基于UPLC-MS/MS方法分析哈薩克族食管鱗癌患者的血清脂質組學特征

劉瑞雪，李德生，張力為

(新疆醫科大學第一附屬醫院胸外科，新疆 烏魯木齊 830054)

2020年國際癌癥研究中心的研究報告顯示，食管癌居世界惡性腫瘤發病率第8位，死亡率第6位[1]。食管癌的發病有明顯的地域和種族差異[2]，我國是食管癌的高發區，占全球新發病例的50%以上，90%以上是鱗狀細胞癌[3]。新疆哈薩克族食管癌發病率為68/10萬，死亡率是生活在同一地區漢族或其他少數民族的3～4 倍，遠遠超過全國和世界的平均水平，被列為新疆特高發腫瘤之一[4]。目前我國食管癌的術后5年生存率雖然較以往有所提高，但仍然不超過30%～40%[5]。癌細胞在脂質合成及脂質氧化等方面發生了特定改變[6]。作為代謝組學的一個獨立分支，脂質組學已經在各類腫瘤研究中識別和量化脂質，以揭示癌癥進展的關鍵驅動因素[7]。靶向定量脂質組學有助于檢測特定物質的精確濃度，有助于為潛在的生物標志物和藥物靶點的發現提供多樣化的數據[8]。所以，針對我區哈薩克族食管鱗癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)的種族特點，本研究擬使用哈薩克族ESCC 患者血清樣本通過超高效液相色譜串聯質譜技術(ultra performance liquid chromatography/tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS)進行靶向脂質組學分析，旨在探究新疆哈薩克族ESCC 患者的脂質代謝特征，進一步篩選出可能影響哈薩克族ESCC 患者疾病進展的脂質代謝標記物。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2018年1月—2020年12月在新疆醫科大學第一附屬醫院胸外科進行食管癌根治術的哈薩克族患者30 例，所有患者均經病理學診斷為食管鱗狀細胞癌，作為ESCC 組。另外選擇同期在新疆醫科大學健康管理中心體檢的哈薩克族健康體檢者30例為對照組。本研究已獲新疆醫科大學第一附屬醫院醫學倫理委員會批準(K202304-04)，所有受試者在研究開始前均已簽署知情同意書。

1.2 納入和排除標準

ESCC 組納入標準：①在新疆醫科大學第一附屬醫院胸外科行食管癌根治術的哈薩克族患者；②術后病理學診斷為食管鱗狀細胞癌；③無心腦血管等慢性疾??；④無代謝性疾病。ESCC 組排除標準：①有其它腫瘤病史；②標本采集前有放化療病史；③長期口服影響機體代謝的研究對象；④素食者。

對照組納入標準：①在新疆醫科大學健康管理中心體檢的哈薩克族健康成人，體檢結果無異常；②無代謝性疾病。對照組排除標準：①體檢發現有甲狀腺疾病，高血壓及糖尿病等影響機體代謝的疾??；②孕婦、哺乳期婦女及經期女性；③素食者。

1.3 樣品采集和制備

采集所有受試對象的晨間空腹(至少空腹8 h)靜脈血5 mL，4 ℃靜置2 h后3 000g離心15 min(離心半徑為16 cm)，取上清液用于臨床血清生化及血脂檢測，剩余血清樣本于-80 ℃冰箱凍存。取10 μL 的血清樣本混入480 μL 的脂質提取液(甲基叔丁基醚和甲醇按體積比5∶1 混和)，將樣品4 ℃，3 000g離心15 min，取上清液250 μL，重新加入250 μL 甲基叔丁基醚，超聲10 min 后，再次將樣品4 ℃，3 000g離心15 min，取上清液250 μL，重復上述步驟1 次，最后取30 μL上清液于進樣瓶中上機檢測。

1.4 UPLC-MS/MS檢測

使用SCIEX ExionLC 超高效液相色譜儀，通過液相色譜柱對目標化合物進行色譜分離。液相色譜A相為40%水和60%乙腈溶液，其中含10 mmol/L 乙酸銨；B 相為10%乙腈，90%異丙醇溶液，其中含10 mmol/L 乙酸銨。流動相流速0.3 mL/min，柱溫45 ℃，樣品盤溫度6 ℃，進樣體積2 μL。數據采集時，以多反應監測(MRM)模式進行質譜分析。AB Sciex QTrap 6500 質譜儀器參數如下：離子噴霧電壓：+5 500/-4 500 V，氣簾氣流速：40 psi，離子源溫度：350 ℃，離子源氣體壓力1∶50 psi，離子源氣體壓力2∶50 psi。

1.5 統計分析

首先通過LipidSearch、Metlab 軟件對原始數據進行采集匯總、歸一和濾噪等處理。采用Biobud-v軟件對所有目標化合物進行定量分析，根據每個樣品脂質內標峰面積和實際濃度關系計算出每個脂質相對于該內標的絕對濃度。接著使用SIMCA軟件對代謝組數據進行對數(Log)轉換加UV 格式化處理，然后進行單變量統計分析和多元變量統計分析，包括主成分分析(principal component analysis，PCA)和正交偏最小二乘法判別分析(orthogonal partial least squares discrimination analysis，OPLS-DA)、脂質組成分析及脂質鏈長和不飽和度等項目分析。最后，利用OPLS-DA模型中的變量投影重要度(variable importance in the projection，VIP)識別兩組間的明顯差異的代謝物，對于VIP＞1.0 和P＜0.05 的代謝物被認為是顯著差異的代謝物。

2 結 果

2.1 兩組人群一般資料和血生化指標比較

ESCC 患者和健康對照人群的一般資料和血生化指標的檢測結果見表1，ESCC 組患者血清總膽固醇、總蛋白、白蛋白低于對照組(P＜0.05)。兩組年齡、性別、甘油三酯、總膽汁酸、HDL-C、LDL-C比較，差異均無統計學意義(P＞0.05)。

表1 ESCC患者和健康對照人群的一般資料和血生化指標的檢測結果

2.2 多元統計分析

通過SIMCA 軟件對ESCC 患者及對照組整理好的代謝組數據進行對數(Log)轉換，然后對其進行PCA和OPLS-DA 分析。結果提示兩組間存在分離趨勢(圖1A)。OPLS-DA 分析獲取更加可靠的代謝物的組間差異與實驗組的相關程度信息(圖1B)。從OPLS-DA得分圖的結果可以看出，樣本基本處于95%置信區間內。根據OPLS-DA，可以計算出每個代謝物的VIP值，這是篩選差異代謝物的重要參數之一。

圖1 ESCC組和正常對照組PCA及OPLS-DA分析得分散點圖

2.3 哈薩克族ESCC患者的脂類組成分析

根據脂類頭部基團，將脂質進一步分為多個亞類。通過Biobud-v軟件對所有目標化合物進行脂質定量分析，結果提示總體樣本中檢測到脂質化合物及各亞類共計13 類，其中濃度最高的化合物是甘油三酯，見圖2A。通過計算同一樣品中各脂質亞類濃度總和定量其總濃度，結果提示ESCC 中溶血磷脂酰膽堿(LPC)，磷脂酰乙醇胺(PE)的濃度顯著降低(P＜0.05)，神經酰胺(Cer)的相對濃度明顯升高(P＜0.05)，雖然游離脂肪酸(FFAs)、二酰甘油(DAG)、三酰甘油(TAG)、溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)、磷脂酰膽堿(PC)、二氫神經酰胺(DCER)、己糖基神經酰胺(HCER)、乳糖基神經酰胺(LCER)、鞘磷脂(SM)及膽固醇酯(CE)的總濃度在兩組間無明顯差異，結果見圖2B(P＞0.05)。但FFA、DG、TAG、LPC、LPE、PC、PE及SM的主要種類在兩組間差異明顯(P＜0.05)，見圖3。

圖2 ESCC組與正常對照組的脂質篩選及脂質亞類濃度的差異

圖3 ESCC組與正常對照組血清樣本中脂質亞類濃度的差異分析

2.4 哈薩克族ESCC 患者血清中的差異脂質代謝物的篩選

我們以P＜0.05，VIP＞1 的標準進行差異脂質代謝物篩選，共篩選出249種差異脂質代謝物，其中79種上調，170種下調見圖4A。我們選取OPLS-DA模型各組中VIP最大的前20種脂質，發現其表達水平均是下調的，見圖4B。為了了解它們之間的可能調節關系，我們對VIP最大的前50個差異脂質進行Pearson相關性分析，結果提示幾種類型的甘油三酯與其它幾種類型的脂質均存在明顯正相關見圖5。我們又以閾值(P＜0.05和差異倍數＞2或＜0.5)篩選差異脂質代謝物，共篩選出73 種差異脂類，其中與對照組相比較，ESCC 組上調的有34 種，見表2，下調的有43 種，見表3。其中甘油二酯DAG(14:0/18:2)、DAG(16:0/18:2)、DAG(16:0/18:3)、DAG(18:2/22:5)均是下調的，尤其是DAG(18:2/22:5)下調了37%；游離脂肪酸類FFA(20:2)、FFA(20:3)、FFA(20:4)、FFA(22:6)均是下調的，尤其FFA(20:4)下調了36%。而TAG 種類在ESCC 組出現了2 倍的上調變化。在甘油磷脂類中，尤以PE(16:0/16:1)和PE(16:0/20:5)變化最為明顯，在腫瘤組中其上調了2.28和2.48倍。

圖4 ESCC組與正常對照組血清樣本中差異表達的脂質

圖5 ESCC組與正常對照組血清樣本中差異表達脂質的相關性分析

表2 食管鱗狀細胞癌和對照組患者血清中上調的脂質代謝物

表3 食管鱗狀細胞癌和對照組患者血清中下調的脂質代謝物

2.5 哈薩克族ESCC患者血清樣本中脂質鏈長分析

與健康人群相比較，腫瘤組中游離脂肪酸濃度在18、20、22、24、26、28、30鏈長處減少，而在14碳鏈處其濃度在腫瘤組中反而增加。LPC 在腫瘤組的濃度在所有鏈長處均低于正常組。腫瘤組PC 濃度在36、38 鏈長處少于正常組。腫瘤組中LPE 濃度在18、22 鏈長處相較正常組明顯減少。PE 濃度在腫瘤組中隨著碳鏈長度的增加而減少。SM在腫瘤組中其濃度在22、24 鏈長處明顯減少。在腫瘤組中，HCER 和DCER 濃度在36鏈長處，相較于正常組其濃度反而增加，結果見圖6。

圖6 ESCC組和正常對照組中不同碳鏈長度對應的脂類化合物濃度

2.6 哈薩克族ESCC 患者血清樣本中脂鏈不飽和度分析

本研究中TAG、LPC、PC 和PE 在腫瘤組中幾乎所有不飽和鍵的脂質濃度相較正常組均明顯下調，差異有統計學意義(P＜0.05 或P＜0.01)。其他含有部分不飽和鍵的脂類化合物濃度在腫瘤組中也明顯下調(P＜0.05或P＜0.01)，結果見圖7。

圖7 ESCC組和正常對照組中不同碳鏈飽和度對應的脂類化合物濃度

3 討 論

多項研究報道癌癥中發生脂質代謝重編程，脂質代謝物參與腫瘤細胞能量儲存、細胞信號傳導、細胞膜的構成和細胞間的相互作用[9]。之前對ESCC的多個轉錄組數據集的綜合分析顯示了脂質代謝途徑的改變，包括糖鞘脂生物合成、鞘脂代謝和甘油脂代謝[10]。我們課題組結合新疆地區食管癌的流行病學特點，前期針對新疆哈薩克族ESCC 進行的一項非靶向代謝組學研究顯示了脂質代謝的改變，比如油酸、LysoPC(15:0)與淋巴結的轉移相關[11]，這說明脂質分子的種類和水平可能提示哈薩克族ESCC 的病程和發展趨勢。因此，本研究仍以哈薩克族人群為研究目標進一步通過脂質的準確鑒定和定量全面進行脂質譜分析，進一步探究哈薩克族ESCC 樣本的脂質組成、分布等特點。

脂質鏈長度為該脂質分子所有脂肪酸的碳原子總和。脂鏈因長度差異導致脂質功能各異，鏈的長度會影響細胞質膜的厚度，進而影響細胞膜的流動性、相關脂質轉運蛋白和靶蛋白的活性和功能[12]。研究發現，胰腺中CD8+T 細胞中特異性長鏈脂肪酸(LCFAs)的逐漸積累不僅破壞了線粒體功能，而且通過脂肪酸的β氧化過程促進了TCA 循環，且不同類型的LCFAs和不同飽和度的脂質可能為腫瘤微環境中維持腫瘤進展和免疫細胞代謝重編程提供線索[13]。而本研究提示腫瘤組中FFA、PC、LPC、PE、LPE 的濃度在部分鏈長處均低于正常組人群，尤其是腫瘤組中LPC的濃度在所有鏈長處均低于正常組。同時，脂肪酸鏈中雙鍵數目的總和決定脂鏈不飽和程度，腫瘤細胞增殖和侵襲能力的增強與細胞膜脂質的飽和度密切相關[14]。有研究指出脂肪酸殘基可能因不飽和程度以及雙鍵的位置而不同，與非惡性細胞相比，癌細胞的細胞膜表現出不同程度的不飽和，癌細胞細胞膜較低的飽和度，可防止細胞膜脂質過氧化[15-16]。而本研究中TAG、LPC、PC 和PE 在腫瘤組中飽和度相較正常組均明顯下調。

甘油磷脂代謝是食管癌一種重要的代謝途徑。本研究中，LPC(16:0)、LPC(20:2)、LPC(18:0)、LPC(20:0)、 LPC(20:1)、 LPC(22:6)、 LPC(22:4)、 LPC(20:4)、LPC(18:2)、LPC(14:0)、LPC(20:3)、LPC(18:3)、LPE(20:0)、LPE(18:0)、LPE(20:1)和LPE(20:2)的水平在ESCC中降低，而LPE(22:5)、LPE(16:1)的水平則增高，提示哈薩克族ESCC 患者存在LPC 和LPE 代謝障礙。Xu等[17]的研究也表明LPC(14:0)水平在ESCC 患者血清中降低。LPC 和LPE 既是磷脂酰膽堿(PC)和磷脂酰乙醇胺(PE)的代謝產物，也是哺乳動物細胞膜的結構成分。一項研究表明，LPCs的低水平與乳腺癌、結腸癌的高風險直接相關[18]。也有研究表明LPEs通過抑制磷脂酶D(PLD)影響細胞增殖和遷移[19]。一項ESCC 研究表明，LPE(16:0)、LPE(20:4)和LPE(18:1)水平在ESCC患者血清中較高[20]。而本研究中得出LPE(20:0)、LPE(18:0)、LPE(20:1)和LPE(20:2)的水平在ESCC 中降低，而LPE(22:5)、LPE(16:1)的水平則增高?？傊?，哈薩克族ESCC 患者血漿磷脂水平異常提示脂質和能量代謝紊亂。

鞘磷脂(sphingomyelin，SM)是細胞膜的主要成分，鞘磷脂分布在細胞膜的兩側，外葉的鞘磷脂濃度較高。鞘磷脂生物合成涉及鞘氨酸合成，進一步?；缮窠涻０穂21]。相反，鞘磷脂(SM)分解導致神經酰胺(Cer)釋放[22]。本研究發現SM(22:0)、SM(22:1)、SM(24:0)在ESCC組中的濃度低于正常對照組。鞘磷脂水平的升高具有促進腫瘤生長的作用，其機制是發揮促凋亡神經酰胺的減少[23]。研究報道，自噬相關蛋白9A(ATG9A)通過調節鞘磷脂水平破壞自噬體組織，被認為是自噬的負調節因子[24]。本研究還發現神經酰胺Cer(18:0/26:1)在ESCC 組中的濃度高于正常對照。Cer 作為第二信使分子，是神經鞘磷脂酶催化反應的產物，神經酰胺膜水平的增加可誘導線粒體釋放細胞色素C，從而激活細胞凋亡通路[25]。一些新的癌癥治療策略旨在過表達神經酰胺生物合成途徑關鍵酶，導致程序化癌細胞死亡[26]。先前的一項ESCC研究中發現，兩種二氫神經酰胺Cer(d18:0/24:0)和Cer(d18:0/24:1)在轉移性ESCC 中增加，Cer(d18:0/24:0)和Cer(d18:0/24:1)在小鼠實驗轉移模型中抑制轉移灶的形成[27]。因此，神經酰胺可能是一種有希望干預ESCC轉移的藥物。

總而言之，本研究通過UPLC-MS/MS 檢測平臺對亞類脂質進行檢測，哈薩克族ESCC 患者血清中不同的脂質變化，可能與構成細胞增殖所需膜結構的成分增加和能量代謝事件重編程相關，后期還需要在此次發現的標志物的基礎上，進行具體的脂質分子通路間的研究。本研究有一定的局限性，研究中并未納入其他民族脂質組學分析，仍值得進一步比較分析。