超高效液相色譜-四極桿-飛行時間高分辨質譜用于化妝品中18種非甾體抗炎藥篩查和測定

黃佳穎，李楊杰，方繼輝，肖樹雄，徐新軍

（1. 中山大學 藥學院，廣東 廣州 510006；2. 廣東省藥品檢驗所，國家藥品監督管理局化妝品風險評估重點實驗室，廣東 廣州 510163）

非甾體抗炎藥（NSAIDs）外用具有抗炎、抗過敏、祛痘等功效［1］，臨床上可單獨或與糖皮質激素制劑聯合使用，以減少糖皮質激素停藥后的“反跳現象”［2］，也可用于治療接觸性皮炎［3］。但使用不當易引起藥物不良反應，輕者表現為藥疹，重者則引起繼發感染，甚至危害人體生命安全［4-6］。近年來，為了使化妝品達到更快速、顯著的美白、消炎等效果，不法分子在化妝品中違法添加禁用物質、國家法定檢驗方法項目種類內的化學物質時有報道［7-9］，其中包括非那西丁等［10］。NSAIDs 若被添加至化妝品中，消費者在不知情下使用存在一定的安全風險。

目前，NSAIDs 的檢測方法主要有高效液相色譜法（HPLC）、氣相色譜法（GC）、高效液相色譜-串聯質譜法（HPLC-MS/MS）、氣相色譜-串聯質譜法（GC-MS/MS）等［11-17］，但大多用于中成藥和保健食品檢測領域，化妝品中NSAIDs 檢測方法的研究較少，我國也未制定化妝品中NSAIDs 的標準檢驗方法。李靜等［18］建立了HPLC 法同時測定牙膏中的4 種NSAIDs，熊爽等［19］建立了UPLC-MS/MS 法測定祛痘類化妝品中氨基比林和保泰松的含量，董亞蕾等［20］采用UPLC-MS/MS 測定了化妝品中的6 種鎮痛類化學成分。雖然上述方法的專屬性強，但HPLC 法難以滿足定性篩查需求；UPLC-MS/MS 僅適用于已知目標物的分析，質譜優化過程繁瑣，在無對照品的情況下難以快速初篩判斷。超高效液相色譜-四極桿-飛行時間高分辨質譜（UPLC-Q-TOF MS）具有更強的抗基質干擾和高通量檢測能力，在無對照品情況下，可結合譜庫快速實現樣品中未知物的初篩檢測，同時通過一級母離子精確質量數進行定量分析［21］。目前，采用UPLC-Q-TOF MS 篩查和測定化妝品中NSAIDs 尚未見報道。因此，建立NSAIDs 的高通量篩查測定方法具有重要意義，可以提高化妝品風險監測靶向性，為化妝品風險預警提供技術支持。

本研究建立了同時測定化妝品中18 種NSAIDs 的UPLC-Q-TOF MS 法，簡化了前處理和質譜條件，并對色譜條件進行了優化。所建方法能準確定性和定量測定化妝品中18 種NSAIDs，可為化妝品風險識別提供技術支持。

1 實驗部分

1.1 儀器設備

Agilent 1290 InfinityⅡ-6546 超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜儀（美國安捷倫科技有限公司）；X3R 高速冷凍離心機（美國賽默飛世爾公司）；Milli-Q Reference 超純水發生器（美國Millipore 公司）；XS205DU電子天平（瑞士Mettler公司）；MS3 basic渦旋振蕩器（德國IKA公司）。

1.2 材料與試劑

甲酸（質譜純，德國CNW 公司）；甲醇和乙腈（色譜純，德國CNW 公司）；乙酸銨（質譜純，美國Sigma 公司）；甲酸銨（質譜純，阿拉丁生化科技股份有限公司）；實驗用水為屈臣氏純凈水；舒林酸、對乙酰氨基酚、酮洛芬、非那西丁、安替比林、普拉洛芬、4-甲氨基安替比林、異丙安替比林、艾瑞昔布、氨基比林、洛索洛芬鈉、吡羅昔康、氯諾昔康、氯芬那酸丁酯、美洛昔康、醋氯芬酸、吲哚美辛對照品來自中國食品藥品檢定研究院；辛可芬對照品購自Alfa Aesar公司。

1.3 實驗條件

1.3.1 液相色譜條件色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱溫：40 ℃；流動相A：0.1%甲酸水，流動相B：0.1%甲酸乙腈；流速：0.35 mL/min；進樣量：5 μL。梯度洗脫程序：0～1 min，2% B；1～5 min，2%~30% B；5～10 min，30%~40% B；10～15 min，40%~70% B；15～20 min，70%~98% B；20～22 min，98% B；22～22.1 min，98%~2% B；22.1～25 min，2% B。

1.3.2 質譜條件離子源：雙噴霧電噴霧離子源（Dual-ESI 源）；采集模式：正離子模式；干燥氣溫度：320 ℃；霧化氣壓力：241.32 kPa；干燥氣流速：8 L/min；毛細管電壓：4 000 V；鞘氣溫度：350 ℃；鞘氣流速：12 L/min；噴嘴電壓：1 000 V；毛細管出口電壓：175 V；錐孔電壓：65 V；八極桿電壓：750 V；碰撞氣：氮氣；一級全掃描范圍：m/z100～500；二級Target MS/MS 掃描范圍：m/z20～500。

1.3.3 對照品溶液的配制分別精確稱取18 種NSAIDs 各10 mg 至10 mL 容量瓶中，加入甲醇于室溫超聲溶解，定容至刻度，搖勻，4 ℃避光貯存。該對照品儲備溶液的質量濃度為1 000 mg/L。分別取適量對照品儲備溶液，用60%乙腈水配制成質量濃度分別為2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、200.0 μg/L的對照品溶液。

1.3.4 18 種NSAIDs 篩查譜庫的建立18 種NSAIDs 的母離子加合方式均為［M+H］+，配制18 種NSAIDs 的對照品溶液，采用正離子模式下TOF 數據采集模式進行掃描分析，識別18種NSAIDs 的一級母離子精確質量數和保留時間，再采用Target MS/MS 模式，在低、中、高3 種碰撞能量下掃描獲取18種NSAIDs的二級碎片離子精確質量數和離子豐度比等質譜信息。將各化合物在3種碰撞能量下的子離子譜圖導入PCDL 軟件中，補充各化合物的中英文名稱、分子式、分子量、結構式mol 文件、保留時間、CAS號等信息，在PCDL軟件中構建18種NSAIDs的篩查譜庫。18種NSAIDs的質譜參數見表1。

表1 18種化合物的UPLC-Q-TOF MS分析參數Table 1 Analytical parameters of 18 compounds by UPLC-Q-TOF MS

1.3.5 樣品的篩查確證與測定取化妝品約0.2 g，精密稱定置于10 mL 具塞比色管中，加入60%乙腈水溶液5 mL，渦旋30 s，定容，超聲提取15 min，渦旋混合搖勻。取上清液經0.22 μm 濾膜過濾后得供試品溶液，將供試品溶液上機檢測進行一級全掃描，得到各化合物的母離子質荷比、保留時間、同位素等信息。通過安捷倫MassHunter 工作站的定性軟件匹配數據庫分析，同時對保留時間和精確質量數進行檢索，設置化合物一級質譜數據打分條件為保留時間偏差小于2 min，母離子質量數偏差小于10 ppm，同位素豐度比差異<5%，綜合匹配得分90 分以上則作為疑似陽性樣品進行二級子離子掃描；若二級子離子質譜數據分析確證為陽性樣品，確證后的目標物則通過外標法定量計算。

2 結果與討論

2.1 樣品提取方法的優化

膏霜和水劑是化妝品的常見基質，本實驗通過基質加標考察不同提取條件下18 種NSAIDs 在兩種基質中的提取效果。分別考察了化妝品分析常用的兩種提取溶劑甲醇和乙腈，通過代入溶劑標準曲線計算提取回收率，結果見圖1。由圖1可見，4-甲氨基安替比林、氨基比林、氟芬那酸丁酯在甲醇中的提取效率明顯高于乙腈，其余化合物均是在乙腈中的提取效率高于甲醇或相當。為兼顧所有化合物的提取效率，使用乙腈作為提取溶劑進行后續實驗。

圖1 18種NSAIDs在不同提取溶劑中的提取效率Fig.1 Extraction efficiencies of the 18 NSAIDs using different solvents

18 種NSAIDs 的酸堿性存在差異，在酸性條件下有利于酸性或中性化合物溶于有機溶劑，抑制化合物水解［22］。為進一步提高提取效率，考察了不同體積分數（0%、0.1%、0.2%、0.3%、0.5%）的甲酸乙腈溶液對NSAIDs提取回收率的影響。結果表明，隨著甲酸體積分數的增加，4-甲氨基安替比林的回收率逐漸降低，這可能是因為其為堿性化合物，加入甲酸可促進離子化，導致檢測含量降低。當甲酸為0.5%時，膏霜類化妝品中絕大多數化合物的質譜響應差，回收率異常。因此，本實驗選擇不加入甲酸的純乙腈進行提取優化。

進一步考察了不同體積分數（20%、50%、60%、80%、90%、100%）的乙腈水溶液對膏霜和水劑類化妝品樣品提取回收率的影響。結果表明，乙腈與水的體積比對對乙酰氨基酚的影響較大。以60%乙腈水溶液為提取溶劑時，對乙酰氨基酚的提取回收率達到最大，當乙腈的比例進一步提高時，對乙酰氨基酚的提取回收率下降，以純乙腈提取時其回收率在50%以下。其余絕大部分NSAIDs以60%乙腈水溶液為提取溶劑時的回收率均達到80%以上，提取效果較佳。綜合多組分的提取效果，最終選用60%乙腈水溶液作為提取溶劑。

2.2 色譜條件的優化

本研究考察了不同流動相體系，包括2 種有機相（甲醇、乙腈）、3 種流動相添加劑（乙酸銨、甲酸銨、甲酸）對18種NSAIDs色譜分離的影響。結果表明，以甲醇為有機相時，氟芬那酸丁酯的洗脫時間超過20 min；乙腈的洗脫能力強于甲醇，以乙腈為有機相時，18 種目標物在20 min 內均被洗脫出來，且各化合物分離良好，因此選擇乙腈為有機相。根據前期文獻研究［23］，在質譜ESI＋掃描模式下，甲酸可促進［M+H］+生成，同時流動相中加入揮發性鹽也能夠提高化合物的離子化效率，故本實驗進一步考察了乙腈與水、乙酸銨、甲酸銨、甲酸水溶液等多種流動相條件下的色譜分離效果。結果顯示：在水相中加入0.1%甲酸，絕大多數化合物的離子化效率提高，且在有機相中加入0.1%甲酸可進一步改善18 種NSAIDs 的色譜行為；在0.1%甲酸水中加入乙酸銨或甲酸銨溶液時，非那西丁、安替比林、4-甲氨基安替比林、艾瑞昔布的離子響應均下降。因此確定以0.1%甲酸水與0.1%甲酸乙腈為流動相。

由于18 種NSAIDs 的分子結構和化學性質存在差異，實驗考察了18 種物質在Waters ACQUITY UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）、Waters ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）、CAPCELL CORE C18（100 mm×2.1 mm，2.7 μm）、ZORBAX Eclipse Plus C18（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）4 種色譜柱上的分離效果。結果顯示，采用 BEH C18色譜柱時，美洛昔康、氯諾昔康的峰形較好，不拖尾。此外選用100 mm 色譜柱比50 mm 色譜柱更能實現有效分離，本實驗選擇BEH C18柱進行色譜分離。

實驗發現，純乙腈溶解時，部分目標物不能在色譜柱上很好的保留洗脫，因此將對照品混合溶液等比例稀釋以降低溶劑效應，改善色譜行為。分別考察了不同體積分數的乙腈水溶液（0%、20%、50%、60%、80%、90%、100%）作為進樣溶劑時的色譜分離效果。結果表明，當乙腈比例降至60%時，非那西丁、安替比林、普拉洛芬、舒林酸的峰形得到改善，其余化合物的峰形均正常。但當乙腈比例降至60%以下時，絕大多數化合物的質譜響應顯著下降。綜合考慮，選用60%乙腈水溶液作為稀釋溶液。

2.3 質譜條件的優化

18 種NSAIDs 均含有電負性基團，在質譜ESI＋掃描模式下易結合氫離子形成準分子離子［M+H］+。在優化的色譜條件下，以UPLC-Q-TOF MS 的一級MS采集模式對目標化合物的單個對照品溶液進行全掃描，通過優化毛細管出口電壓以獲得最佳響應一級母離子，確定各化合物的保留時間，然后在Target MS/MS 采集模式下對18 種NSAIDs 進行掃描，設定碰撞能量分別為10、20、40 V，獲得18 種NSAIDs 的母離子和子離子圖譜，得到離子精確質量數和豐度比。將各化合物在3種碰撞能量下的子離子譜圖導入PCDL軟件中，結合各化合物名稱、分子式、分子量、結構式mol文件、CAS號、保留時間等數據構建18種NSAIDs的篩查數據譜庫。圖2為18種NSAIDs混合對照品溶液在最優條件下的提取離子流色譜圖。從圖中可以看出，18 種NSAIDs 色譜干擾少，具有較好的分離度和靈敏度，有利于后續準確定量。

圖2 18種化合物的提取離子流色譜圖Fig.2 Extract ion chromatogram of 18 compounds peak identification：1.acetamidophen；2.4-methylamino-antipyrine；3.aminophenazone；4.antipyrine；5.phenacetin；6.pranoprofen；7.piroxicam；8.lornoxicam；9.propyphenazone；10.cinchophen；11.loxoprofen sodium；12.sulindac；13.ketoprofen；14.meloxicam；15.imrecoxib；16.indometacin；17.aceclofenac；18.ufenamate

2.4 方法學評價

2.4.1 基質效應考察化妝品的基質較為復雜，樣品分析時常存在基質效應，表現為目標離子響應抑制或增強，影響分析結果的準確性。消除基質效應的方法包括同位素內標校正、基質匹配標準曲線、加入分析保護劑等，其中基質匹配標準曲線法操作較為方便［24］。本實驗通過對膏霜類和水劑類化妝品的空白基質匹配標準曲線與純溶劑標準曲線的斜率之比進行比較。若ME<100%，表明基質對分析物存在抑制作用；若ME>100%，表明基質對分析物存在增強作用；若ME=100%，表明不存在基質效應。結果表明，經該前處理方法處理后，4-甲氨基安替比林和氨基比林在水劑化妝品基質中存在基質增強效應，其余組分在兩種基質中均存在基質抑制效應（見圖3）。為克服基質效應，采用基質匹配工作溶液定量分析。

圖3 18種化合物的基質效應Fig.3 Matrix effects of 18 compounds

2.4.2 線性范圍、檢出限與定量下限本實驗分別采用膏霜和水劑化妝品空白樣品為基質，配制混合基質標準工作溶液，以化合物的質量濃度（μg/L）和峰面積進行線性擬合，繪制基質匹配標準工作曲線。18種NSAIDs的線性范圍、檢出限和定量下限見表2。結果表明，非那西丁、安替比林、異丙安替比林、氨基比林、辛可芬、普拉洛芬、吡羅昔康、美洛昔康、氯諾昔康的線性范圍為2.00～100.00 μg/L，其余9種化合物的線性范圍為5.00～200.00 μg/L，相關系數（r2）均大于0.99。將18種NSAIDs混合基質標準工作溶液逐級稀釋至信噪比（S/N）≥3 時確定檢出限，S/N≥10 時確定定量下限［25］，得到18 種NSAIDs 的檢出限為0.001～0.050 μg/g，定量下限為0.004～0.150 μg/g。本方法具有較高的靈敏度，適用于膏霜類和水劑類化妝品中18種NSAIDs的測定。

2.4.3 回收率與相對標準偏差分別選取膏霜和水劑化妝品空白基質樣品，進行0.5、1、2.5 μg/g 3個水平的加標回收實驗，每個濃度水平平行測定6次，計算18種NSAIDs的平均回收率。在相同實驗條件下，連續3 天每天測定6 次，計算18 種NSAIDs 的日內和日間相對標準偏差（RSD）。表3 結果表明，膏霜及水劑兩種基質在3 個加標水平下的平均回收率為70.7%～116%，日內RSD（n=6）為0.70%～7.5%，日間RSD（n=3）為3.0%～14%。

表3 18種化合物的回收率及相對標準偏差Table 3 Recoveries and relative standard deviations of the 18 compounds

2.5 實際樣品測定

在銷售環節采購500 批次化妝品，樣品種類包括嬰幼兒類、祛痘類、祛斑美白類、舒緩類等，樣品性狀為無色透明液體、無色凝露、白色膏霜等。應用本方法進行快速篩查檢驗，在3 個嬰幼兒類化妝品中檢出對乙酰氨基酚。采用Agilent Q-TOF 的Target MS/MS 采集模式進行質譜分析，用儀器自帶軟件對樣品中化合物的保留時間、母離子及碎片離子精確質量信息、同位素豐度比等與自建譜庫進行匹配。設置保留時間偏差為±0.2 min，母離子精確質量數偏差為10 ppm，同位素豐度比差異<5%及其它打分參數。如圖4所示，以其中一個樣品為例，該樣品在3.053 min處出峰，與對照品的保留時間相對應，一級質譜圖中存在m/z152.070 4，對應對乙酰氨基酚的［M+H］+峰，且與譜庫中對乙酰氨基酚信息一致，初步判斷其為陽性樣品。

圖4 陽性樣品中對乙酰氨基酚的提取離子色譜圖（A）與一級質譜圖（B）Fig.4 Extracted ion chromatogram（A） and MS spectrum（B） for acetaminophen in a positive sample

樣品的碎片離子圖譜與對乙酰氨基酚對照品的碎片離子圖譜見圖5，通過與對乙酰氨基酚對照品的二級質譜圖對比，發現該樣品在高能量通道下既存在對乙酰氨基酚的分子離子峰，又存在二級碎片離子m/z93.033 1 和m/z65.038 4，與對照品的碎片離子圖鏡相匹配達90%以上，質量數偏差小于10 ppm，通過保留時間、母離子、同位素豐度比、碎片離子等對比確證該樣品含有對乙酰氨基酚。通過一級母離子定量分析，3個樣品中對乙酰氨基酚的檢出含量分別為785、13 822、11 491 μg/g。

圖5 對乙酰氨基酚陽性樣品（A）和對照品（C）的二級質譜圖及鏡像對比圖（B）Fig.5 MS/MS spectra for acetaminophen from positive sample（A） and standard（C） and mirror comparison spectrum（B）

3 結 論

本研究采用UPLC-Q-TOF MS 建立了化妝品中18 種NSAIDs 的篩查和測定方法，經實際樣品考察，該方法前處理步驟簡單高效、準確度好、分析速度快，可用于大批量化妝品中18 種NSAIDs 的快速定性定量分析。目前關于化妝品中非甾體抗炎藥物檢驗檢測的研究尚少，本方法在一定程度上可為化妝品風險識別提供技術支持。