頭孢曲松及其雜質對斑馬魚肝臟的毒性

張 銳，馬媛媛，韓 瑩，崇小萌，劉馨妍，謝廣云，梁一帆，姚尚辰，，張靖溥，

(1.中國醫學科學院/北京協和醫學院醫藥生物技術研究所，北京 100050；2.中國食品藥品檢定研究院化學藥品檢定所抗生素室，北京102629；3.中國疾病預防控制中心職業衛生與中毒控制所，北京 100050)

模式生物斑馬魚因自身繁殖能力強、生殖周期短、胚胎易獲得、已完成基因組測序及與人類基因的高度保守性等特點，廣泛應用于藥物篩選和安全性評價[1-2]。斑馬魚肝臟發育過程及肝功能均與人類高度相似，斑馬魚肝臟疾病模型已被廣泛應用于人類肝毒性評價實驗中[3-5]。

頭孢菌素類是以冠頭孢菌培養得到的天然頭孢菌素C 作為原料，經半合成改造其側鏈而得到的一類抗生素，屬于β-內酰胺類抗生素[6]。頭孢曲松是第三代頭孢菌素類藥物，對多種革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌具有強大的抗菌作用。頭孢曲松偶見肝腎功能異常及血液系統改變，如中性粒細胞下降、血小板下降等，肌注部位可能有疼痛反應，偶見靜脈炎[7]。由于其藥物合成步驟繁雜，藥物本身不穩定較容易產生雜質，而這些雜質與藥物的毒性反應相關，容易使藥效降低、抗菌活性減弱，甚至可能會對人體產生不良反應。藥物自身帶入以及降解形成的雜質的毒性、安全性等方面的研究是藥品質量控制的重要依據[8]。

為了評估頭孢曲松及其雜質暴露是否會產生肝臟毒性，本文以AB 品系野生型斑馬魚和轉基因斑馬魚Tg(fabp10a：DsRed)作為實驗動物，初步探討頭孢曲松及其雜質造成斑馬魚肝損傷的機制，為深入研究頭孢曲松及其雜質造成人肝損傷的機制提供線索，并為藥物監管和風險評估提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 樣品頭孢曲松(純度83.9%)及其雜質A(純度100%)、B(純度100%)、C(純度99.3%)、D(純度100%)和E(純度100%)，均為白色粉末，且均由中國食品藥品檢定研究院提供，各受試物結構式見表1。油紅O染色試劑購自美國Sigma-Aldrich公司；甲醇購自國藥集團化學試劑有限公司。TRIzol 購自美國Invitrogen 公司；M-MLV反轉錄酶(M1708)購自美國Promega公司。

表1 頭孢曲松及其雜質A、B、C、D、E的結構式

1.1.2 溶液的配制及濃度采用新鮮配制的斑馬魚飼養液(1 L純水中加入0.3 g碳酸氫鈉和0.2 g海水晶)為溶劑，頭孢曲松及雜質A、B、C、D 每種物質均設置1、2、5 mmol/L 的3 個不同劑量組；雜質E 設置0.1、0.5、1 mmol/L的3個劑量組。所有受試物現用現配。

1.1.3 實驗動物AB 品系(zebrafish，Danio rerio，AB strain)野生型和肝臟特異性熒光標記的Tg(fabp10a：DsRed)轉基因斑馬魚嚴格按照以下條件飼養：溫度為(28.5±1) ℃，飼養液電導率為480～550 μs/cm，光照14 h和黑暗10 h循環進行。挑選正常成魚，按雌雄比1∶2的交配方式進行繁殖。收集受精后72 h的幼魚，用于后續實驗。

1.2 實驗方法

實驗分為對照組和受試物組，每組30枚幼魚，受試物組用不同濃度頭孢曲松或雜質溶液處理；在正常飼養液中發育的同批斑馬魚幼魚為對照組。

1.2.1 野生型斑馬魚肝毒性實驗選取野生型斑馬魚幼魚，分別用頭孢曲松及其雜質處理2 d 后，取受精后120 h 的幼魚(每組至少30 枚)，顯微鏡下活體觀察幼魚肝臟形態，計算肝臟的面積尺寸，并通過與對照組比對，用歸一化的肝臟面積百分率判斷頭孢曲松及其雜質肝毒性。實驗重復3次。

歸一化的肝臟面積百分率=受試物組肝面積/對照組肝面積×100%

1.2.2 轉基因斑馬魚肝毒性實驗選取轉基因斑馬魚幼魚，分別用不同濃度的頭孢曲松及其雜質處理2 d后，取受精后120 h 的幼魚(每組至少30 枚)，熒光顯微鏡下活體觀察幼魚肝臟熒光發光情況，記錄幼魚肝臟熒光強度及面積等數據，并通過與對照組比對，用歸一化的肝臟面積百分率判斷頭孢曲松及其雜質肝毒性。實驗重復3次。

1.2.3 斑馬魚整體油紅O染色實驗選取野生型斑馬魚幼魚，用不同濃度的頭孢曲松及其雜質分別處理2 d后，取受精后120 h的幼魚(每組至少20枚)用PBS沖洗3次，轉入4%多聚甲醛中，4 ℃下固定過夜；次日將斑馬魚樣品從多聚甲醛中取出，于70%乙醇溶液中漂洗5 s 后放入新鮮配制的油紅O 工作液(油紅O儲備液6 mL，加蒸餾水4 mL，混合，靜置10～20 min，吸取上層液體)中染色5～10 min。用70%乙醇溶液洗去多余染液，PBS 沖洗1 遍，拍照。對幼魚肝臟形態和脂肪含量變化進行觀察，并通過與對照組比對判斷頭孢曲松及其雜質肝毒性情況。實驗重復3次。

1.2.4 斑馬魚轉錄組測序及差異表達基因篩選頭孢曲松雜質B、D和E不易獲得且難溶于水，受試物量不足以進行轉錄組學測定，因此只對頭孢曲松、雜質A及雜質C 進行轉錄組測序分析，測序濃度皆為5 mmol/L。取頭孢曲松及其雜質A 和C 處理2 d 后的野生型斑馬魚幼魚各100 枚，用PBS 清洗3 遍后置于含200 μL RNA later 試劑的EP 管中，隨后置于-20 ℃冰箱備用。用TRIzol 試劑提取總RNA，作為mRNA 測序的建庫起始樣品。建庫測序以及測序數據分析由上海美吉生物醫藥科技有限公司完成。

1.2.5 差異表達基因的KEGG富集分析得到差異表達基因后，為進一步了解差異表達基因的功能，闡述其在分子水平上的作用，利用KOBAS 3.0基于基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)數據庫進行信號通路富集分析，Bonferroni校正P＜0.05。

1.3 統計學方法

采用GraphPad Prism 8.0.2 統計軟件對數據進行分析。實驗結果以表示，應用SPSS 26.0 進行統計學分析。采用單因素方差分析確定統計學差異，組間兩兩比較方差齊性時用LSD 法，方差不齊時用Dunnettt檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 頭孢曲松及其雜質對野生型斑馬魚肝臟表型的影響

如圖1 所示，與對照組相比，頭孢曲松及其雜質誘導的野生型斑馬魚幼體肝毒性具有劑量-效應關系(r≥0.993，P＜0.01)。正常對照組斑馬魚幼魚肝組織結構清晰，呈淺紅色或棕紅色。經過不同濃度的受試物處理后，隨著受試物濃度的增加，出現肝臟透明度下降、顏色變暗呈棕色或黑色，肝臟組織紋理無定形及面積改變等現象，顯示頭孢曲松及其雜質可導致肝臟變性。

圖1 頭孢曲松及其雜質對野生型斑馬魚肝臟表型的影響

頭孢曲松及其雜質引起的肝毒性表型各不相同。與對照組相比，雜質B(r=0.999，P＜0.01)、雜質D(r=0.993，P＜0.01)和雜質E(r=0.994，P＜0.01)引起斑馬魚肝臟面積隨濃度降低而下降。1 和2 mmol/L 頭孢曲松及其雜質A 和雜質C 均導致斑馬魚幼魚肝臟面積增大，1 mmol/L 雜質C組與對照組間的差異具有統計學意義(P＜0.01)；而高濃度5 mmol/L 又會引起斑馬魚幼魚肝臟區域減小(均為P＜0.01)，提示其高濃度下有可能誘發肝萎縮。歸一化的肝臟面積百分率結果見圖2。

圖2 頭孢曲松及其雜質處理野生型斑馬魚后的歸一化肝臟面積百分率分析

2.2 頭孢曲松及其雜質對轉基因斑馬魚肝臟發育的影響

如圖3 所示，對照組斑馬魚幼魚健康肝組織結構清晰，形態正常。與對照組比較，頭孢曲松及其雜質均可誘導轉基因斑馬魚幼體肝臟形態發生改變，其中1 和2 mmol/L 頭孢曲松及雜質A 和C 均主要導致斑馬魚肝臟熒光區擴大或熒光強度增強，高濃度5 mmol/L組熒光面積減小，差異均具有統計學意義(P＜0.05 或P＜0.01)，提示頭孢曲松及雜質A和C有可能在高濃度下誘發肝萎縮。而雜質B、D和E均導致斑馬魚幼魚熒光區減小或熒光強度減弱(P＜0.05 或0.01)。歸一化的肝臟面積百分率結果見圖4。

圖3 頭孢曲松及其雜質對轉基因斑馬魚肝臟表型的影響

圖4 頭孢曲松及其雜質處理轉基因斑馬魚后的歸一化肝臟面積百分率分析

2.3 頭孢曲松及其雜質對野生型斑馬魚幼魚肝脂肪變性的影響

油紅O 整體染色法檢測野生型斑馬魚幼魚肝脂肪變性情況如圖5 所示。對照組斑馬魚幼魚肝臟處無染色顏色或顏色較淺，即無脂肪堆積。與對照組相比，頭孢曲松及其雜質A 和C 可導致幼魚肝臟區域顏色隨著受試物濃度的升高逐漸加深甚至高濃度組呈現黑色，雜質B、D和E處理組肝臟面積減小顏色變暗，脂肪主要堆積在卵黃囊處，且隨給藥濃度的增加現象越明顯。

圖5 頭孢曲松及其雜質對斑馬魚肝臟脂肪含量的影響

2.4 測序及差異表達基因的篩選結果

測序結果如圖6 所示，頭孢曲松給藥組共篩選出735 個差異表達基因，其中有553 個基因表達上調，182個基因表達下調；雜質A組共有237個差異表達基因，其中93 個上調，144 個下調；雜質C 組共有237個差異表達基因，其中有94 個上調，143 個下調。此結果表明在給予頭孢曲松及其雜質A 和C 后，斑馬魚肝臟中基因的表達量發生了顯著變化。

圖6 頭孢曲松及其雜質A和C處理后的差異表達基因數量

2.5 差異表達基因的KEGG富集分析

分別對頭孢曲松及其雜質A 和C 處理組差異表達基因進行KEGG 通路分析，結果見圖7。頭孢曲松給藥組主要富集到10條信號通路，包括代謝途徑、類固醇激素生物合成、卟啉和葉綠素代謝葡萄糖酸鹽的相互轉化等相關通路。雜質A 組主要富集到3 條信號通路，包括代謝途徑、色氨酸代謝和心肌收縮。頭孢曲松雜質C 組主要富集到6 條信號通路，包括MAPK 信號通路、鈣信號通路、核糖體等相關通路。

圖7 頭孢曲松及其雜質A和C處理組差異表達基因的KEGG富集通路直方圖

3 討 論

斑馬魚與哺乳動物具有相似的生理和功能，可作為篩選候選藥物和化學品的毒性及安全性評估的體內模型[9-10]。斑馬魚同哺乳動物模型相比，具有與人類高度遺傳保守性，可以用于篩選藥物在組織中的靶向活性，提供有關化合物毒性等特性信息[11-12]。

頭孢曲松屬于第三代頭孢菌素，是世界衛生組織基本藥物標準清單中推薦的最安全有效的藥物之一[13]。但由藥物生產工藝或原料帶入的雜質，或在貯存過程中產生的雜質等可影響藥品的安全性和有效性[14-15]。因此，本文對頭孢曲松及其雜質引起的肝毒性進行了初步研究。

結果顯示，隨著受試物濃度的增加野生型和轉基因斑馬魚的肝臟毒性也增加，肝臟發黑現象逐漸嚴重，肝臟面積改變現象逐漸明顯。頭孢曲松及其雜質均可誘導轉基因斑馬魚幼魚肝臟形態發生改變，頭孢曲松雜質B、D和E引起斑馬魚肝臟區域減小、熒光強度的減弱，肝臟位置顏色變暗，脂肪堆積于卵黃囊處。而1 和2 mmol/L 頭孢曲松及其雜質A 和C 均導致斑馬魚幼魚肝臟區域增大，熒光面積增大，肝臟區域顏色變暗；但高濃度5 mmol/L又會引起斑馬魚幼魚肝臟區域減小，熒光面積減小，肝臟區域顏色呈黑色。這些現象提示頭孢曲松及其雜質暴露可造成斑馬魚肝臟功能的變化，有可能誘發肝變性和肝萎縮。

轉錄組測序技術可捕捉不同組織的轉錄組動態變化，通過分析不同因素作用下的基因在RNA水平表達的差異，可將顯著差異表達的基因與某些生物學功能聯系起來，用于檢測早期損傷標志物和分子調控機制的研究[16]。

因此本研究進一步提取頭孢曲松及其雜質A 和C處理組斑馬魚幼魚RNA進行高通量轉錄組測序，發現頭孢曲松給藥組有735 個基因的表達量發生變化，雜質A組共有237個差異表達基因，雜質C組共有237個差異表達基因。而分別對頭孢曲松及其雜質A 和C 差異表達基因進行KEGG 通路分析發現，此3 種不同樣品主要富集通路也存在差異。頭孢曲松給藥組主要富集到10條信號通路，包括代謝途徑、類固醇激素生物合成、卟啉和葉綠素代謝葡萄糖酸鹽的相互轉化等相關通路；雜質A 組主要富集到3 條信號通路，包括代謝途徑、色氨酸代謝和心肌收縮；雜質C 組主要富集到6 條信號通路，包括MAPK 信號通路、鈣信號通路、核糖體等相關通路。

本研究利用模式生物斑馬魚模型初步評價頭孢曲松及其雜質的肝毒性，結果表明頭孢曲松及其雜質暴露可造成斑馬魚肝臟功能的變化，有可能誘發肝變性和肝萎縮，本實驗結果為頭孢曲松及其雜質的急性毒理學分析提供了基礎數據。鑒于頭孢曲松臨床應用可能引起的肝損傷，本研究也為頭孢曲松的藥物監管和風險評估提供了參考。