纖維素降解菌的篩選及其對西蘭花廢棄莖葉品質的改善

姚曉紅，孫宏，沈琦，周航海，趙志偉，吳逸飛，王新，湯江武*

(1.浙江省農業科學院，浙江 杭州 310021；2.華中農業大學，湖北 武漢 430000)

西蘭花富含維生素、糖類、蛋白質、礦物質等多種營養物質，因此有“蔬菜皇冠”的美譽。西蘭花(Brassicaoleracea)莖葉中粗蛋白含量在20%以上，還含有多糖、維生素、礦物質等營養物質成分，是一種潛在的植物蛋白飼料資源[1]。我國西蘭花種植面積預計已超過2.7萬hm2，年產量超過100萬t[1]。同時，每年至少超過30萬t的西蘭花廢棄莖葉被丟棄在農田中，這些廢棄莖葉的纖維含量較高，直接用于動物飼喂則難以被動物消化。另外，廢棄莖葉中的含水率超過90%，極易腐爛，造成環境的污染[2]。利用微生物發酵技術，將西蘭花廢棄莖葉作為非常規飼料進行開發，有效解決西蘭花種植地區環境污染的同時，還能緩解我國蛋白飼料資源短缺的現狀，為我國飼料工業的可持續發展提供支持和保障[3]。本文從西蘭花種植土壤中分離出一株高效纖維素降解菌，對其進行了菌株鑒定，將其用于西蘭花廢棄莖葉的發酵，并對發酵產物的營養成分進行了分析，為西蘭花廢棄莖葉制備發酵飼料提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

西蘭花廢棄莖葉中粗蛋白含量2.62%，含水率85%，由臺州天萊生物科技有限公司提供。

1.2 培養基

(1)酵母膏胨葡萄糖瓊脂培養基(YPD)：葡萄糖20 g，酵母粉10 g，蛋白胨20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，pH值自然。

(2)產纖維素酶菌種篩選培養基：羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)10 g，酵母膏5 g，蛋白胨10 g，磷酸二氫鉀1 g，硫酸鎂0.5 g，氯化鈉5 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水1 000 mL，pH值自然。

(3)發酵培養基：CMC-Na 10 g，蛋白胨10 g，酵母膏5 g，磷酸二氫鉀1 g，氯化鈉5 g，硫酸鎂0.5 g，蒸餾水1 000 mL，pH值自然。

1.3 菌種的分離與篩選

1.3.1 纖維素降解菌的生物富集及初篩

取西蘭花廢棄莖葉切成0.5～1 cm左右的塊狀，稱取10 g塊狀莖葉加入裝有100 mL滅菌YPD液體培養基中，同時采用四分法取西蘭花種植地泥土100 g，加入裝有500 mL滅菌YPD液體培養基的三角瓶中，于30 ℃、200 r·min-1振蕩培養72 h。完成培養后，靜置片刻，用無菌吸管吸取上清液并進行梯度稀釋，將稀釋液涂布于纖維素初篩培養基平板上，28 ℃培養72 h，有透明圈長出的菌落即為能產生纖維素分解酶的菌落，并對其進行多次平板劃線純化。然后將經過純化后有透明圈的菌株轉接到纖維素篩選培養基上，每個菌株3個重復，30 ℃培養3 d。將4 mL 1 mg·mL-1的剛果紅溶液均勻覆蓋于平板上，染色30 min后棄去剛果紅溶液，再用1 mol·L-1NaCl溶液沖洗30 min，利用十字交叉法測量菌落直徑d(mm)和透明圈D(mm)，根據H值(H=D/d)篩選比值大的菌株進行酶活力測定[4]。

1.3.2 纖維素降解菌的復篩

活化初篩獲得的菌種，將其接種于發酵培養基，30 ℃，180 r·min-1振蕩培養24 h。于4 ℃，6 000 r·min-1將發酵液離心10 min，對獲得的上清液(即粗酶液)進行酶活力測定。

1.4 纖維素酶活力測定

1.4.1 葡萄糖標準曲線繪制

將配制好的1 g·L-1標準葡萄糖溶液，分別吸取0、200、400、600、800、1 000 μL于10 mL比色管中，用蒸餾水補足至2 mL，用蒸餾水作為對照組。分別加入1.5 mL DNS試劑，煮沸5 min。冷卻后，加水稀釋至10 mL。于540 nm波長處，以空白對照調零，測定吸光值。以吸光度值為橫坐標、標準葡萄糖溶液的濃度為縱坐標，繪制標準曲線并建立回歸方程。

1.4.2 CMC活性測定[5-6]

采用DNS法測定纖維素酶活性。取3支10 mL比色管，加入用醋酸-醋酸鈉緩沖液配制的0.5%(m/V)CMC-Na溶液1.5 mL，于40 ℃水浴預熱10 min，迅速加入0.5 mL粗酶液，40 ℃反應30 min，立即加入DNS試劑1.5 mL以終止反應。將混合液于沸水浴煮沸5 min后冷卻，用蒸餾水定容至10 mL，充分搖勻，在540 nm波長處測定吸光度，計算纖維素酶活性。

1.4.3 濾紙酶活性測定[6-7]

將濾紙剪成1 cm×6 cm的長條，放入10 mL比色管中，加入0.5 mL粗酶液和1.5 mL醋酸鈉緩沖液；將試管置于40 ℃恒溫水浴中處理30 min，取出后迅速加入1.5 mL DNS試劑，充分搖勻，煮沸5 min。取出冷卻后，定容至10 mL，充分搖勻，于540 nm波長下測定吸光值，根據標準曲線計算濾紙酶活性。

1.5 菌種鑒定

1.5.1 形態學觀察

將菌株于YPD平板劃線活化，37 ℃培養24 h，觀察菌落形態特征、大小及顏色，鏡檢觀察革蘭氏染色后菌體的大小、形態、芽孢形成情況，參照《伯杰細菌鑒定手冊》[8]進行部分生理生化指標檢測。

1.5.2 菌種的16S rRNA基因測序及系統發育分析

采用Biospin細菌基因組DNA提取試劑盒提取目標菌株的基因組DNA，并以此為模板進行PCR擴增，引物為27F和1492R通用引物。PCR擴增體系為25 μL，包括：上下游引物各0.75 μL、DNA模板1 μL、Taq酶0.25 μL、dNTP 0.5 μL、10×酶緩沖液4 μL，ddH2O 17.75 μL。PCR擴增條件為：94 ℃預變性5 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 31 s，72 ℃ 90 s，35個循環；72 ℃終延伸5 min。將PCR擴增產物送至上海派森諾生物科技公司測序，測序結果進行NCBI-BLAST比對，通過Mega 5.0軟件構建系統發育樹。

1.6 西蘭花生物飼料制備方法

西蘭花廢棄莖葉用碎草機切成1～2 cm小段，與米糠和玉米皮按3∶1∶1比例混合均勻，接種0.5%的菌液，裝入發酵用呼吸袋中，每袋裝量500 g，做3個重復，于30 ℃培養箱中靜置培養14 d，取樣于50 ℃烘箱烘干進行指標檢測。取攪拌均勻的混合原料放入-20 ℃冰箱保存作對照組。

1.7 指標測定

粗蛋白含量測定方法參照GB/T 6432—2018，粗纖維含量測定方法參照GB/T 6434—2006，粗多糖含量測定方法參照SN/T 4260—2015[9]，粗灰分含量測定方法參照GB/T 6438—2007，乳酸含量測定參照GB/T 12456—2008[10]，小肽含量測定參照GB/T 22492—2008《大豆肽粉》三氯乙酸法[11]。發酵結束后，取2 g烘干后的發酵樣品，用電鏡專用膠帶固定樣品，經高真空離子濺射儀噴鍍處理，利用Hitachi Regulus 8100掃描電鏡進行樣品表面結構觀察。

2 結果與分析

2.1 纖維素降解菌的初篩

將分離樣品適當稀釋后涂布于纖維素初篩平板，37 ℃培養72 h，選取生長快速且透明圈清晰的菌株測量菌落直徑d和透明圈直徑D，計算H=D/d值，結果見圖1和表1。

表1 纖維素降解菌初篩結果Table 1 Preliminary screening results of cellulose-degrading bacteria

圖1 纖維素降解菌的篩選Fig.1 Screening of cellulose-degrading bacteria

從初篩結果可以看出，菌株XLG2-1的H值最大，其次為Bsk-9，其菌落直徑和透明圈直徑都較大，說明該菌的生長能力和降解纖維素的能力均較強。根據H值大小，選取H較大的5株菌接種至發酵培養基，進行復篩。

2.2 纖維降解菌的復篩

2.2.1 葡萄糖標準曲線繪制

根據DNS法以葡萄糖添加量(mg·mL-1)為橫坐標，以D值為縱坐標繪制標準曲線，結果見圖2。使用Excel對數據進行分析，得出標準曲線方程為y=1.354 1x+0.027 9，R2=0.999 5，表明該標準曲線的估算值與實際值的擬合度很高。

圖2 葡萄糖標準曲線Fig.2 Glucose standard curve

2.2.2 發酵液酶活性測定

將初篩獲得的菌種活化后，接種于發酵培養基，37 ℃，180 r·min-1振蕩培養24 h。將培養液于5 000 r·min-1離心10 min，取上清液適當稀釋后測定CMC活性、FPA活性和蛋白酶活性，結果見圖3、圖4。

圖3 產纖維素酶菌株的復篩Fig.3 Secondary screening of cellulase producing strains

從圖3可知，菌株Y1-3產FPA活性最高，其次為XLG2-1，菌株XLG2-1產CMC活性最高，其次為Bsk-9。圖4結果顯示，菌株Bs2產蛋白酶活性最高，其次為XLG2-1。綜合上述結果，選取菌株XLG2-1作為實驗菌株進行后續研究。

2.3 纖維素降解菌的菌株鑒定

2.3.1 形態學及生理生化鑒定

從圖5中1可見，菌株XLG2-1在YPD平板上的菌落呈圓形，米黃色，表面濕潤、凸起，邊緣整齊。圖5中2透射電鏡下觀察菌體呈短桿狀。從表2生理生化結果可知，該菌株能水解淀粉、葡萄糖和蔗糖。根據菌落和菌體形態及生理生化結果，同時參照《常見細菌系統鑒定手冊》[12]，初步鑒定菌株XLG2-1為芽孢桿菌屬。

表2 菌株XLG2-1的部分生理生化結果Table 2 Partial physiological and biochemical results of strain XLG2-1

1表示菌株XLG2-1菌落形態，2表示菌株XLG2-1透射電鏡下菌體形態。圖5 菌株XLG2-1形態Fig.5 Morphology of strain XLG2-1

2.3.2 菌種16S rDNA序列測定

經序列分析，菌株XLG2-1的16S rDNA的序列長度為1 466 bp，將測序結果在NCBI上進行BLAST同源性比對并構建系統發育樹(圖6)，發現該菌株與短小芽孢桿菌Bacilluspumilus(NR 112637)有較高的同源性。綜合上述結果，鑒定該菌株為短小芽孢桿菌Bacilluspumilus。

圖6 菌株XLG2-1系統發育樹Fig.6 Phylogenetic tree of strain XLG2-1

2.4 發酵前后營養成分的變化

由表3結果可知，對照組和發酵組的粗多糖含量差異極顯著(P<0.01)，粗蛋白、粗灰分、小肽含量有顯著差異(P<0.05)，而粗脂肪和粗纖維含量無顯著差異(P>0.05)。發酵后的粗蛋白含量比對照組提高了0.41百分點，小肽和粗多糖含量分別比對照組提高了11.5和10.4百分點。發酵組的粗脂肪、粗纖維和粗灰分含量分別比對照組降低了0.21、0.25和0.02百分點。

表3 西蘭花莖葉發酵前后營養成分的變化Table 3 Changes in nutrient composition of stem and leaf of Brassica oleracea before and after fermentation

2.5 發酵前后掃描電鏡對比

將發酵前后的西蘭花廢棄莖葉進行電鏡掃描，從圖7結果可知，發酵前西蘭花廢棄莖葉的結構比較完整、緊密，發酵后樣品的結構疏松，表面有大量孔洞(箭頭指向)，有利于微生物附著。與對照相比，菌株XLG2-1能利用西蘭花廢棄莖葉生長繁殖，并破壞其結構。

1和2分別為對照組和發酵組。圖7 西蘭花莖葉發酵前后掃描電鏡圖Fig.7 Scanning electron microscopy of broccoli stems and leaves before and after fermentation

3 結論與討論

3.1 產纖維素酶菌株的篩選

土壤的成分非常復雜，不僅包括氧化的腐殖質、動植物殘骸和微生物分解的有機質，還有豐富的土壤微生物[13]。由于西蘭花中含有較高含量的纖維素，西蘭花種植土壤中可能含有較多的纖維素降解菌，因此，本實驗以西蘭花種植土壤為樣品，采用剛果紅平板染色和酶活性測定法篩選獲得一株纖維素降解菌，經測序鑒定為短小芽孢桿菌Bacilluspumilus，該菌株在液體發酵培養基中產CMC活性為12.79 U·mL-1，FPA活性為8.99 U·mL-1。本研究與趙龍妹等[14]和吳潔等[15]的報道相同，表明土壤中含有豐富的功能微生物菌種，其中芽孢桿菌屬下的部分菌種具有產纖維素酶特性和纖維素降解能力。本研究顯示，菌株XLG2-1具有較高的產CMC能力，趙龍妹等[14]從玉米田篩選的巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)XT2，李文兵等[16]從牛糞中篩選的內生芽孢桿菌(Bacillusendophticus)CK41，及王堯悅等[17]篩選獲得的枯草芽孢桿菌N3的CMC活性。以上酶活力結果存在差異可能與菌種來源及培養條件等有關。

3.2 西蘭花廢棄莖葉發酵前后營養成分分析

西蘭花莖葉粉中粗蛋白含量高達23.0%，除此之外還含有粗脂肪(4.24%)、粗灰分(12.2%)和粗纖維(7.36%)[18]。由于其較高的粗蛋白含量，可以作為畜禽的蛋白資源。本研究結果發現，發酵后西蘭花廢棄莖葉中粗纖維含量明顯降低了0.25百分點，粗多糖含量有明顯提高，比對照組提高了10.4百分點，并且掃描電鏡結果顯示，西蘭花廢棄莖葉的結構被破壞，說明菌株XLG2-1能在一定程度上降解纖維，將其轉化為單糖或二糖，作為自身生長的碳源。同時，在發酵過程中粗蛋白和小肽含量也有明顯提高，這可能與菌株XLG2-1較強的產蛋白酶能力有關，將原料中大分子蛋白降解為小分子肽。同時，菌株自身的生長也會引起蛋白含量的增加。張立靜等[19]篩選獲得一株具有較好纖維素降解能力的短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)T-7，當蔗糖和尿素的添加量分別為2%時，纖維素降解率在第8 d達到40.34%。田久東[20]從田間土壤中分離獲得產蛋白酶、纖維素酶和產酸能力強的菌株，將其組成復合菌種，發酵西蘭花渣50%、米糠粕20%、麩皮20%、噴漿玉米皮10%組成的飼料，發酵后飼料中酸溶蛋白含量為6.68%，與對照組(未添加發酵劑)相比含量提高150%，粗蛋白和還原糖含量分別為23.5%和3%，相較于對照組分別提高了15%和50%。以上結果表明，將菌株XLG2-1用于西蘭花廢棄莖葉發酵可達到降解纖維素，改善粗蛋白和小肽含量的目的。本研究的結果對于緩解農業廢棄物污染問題以及非常規飼用原料的資源化開發都具有十分重要的意義。