01~ 0.19 μg/L，定量下限為0.03~ 0.62 μg/L。

2.7 回收率與相對標準偏差

采用基質加標制備3個不同質量濃度水平的樣品，同一天內重復測定6次評估方法回收率和日內相對標準偏差（RSD），連續6天每天各測定一次不同濃度水平的樣品，評估日間RSD。如表4所示，16種OH-PAHs的加標回收率為81.6%~122%，日內RSD為0.22%~5.5%，日間RSD為0.76%~10%。

表4 16種OH-PAHs 的加標回收率和相對標準偏差（n=6）Table 4 Recoveries and RSDs of the 16 OH-PAHs（n=6）

2.8 標準參考樣品測定

美國國家標準與技術研究院（National Institute of Standards and Technology，NIST）的SRM 3672 標準參考樣品可用于評估10 種OH-PAHs 測定的準確度。結果顯示，本方法的測得值與參考值的相對偏差均小于10%（表5），說明本方法的檢測結果準確可靠。

表5 標準參考樣品（SRM 3672）的測定結果Table 5 Detection results of standard reference material（SRM3672）

2.9 實際樣品測定

本方法應用于國家人體生物監測項目中，對采集的529份尿樣進行檢測，結果如表6所示。結果顯示除3-CHR 外，其他15種OH-PAHs均有檢出，其中1-NAP、2-NAP、9-FLU、2-FLU、1-PHEN、2-PHEN、3-FRT 和1-PYR 的檢出率均超過90%；1-NAP 和2-NAP 的質量濃度水平高于其他組分，中位數（P50）分別為1.09 μg/L 和1.95 μg/L。該監測結果可為后續開展PAH 暴露對人群健康效應影響的研究提供數據支撐。

表6 尿樣中16種OH-PAHs的檢測結果Table 6 Detection results of 16 OH-PAHs in human unire samples

3 結 論

本研究基于LLE 的前處理方法，通過對實驗條件的優化選擇，建立了GC-MS/MS 同時測定人尿中16 種OH-PAHs 的分析方法。該方法檢測成本低、分離度好、靈敏度高、基質效應干擾小，可為監測人群尿中OH-PAHs負荷水平和變化趨勢提供技術支撐。