自噬在α粒子輻射誘發人支氣管上皮細胞惡性轉化中的作用

楊 莉，邵 帥，武云云，王成芳，曲功霖，閆皓宇，茍 巧

(中國疾病預防控制中心輻射防護與核安全醫學所，輻射防護與核應急重點實驗室，北京 100088)

肺癌作為一種常見的惡性腫瘤，嚴重危害人類的身體健康。放射性氡及其子體是非吸煙者患肺癌的第一大危險因素[1]。氡的主要危害是短壽命子體衰變時不斷發射出的高能α粒子，這些α粒子會滯留在人體的呼吸道表面，對局部細胞產生照射，從而誘發肺癌[2]。隨著氡暴露與肺癌發生之間存在的密切關系被揭示，α粒子輻射致肺癌的分子機制研究越來越受到重視。

自噬是一種進化上古老且高度保守的分解代謝過程，主要通過各種細胞器形成自噬體并包裹細胞內待降解蛋白及受損細胞器與溶酶體融合成為自噬溶酶體，降解內容物，并將其循環利用或用于促進代謝途徑的過程。自噬對腫瘤的發生、發展具有雙重調節作用，既能抑制腫瘤的發生，減少細胞的DNA損傷和惡性增殖；亦能對腫瘤起保護作用，幫助腫瘤細胞在營養能量匱乏的環境下生存[3]。由于自噬在不同的生物學背景(癌癥類型)下可以產生抑癌或致癌作用，目前自噬對癌癥發生、發展的意義仍有爭議。

迄今為止，國內外對α粒子輻射誘發肺癌分子機制的研究主要圍繞癌基因過表達[4]，抑癌基因突變或表達下調[5-6]，DNA 損傷修復系統缺陷[7]，氧化/抗氧化失衡[2，8]幾方面進行，關于自噬在α粒子輻射誘發肺癌過程中的作用還未見報道。本研究利用永生化人支氣管上皮細胞BEP2D、α粒子照射BEP2D后的第24代細胞RH24(具有一定的惡性表型)及其惡性轉化細胞株BERP35T-1(具有明確的惡性表型)，分析α粒子輻射誘發BEP2D細胞惡性轉化中細胞自噬水平的變化；選擇惡性程度最高的BERP35T-1細胞，分別用自噬抑制劑CQ 和自噬激活劑Rapa 抑制和促進該細胞自噬后，檢測細胞的增殖、侵襲和遷移能力變化，旨在從自噬影響細胞惡性表型(增殖、侵襲和遷移能力)的角度，探討α粒子輻射誘發人支氣管上皮細胞惡性轉化的機制。

1 材料與方法

1.1 試劑及主要儀器

胎牛血清、LHC-8 培養基購自美國Gibco 公司；LC3B、P62 抗體購自Abcam 公司；LC3A/B 抗體購自Cell Signaling 公司；β-actin抗體購自北京中杉金橋公司；GAPDH 抗體購自上海Abmart 公司；蛋白定量試劑盒、硝酸纖維素膜、濃縮電泳液及轉膜液均購自北京普利萊公司；蛋白裂解液、發光檢測試劑盒購自美國Thermo公司；牛血清蛋白、胰蛋白酶和二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma 公司；CCK-8 試劑盒購自日本同仁公司；CQ 購自美國MCE 公司；Rapa 購自美國Abcam 公司；均用DMSO 助溶，作用細胞時對照組培養基中均含等體積DMSO。Transwell 小室購自美國Corning 公司。Primo Vert 倒置顯微鏡為德國蔡司公司產品，ChemiDoc XRS+發光檢測成像系統為美國Bio-rad 公司產品，JEM-1400 Plus 透射電子顯微鏡為日本電子公司產品。

1.2 細胞來源和培養

BEP2D 細胞為經HPV-18 永生化的人支氣管上皮細胞；RH24細胞為采用238PuO2沉積源α粒子1.5 Gy劑量照射BEP2D 細胞后的第24 代細胞，具有一定的惡性表型，但不能在裸鼠身上成瘤；BERP35T-1惡性轉化細胞系是用238PuO2沉積源α粒子1.5 Gy 劑量照射BEP2D細胞，連續傳35代后接種裸鼠，從成瘤細胞中克隆出來，具有明確的惡性表型，經病理專業人員鑒定為肺鱗癌細胞[9-11]。BEP2D、RH24、BERP35T-1 細胞均由原軍事醫學科學院二所四室周平坤和胡迎春老師惠贈。用LHC-8無血清培養基，在37 ℃、CO2體積分數為5%的條件下培養。BEP2D、RH24、BERP35T-1細胞每3 d更換1次培養基，每周傳代1次。

1.3 Western blot 檢測細胞內自噬相關蛋白LC3B和P62的表達

分別收獲指數生長期的BEP2D、 RH24 和BERP35T-1 細胞，或用不同濃度自噬抑制劑CQ(0、40、60 μmol/L)及自噬激活劑Rapa(0、12.5、25 pmol/L)分別作用BERP35T-1 細胞48 h，用細胞裂解液裂解細胞，震蕩5 min，于4 ℃、12 000 r/min離心10 min后，吸取上清液于-20 ℃保存，BCA法測定蛋白濃度，每個EP 管30 μg 蛋白，100 ℃變性5 min。配制不同濃度的分離膠和濃縮膠，各凝膠孔上樣量保持一致；電壓設置恒壓60 V 電泳30 min，溴酚藍進入分離膠后，調整電壓至80 V 電泳90 min；轉膜設置恒壓110 V，20 min，分離分子質量20 ku 以下的蛋白，20 min結束后取出小分子量膠和膜，再繼續轉膜50 min，在冰水浴中進行轉膜；在室溫中用BSA封閉液封閉1 h；加入LC3B、P62、GAPDH 對應的一抗及BSA 封閉液在4 ℃中孵育過夜，用TTBS 洗膜3 次；在室溫中用對應物種的二抗及BSA 封閉液孵育1 h，用TTBS 洗膜3 次，用發光顯跡液在凝膠成像儀上顯色。使用相應的內參(β-actin/GAPDH)作為對照，ImageJ軟件進行灰度分析，計算LC3B和P62的相對表達水平。

1.4 透射電鏡觀察細胞內自噬小體的變化

使用0.25%的胰蛋白酶分別消化BEP2D、RH24和BERP35T-1 細胞5 min，使用含10% FBS 的培養基終止消化，1 200 r/min 離心5 min 后去除上清，加入2.5%的戊二酸磷酸鹽緩沖液(pH為7.2～7.4)1 mL固定過夜。此后由北京大學醫學部電鏡平臺進行制樣，具體步驟為：使用0.1 mol/L 的PBS 緩沖液洗滌樣品3 次，每次10 min；再用1% OsO4-PBS 固定1 h，用ddH2O洗3次，每次15 min；再用30%、50%、70%、95%丙酮進行梯度脫水，接著用100%乙醇脫水3 次，每次10 min；然后將樣品以1∶1體積比轉移進丙酮中浸透3 h；將標本放于包埋介質中，37 ℃加熱24 h、48 ℃加熱24 h、60 ℃加熱24 h 聚合；然后將其切成50～70 nm 厚的薄片，用乙酸鈾酰和堿性檸檬酸鉛雙染色15 min，最后使用透射電子顯微鏡觀察細胞內自噬小體并拍照，根據其形態特征計數單位面積內自噬小體的數量。

1.5 CCK-8法檢測細胞的增殖情況

將指數生長期的BERP35T-1細胞按1×104個/孔接種于96 孔板中，24 h 后，用不同濃度CQ(0、40、60 mmol/L)及Rapa(0、25 pmol/L)分別作用BERP35T-1 細胞48 h，每個濃度點設立6 個復孔。細胞用含有10%CCK-8 的LHC-8 培養基于96 孔板中37 ℃孵育2 h后，室溫下振蕩孵育5 s，用酶標儀測定450 nm波長下各孔的吸光度值D(450)，計算細胞存活率。

細胞存活率=D(450)檢測組/D(450)空白對照組×100%

1.6 Transwell實驗檢測細胞的侵襲能力

提前一天將基質膠從-20 ℃冰箱中取出放置于4 ℃冰箱解凍，將基質膠和Opti-MEM 無血清培養基以1∶8 混合稀釋，向Transwell 小室中加入100 μL 的基質膠稀釋液，置于培養箱中聚合1 h。BERP35T-1細胞經CQ(0、40、60 μmol/L)及Rapa(0、25 pmol/L)分別作用后，用0.25%胰蛋白酶消化5 min，再使用含10% FBS 的培養基終止消化，1 200 r/min 離心5 min去除上清，用細胞計數器計數細胞密度，加入Opti-MEM 稀釋至3×105個/μL，取100 μL 細胞懸液加入Transwell 小室上室，下室加入600 μL 的LHC-8 培養基，放入37 ℃、CO2體積分數為5%的培養箱中培養48 h 后將小室放入無水甲醇中固定并透化30 min，ddH2O清洗3次后用Gimsa染液染色10 min，用棉簽輕輕擦拭上室未穿過的細胞。在100 倍鏡下每組隨機選取3 個視野進行拍照，并用ImageJ 軟件計數侵襲細胞數量。

1.7 劃痕愈合實驗檢測細胞的遷移能力

將BERP35T-1細胞接種在細胞培養皿中，待細胞匯合度達90%～100%，用200 μL槍頭垂直劃痕。使用PBS 清洗脫落細胞，用CQ(0、40、60 μmol/L)作用0、12 h 和24 h 或用Rapa(0、25 pmol/L)作用0 和12 h，將細胞置于100 倍鏡下于同一視野拍照記錄劃痕愈合狀態，每組觀察6 個視野，用ImageJ 軟件計算不同濃度CQ 或Rapa 作用不同時間點的劃痕寬度，并計算劃痕閉合率。

劃痕閉合率=(初始劃痕寬度-當前劃痕寬度)/初始劃痕寬度×100%

1.8 統計學方法

2 結 果

2.1 BEP2D、RH24、BERP35T-1細胞的自噬水平

LC3B是LC3四種亞型中在肺組織中表達差異最為顯著的蛋白[12]，LC3B-I 在胞漿中產生，在ATG7 等作用下和磷脂酰乙醇胺結合成LC3B-II，LC3B-II在自噬體形成階段被連接在自噬體外膜上，P62 作為自噬底物與LC3B-II 結合，在自噬溶酶體形成時P62 被降解[13]，因此，可以利用LC3B-II 和LC3B-I 蛋白的比值及P62 蛋白的表達水平代表細胞的自噬水平[14-15]。Western blot法檢測結果如圖1所示，與BEP2D細胞相比，RH24 細胞及惡性轉化的BERP35T-1 細胞內自噬標志物LC3B-II/I 的比值顯著升高(P＜0.01)，其底物P62 的表達減弱(P＜0.01)。且如圖2 所示，用透射電鏡觀察也發現，與BEP2D 細胞相比，RH24 細胞及惡性轉化的BERP35T-1細胞內單位面積自噬小體數量增加(P＜0.01)。說明在α粒子輻射誘發BEP2D細胞惡性轉化過程中，細胞自噬水平升高。

圖1 Western blot法檢測BEP2D、RH24、BERP35T-1細胞中自噬相關蛋白LC3B及P62的表達

圖2 透射電鏡觀察和分析BEP2D、RH24和BERP35T-1細胞中的自噬小體

2.2 自噬抑制劑CQ抑制BERP35T-1細胞自噬

CQ通過破壞溶酶體的酸性環境，阻止自噬小體和溶酶體融合，從而抑制自噬。在CQ的作用下，自噬體上的LC3B-II和自噬底物P62均不能被溶酶體降解，導致LC3B-II 和P62 蛋白的積累[16]。因此，CQ 抑制自噬的能力越強，LC3B-II 和P62 的蛋白水平越高，LC3B-II/I的比值也越高[17]。為確定CQ抑制自噬的合適濃度，將40 和60 μmol/L CQ 分別作用BERP35T-1 細胞48 h 后，經Western blot 檢測LC3B、P62、GAPDH的表達水平。結果如圖3所示，與對照組(0 μmol/L)相比，40和60 μmol/L CQ 作用48 h后BERP35T-1細胞內自噬標志物LC3B-II/I 水平明顯升高(P＜0.05)，自噬相關蛋白P62的表達水平也相繼升高(P＜0.01)，表明40和60 μmol/L CQ 均可顯著抑制BERP35T-1 細胞自噬，所以后續實驗采用40 和60 μmol/L CQ 作為抑制自噬的實驗濃度。

圖3 不同濃度CQ作用48 h對BERP35T-1細胞自噬相關蛋白表達的影響

2.3 自噬抑制劑CQ 對BERP35T-1 細胞增殖能力的影響

將40和60 μmol/L CQ 作用BERP35T-1細胞48 h后，存活率檢測結果如圖4所示，與對照組(0 μmol/L)相比，40 和60 μmol/L CQ 處理48 h 組細胞存活率均顯著降低，差異有統計學意義(P＜0.01)。說明CQ 可通過抑制自噬降低BERP35T-1細胞的惡性增殖能力。

圖4 不同濃度CQ作用48 h對BERP35T-1細胞增殖能力的影響

2.4 自噬抑制劑CQ 對BERP35T-1 細胞侵襲能力的影響

將40和60 μmol/L CQ 作用BERP35T-1細胞48 h后，用Transwell實驗檢測細胞的侵襲能力，結果如圖5 所示，與對照組(0 μmol/L)相比，40 和60 μmol/L CQ 作用48 h 后BERP35T-1 細胞的侵襲細胞數量均明顯減少(P＜0.01)。說明CQ 可能通過抑制自噬降低BERP35T-1細胞的侵襲能力。

圖5 不同濃度CQ作用48 h對BERP35T-1細胞侵襲能力的影響

2.5 自噬抑制劑CQ 對BERP35T-1 細胞遷移能力的影響

劃痕實驗檢測細胞的劃痕閉合率，結果如圖6 所示，與對照組(0 μmol/L)相比，40和60 μmol/L CQ 作用12 和24 h 后，BERP35T-1 細胞的劃痕閉合率均顯著降低，且CQ 濃度越高，作用時間越長，降低越顯著(P＜0.05)。說明CQ可通過抑制自噬降低BERP35T-1細胞的遷移能力。

圖6 不同濃度CQ作用12和24 h對BERP35T-1細胞遷移能力的影響

2.6 自噬激活劑Rapa促進BERP35T-1細胞自噬

哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是自噬通路的上游蛋白，mTOR 可與不同的蛋白質相互作用形成兩個不同的復合物，分別為mTORC1 和mTORC2，而Rapa 可以抑制mTORC1進而促進自噬[18]。為確定Rapa 激活自噬的合適濃度，將12.5和25 pmol/L的Rapa作用BERP35T-1細胞48 h后，經Western blot 檢測LC3B、P62、GAPDH 的表達水平。結果如圖7 所示，與對照組相比，12.5 pmol/L Rapa 對BERP35T-1細胞內LC3B-II/I 和P62蛋白表達水平的影響差異無統計學意義(P＞0.05)；25 pmol/L Rapa 處理組BERP35T-1 細胞內LC3B-II/I 水平明顯升高(P＜0.05)，P62 水平降低(P＜0.05)，表明25 pmol/L Rapa 可以顯著激活細胞自噬，因此后續實驗采用25 pmol/L Rapa作為激活自噬的實驗濃度。

圖7 不同濃度Rapa作用48 h對BERP35T-1細胞自噬相關蛋白表達的影響

2.7 自噬激活劑Rapa 對BERP35T-1 細胞增殖能力的影響

將25 pmol/L Rapa 作用BERP35T-1 細胞48 h 后，用CCK-8 試劑盒檢測細胞的存活率，結果如圖8 所示，與對照組(0 mmol/L)相比，25 pmol/L Rapa處理組細胞存活率明顯升高，差異有統計學意義(P＜0.01)。說明Rapa 可通過促進自噬提高BERP35T-1 細胞的惡性增殖能力。

圖8 25 pmol/L Rapa作用48 h對BERP35T-1細胞增殖能力的影響

2.8 自噬激活劑Rapa 對BERP35T-1 細胞侵襲能力的影響

將25 pmol/L Rapa 作用BERP35T-1 細胞48 h 后，用Transwell 實驗檢測細胞的侵襲能力，結果如圖9所示，與對照組相比，25 pmol/L Rapa 作用后，BERP35T-1 細胞侵襲數量明顯增加(P＜0.01)。說明Rapa 可通過促進自噬從而提高BERP35T-1 細胞的侵襲能力。

圖9 Rapa作用48 h對BERP35T-1細胞侵襲能力的影響

2.9 自噬激活劑Rapa 對BERP35T-1 細胞遷移能力的影響

劃痕實驗檢測細胞的劃痕閉合率，結果如圖10所示，與對照組相比，25 pmol/L Rapa 作用12 h 后BERP35T-1 細胞劃痕閉合率顯著降低(P＜0.01)。說明Rapa 可能通過促進自噬提高BERP35T-1 細胞的遷移能力。

3 討 論

在多種類型的腫瘤細胞和腫瘤組織中，自噬水平升高。如在肝癌細胞和組織中自噬相關蛋白LC3B-II的表達顯著增強[19]；在肺腺癌細胞中，LC3B-II/I 的比值顯著升高，且P62表達顯著降低[20]；王振波[21]通過免疫組織化學分析等方法研究表明，食管鱗癌中自噬相關蛋白LC3A的表達明顯高于正常組織，且LC3A高表達與較差的患者總生存率相關，其低表達的患者放療效果更顯著；喬秋江[22]研究發現，LC3B-II/I 的比值和自噬小體數量與腦膠質瘤的病理分級呈正相關，與患者5年生存率呈負相關。本研究也發現，與BEP2D細胞相比，RH24 細胞及BERP35T-1 細胞內，LC3B-II/I蛋白比值升高，P62 表達降低，自噬體數量增加，說明在α粒子輻射誘發BEP2D 細胞惡性轉化過程中，細胞自噬水平增高；此外，具有明確的惡性表型的BERP35T-1細胞自噬水平高于RH24細胞(具有一定的惡性表型)，提示該過程中自噬水平與細胞惡性轉化程度呈正相關。

已有研究表明，細胞自噬在多種腫瘤的發生、發展中具有重要作用。例如，Cai 等[23]發現，通過激活PTEN/AKT/FOXO3a/Atg7 軸可以誘導內源性自噬，進而導致非小細胞肺癌的發生。抑制自噬可使腫瘤細胞的惡性表型減弱。例如，胡劍翀[24]的研究表明，CQ以濃度和時間依賴的方式抑制肝細胞癌Hep3B細胞的增殖、侵襲和遷移，在抑制自噬的同時也阻礙了腫瘤細胞上皮-間質轉化過程；Hamurcu 等[25]發現，沉默LC3和Beclin-1基因，從而抑制自噬，可顯著抑制三陰性乳腺癌模型的細胞增殖、集落形成、遷移和侵襲，并誘導凋亡增加；在前列腺癌和黑色素瘤的小鼠模型中，敲除自噬相關基因ATG5或ATG7后腫瘤進展減緩[26]。本研究也發現，40 和60 mmol/L CQ 抑制細胞自噬后，BERP35T-1細胞的存活率、侵襲數和劃痕閉合率均明顯降低，說明抑制自噬可降低BERP35T-1細胞的增殖、侵襲和遷移能力。反之，促進自噬可增強腫瘤細胞的惡性表型。如Han 等[27]研究表明，乙酰輔酶A可通過增強自噬促進Snail蛋白的乙?；?，有助于KARS-LKB1 共突變的肺癌細胞的侵襲和遷移；RAS突變使自噬增加，增強了腫瘤的生長、存活以及惡性轉化，與結腸癌、胰腺癌等惡性腫瘤的發展相關[28]；糖原-相互作用蛋白1(GNIP1)作為支架蛋白，可通過不同結構域與Beclin 1和LC3B結合，促進自噬蛋白復合物的形成誘導自噬，從而增強肺腺癌細胞的增殖、侵襲和遷移能力[20]。本研究也發現，25 pmol/L Rapa促進細胞自噬后，BERP3T-1 細胞的存活率、侵襲數和劃痕閉合率均顯著增加，表明增強自噬可提高BERP35T-1細胞的增殖、侵襲和遷移能力。這些結果提示α粒子照射BEP2D 細胞后，細胞自噬水平的增高可能促進了細胞惡性轉化。

綜上所述，在α 粒子輻射誘發人支氣管細胞BEP2D惡性轉化過程中，細胞自噬增強，可能由此提高細胞增殖、侵襲和遷移的能力，從而促進細胞惡性轉化。自噬抑制劑已被證明是許多體內抗腫瘤治療的有用佐劑[29]，目前，CQ在臨床上主要用于慢性自身免疫性疾病以及人免疫缺陷病毒、嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒、非瘧疾感染等疾病的治療[30]。結合本研究結果推測，CQ作為自噬抑制劑在氡等α粒子放射源致肺癌的化學防治方面可能具有一定的應用前景。