LY294002通過PI3K/Akt通路對結直腸癌RKO細胞增殖及凋亡的影響

張恒 李康寧 董海峰 鄭英斌

結直腸癌（Colorectal cancer，CRC）是最常見的消化道腫瘤之一，其發病率和死亡率均較高，目前仍缺乏有效的治療方法來改善患者預后[1]。我國CRC 的發病率和死亡率也逐年上升，給社會及患者帶來了巨大的負擔[2]。CRC 的臨床治療方式主要是手術治療、藥物治療及放射治療等，對于早期CRC 一般采用手術治療，為防止術后出現復發、再發、轉移等，通常于術后周期性使用藥物治療；而對于中晚期患者，采取手術治療或在術前通過新輔助治療縮小腫瘤，以為進一步手術提供可能，或是通過一系列藥物治療來減緩、控制病情發展[2，3]；因此，藥物在CRC 的治療中有極其重要的作用，而通過研究更有效的藥物制劑對于臨床診療意義重大。大量研究已證實PI3Ks 信號級聯反應的過度激活是癌癥發展的標志，尤其是I 類PI3Ks，當I 類（p110α、p110β、p110γ 和p110δ）催化亞基與P85 調節亞基結合時，它們的激活導致Akt 的蘇氨酸（Thr308）和絲氨酸（Ser473）磷酸化，從而激活mTOR，進而在腫瘤的發生和發展中發揮重要作用[4，5]。因此，PI3K/Akt 通路在CRC 的研究中是不可忽視的；Bcl-2/Bax 是調控細胞凋亡的重要基因，而PI3K/Akt通路與Bcl-2/Bax 的表達關系密切[6]，需要進一步探究CRC 中該通路是否顯著改變了Bcl-2/Bax 的表達量。本研究在CRC RKO 細胞中，采用LY294002抑制PI3K/Akt 通路的激活發現RKO 細胞的增殖能力削弱，基于此，作者對相關機制進行研究，為LY294002 在人CRC 的治療應用方面提供實驗基礎和理論依據，并為其他藥物治療的可能性提供方向和指引。

1 材料與方法

1.1 材料本研究收集了2019 年1 月～2020 年12月期間我院收治并確診的CRC 并進行手術的患者的癌組織（71 例）及癌旁組織（48 例）蠟塊標本。本研究經我院醫學倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。購買人CRC RKO 細胞（中國科學院上海細胞研究所），DMEM 細胞培養液（Gibco 公司），10%胎牛血清（FBS，杭州四季青生物材料有限公司），LY294002（Gibco 公司），CCK-8 試劑盒（碧云天生物技術研究所公司），p-Akt、Akt、Bax、Bcl-2、GAPDH 一抗（Cell Signaling 公司），過氧化物酶標記山羊抗兔IgG 及ECL 高靈敏度化學發光試劑盒（碧云天生物技術研究所）；凝膠成像儀（美國Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 HE 染色 標本均經福爾馬林液固定，常規脫水、石蠟包埋，5μm 厚切片，將切片放置65℃烘烤30min。放置于二甲苯中脫蠟，5min/次，共操作3 次，依次放置于無水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、75% 乙醇中，最后用清水沖洗，30s/次，時間控制在10min 內進行蘇木精染液染色，自來水洗，采用1%鹽酸乙醇分化液分化數秒，自來水沖洗，0.6%氨水反藍，15min 以上流水沖洗，細胞核顏色變為藍色，放置伊紅液（1%）染色60s，自來水略洗，依次放置于85%乙醇、95%乙醇、95%乙醇、無水乙醇中進行脫水，30s/次，二甲苯透明，1min/次，共操作3 次，蓋片封片后于顯微鏡下觀察。

1.2.2 免疫組化 標本均經福爾馬林液固定，常規脫水、石蠟包埋，5μm 厚切片，將切片放置65℃烘烤30min。放置于二甲苯中脫蠟，5min/次，共操作3次，依次放置于無水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇中，最后用清水沖洗，30s/次。經抗原修復后，置于3%過氧化氫室溫孵育20min 以消除內源性過氧化物酶的活性。清洗后，將切片置于5%BSA中，37℃，封閉2h。一抗、二抗及DAB 染色劑均按說明書配置。蘇木精染液染色采用1%鹽酸乙醇分化液分化數秒，自來水沖洗，0.6%氨水反藍，15min以上流水沖洗，細胞核顏色變為藍色后，再次透明化，樹膠封存。免疫組化評估：陽性細胞百分比評分：無陽性細胞為0 分，陽性細胞1%～25%為1 分，26%～50%為2 分，51%～75%為3 分，76%～100%為4 分。染色強度評分：無染色為0 分，弱染色為1 分（+），中等強度染色為2分（++），強染色為3分（+++）?？傇u分=陽性細胞百分比×染色強度評分，0～4 分為p-Akt 低表達，5～12 分為p-Akt 高表達。

1.2.3 細胞培養與傳代 采用DMEM 完全培養基培養RKO 癌細胞株（含10% 胎牛血清和1% 青霉素-鏈霉素溶液），待RKO 細胞在生長到大約90%后傳代。

1.2.4 細胞分組 取對數生長期細胞1×105個/mL接種于細胞培養瓶。參照細胞學預實驗結果選取藥物濃度及分組，將實驗細胞分為3 組：①空白對照組（Blank 組），僅有DMEM 完全培養基培養；②陰性對照組（DMSO 組）：向DMEM 完全培養基中加入二甲基亞砜（DMSO）；③陽性對照組(LY294002 組)：向DMEM 完全培養基中加入終濃度為20μmol/L的LY294002。

1.2.5 對細胞增殖的影響 將RKO 細胞（3×103細胞/孔）接種于96 孔板，根據實驗分組處理或不處理24、48、72h。每孔加入10μL CCK-8 溶液至96 孔板，細胞培養箱內繼續孵育2h，于入射光波長450nm 處測定吸光度值，實驗重復3 次。

1.2.6 凋亡實驗 取處于對數生長期細胞，按實驗分組進行不同處理，將各組的RKO 細胞消化離心（1 000r/min，4℃，10min）后收集至15mL 離心管中。每管加入約2mL PBS 緩沖液輕輕洗滌管內細胞，洗去雜質，再次離心，棄去上清，每管加入500μL 結合液，于避光條件下加入FITC 和PI 染料混勻后立即上機進行檢測。采用Flowjo 10.0 軟件進行統計分析。

1.2.7 Western blot 檢測Akt、p-Akt、Bax 和Bcl-2 表達 將各組細胞置于細胞培養箱中培養48h 后分別收集細胞，提取細胞總蛋白，以GAPDH 為內參，BCA 定量分別得出樣品蛋白濃度。配制分離膠和濃縮膠，調整蛋白上樣濃度一致，先將電壓調至80V使蛋白樣品下沉至分離膠起始部，隨后調整電壓至120V（觀察電泳時確認電壓是否穩定，條帶是否整齊下壓），當樣品臨近底部時終止電泳，將PVDF 膜浸泡在含5%脫脂奶粉的TBST 中，在小搖床中封閉1h 后，加一抗4℃孵育過夜，按說明書比例室溫孵育二抗2h，隨后用凝膠成像儀進行顯影曝光并記錄灰度值，蛋白相對含量=目的蛋白灰度值/內參蛋白灰度值。

1.3 統計學分析采用 SPSS 16.0 統計學軟件分析數據，計量資料組間比較采用t檢驗，連續變量的多組間比較采用重復測量的方差分析，非連續變量的多組間比較采用單因素方差分析，用表示；計數資料組間比較采用χ2檢驗，用率表示。P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 p-Akt 在人CRC 組織中的表達情況我們對納入的CRC 患者的組織進行HE 染色和免疫組化分析。p-Akt 陽性定位在CRC 細胞細胞質中，結果如圖1 所示，71 例CRC 患者RKO 細胞中p-Akt 蛋白高表達者60例（84.51%），低表達者1例（15.49%）；48 例CRC 患者癌旁組織細胞中p-Akt 蛋白高表達者10 例（20.83%），低表達者38 例（79.17%）；患者CRC 組織中p-Akt 高表達率較癌旁組織顯著升高，差異具有統計學意義（χ2=47.937，P＜0.0001）。

2.2 LY294002 對CRC RKO 細胞增殖的影響CCK-8法對各組進行細胞增殖實驗。結果如表1 所示，LY294002 組RKO 細胞的增殖較其他兩組受限，活力下降，且隨著LY294002 作用時間的延長，LY294002 組的RKO 細胞活力持續低下，且差異均具有統計學意義（P＜0.05）。

表1 各組中RKO 細胞的增殖情況

2.3 LY294002 對CRC RKO 細胞凋亡的影響根據細胞凋亡實驗結果如圖2，與Blank 組及DMSO組相比，LY294002 組的RKO 細胞凋亡數量明顯增多，差異具有統計學意義（P＜0.0001）。

圖2 LY294002 對CRC RKO 細胞凋亡的影響注：與Blank 組和DMSO 組比較，****P＜0.0001

2.4 LY294002 對CRC RKO 細胞PI3K/Akt 信號通路的影響為了進一步驗證各組RKO 細胞的PI3K/Akt 信號通路的表達情況，采用 Western blot法檢測各組細胞中p-Akt、Akt、Bax 和Bcl-2 的蛋白表達變化，結果顯示，LY294002 組與其他兩組相比，Akt 的總蛋白無明顯變化，差異無統計學意義（P＞0.05）；p-Akt、Bcl-2 明顯降低，Bax 表達水平顯著增高，且差異均具有統計學意義（P＞0.05）。見圖3。

圖3 各組RKO 細胞Akt、p-Akt、Bax、Bcl-2 蛋白表達檢測結果

3 討論

CRC 發病率居全球惡性腫瘤第3 位，且不斷提高。近年來，雖然臨床醫學水平發展迅速，CRC 的早期篩查及臨床治療方案多樣化并快速發展，但CRC 患者的生存率卻未得到顯著提高；現今CRC 臨床治療以手術及化學治療為主，據相關研究顯示，CRC 患者對相關化學藥物耐藥是生存率降低的主要因素之一[7～9]；相關藥物治療在CRC 治療方案中扮演著重要角色，這些藥物大多通過調控癌細胞生物學行為而發揮作用，因此關于某些生物學標志物和治療靶點的研究就顯得尤為重要[10]。LY294002是第一種人工合成的PI3K/Akt 通路特異性抑制劑，通過競爭性抑制PI3K 的ATP 結合位點來阻礙PI3K 表達[11]，其作為PI3K 的廣譜抑制劑，許多研究表明其對食管癌、腫瘤相關血管內皮細胞及干細胞，卵巢癌、肝細胞癌、乳腺癌、結腸癌等腫瘤細胞有抑制及減滅作用[12～16]。對某些臨床聯合用藥（降糖藥物，化療藥物、靶向藥物等抗腫瘤藥物）及一些提取物（從某些植物、動物、細菌等中提?。┭芯堪l現，與單獨使用各種藥物相比，聯合用藥能夠增強對腫瘤細胞生長抑制及促進腫瘤細胞凋亡等作用。在CRC 方向的LY294002 與PI3K/Akt 通 路相關研究中，少有關于PI3K/Akt 通路與其密切相關的Bcl-2/Bax 蛋白表達情況相聯合的研究與思考，本研究探索LY294002 通過PI3K/Akt 通路抑制CRC RKO 細胞增殖并促進其凋亡的機制。

PI3K/Akt 通路是重要的細胞內信號傳導通路，已被廣泛證明參與細胞生長、增殖、凋亡和分化調控等多種代謝過程。PI3K 作用于Akt，使其發生磷酸化從而被激活，磷酸化的Akt 能夠調控c-myc 等促進細胞增殖，也能促進細胞成熟、腫瘤血管生成等；此外，PI3K/Akt 是多條信號通路中的中心位點之一，還可被EGFR、RAS、IRS1、JAK、FAK、c-met等多種上游分子激活[17，18]。這種信號的異常激活已在包括食管癌、腫瘤相關血管內皮細胞及干細胞，卵巢癌、肝細胞癌、乳腺癌、結腸癌等在內的人類癌癥中廣泛報道[19，20]；且有報道稱，一些抗癌藥物可以通過阻斷PI3K/Akt 通路抑制腫瘤細胞增殖[21]。Bcl-2/Bax 為人體內各種細胞凋亡因子，調控著細胞的凋亡過程，線粒體是人體細胞中一個細胞器，也是內在凋亡途徑的中心，其受Bcl-2/Bax 的調控；Bax 是促凋亡因子，在調控細胞凋亡方面有極其重要的作用，是Bcl-2 基因家族的一種，其編碼翻譯的Bax 蛋白為凋亡啟動程序的一個上游蛋白，促使細胞凋亡；Bcl-2 是抗凋亡因子，可與Bax 拮抗，從而抑制細胞凋亡；蛋白Bax 可結合Bcl-2 蛋白并拮抗Bcl-2 蛋白，Bcl-2 與Bax 在調控凋亡方面相互拮抗，相互制約，共同維護細胞正常更替、凋亡的過程，故可通過調整兩者強弱關系打破平衡，控制凋亡進程[22，23]。本研究發現CRC 組織較癌旁組織的p-Akt 水平顯著升高；根據細胞增殖實驗，LY294002 影響下的RKO 細胞活力較另外兩組明顯降低，差異具有統計學意義；根據細胞凋亡實驗，LY294002 影響下的RKO 細胞凋亡數量較對照組明顯增多，差異具有統計學意義；同時，根據Western blot 檢測結果，各組Akt 總蛋白結果無明顯差異，LY294002 組p-Akt 蛋白較另外兩組明顯降低，表明LY294002 抑制了PI3K/Akt 通路，LY294002 組Bax 表達水平顯著增高，Bcl-2 表達水平顯著降低，并抑制了CRC RKO 細胞的增殖，促進其凋亡；因此，LY294002 是通過促進Bax、抑制Bcl-2 的表達，從而誘導細胞凋亡。本研究中Bcl-2/Bax 所受調控唯一性以及力度大小還無法完全確認，LY294002是否通過其他途徑影響CRC RKO 細胞的增殖、凋亡也無法確認；對于藥物敏感強弱的機制也仍不清楚，有待于進一步的研究探索。

綜上所述，本研究探討了LY294002 作用于CRC RKO 細胞后其增殖與凋亡表現，發現LY294002 明顯抑制CRC RKO 細胞的增殖，促進其凋亡，顯著殺滅了CRC RKO 細胞，這與其能抑制PI3K/Akt 通路有關，也體現了Bcl-2/Bax 的重要性，表明LY294002 用于CRC 治療具有一定的價值，為CRC 的臨床用藥及藥理方向研究提供了思路。