基于面積歸一化法對飼料中黃霉素總殘留量的研究

卞 華, 曹 瑩, 葛 宇

(上海市質量監督檢驗技術研究院1,上海 200233) (上海市獸藥飼料檢測所2,上海 201103)

黃霉素(Flavomycin)為磷酸化多糖類強極性抗生素, 主要由灰綠鏈霉菌厭氧發酵而成[1-3],只溶于水和甲醇等小分子溶劑中。黃霉素的抗菌作用機理是通過干擾細胞壁的結構物質肽聚糖的生物合成,從而抑制細菌的繁殖[4];黃霉素的促生長原理在于它能提高飼料中能量和蛋白質的消化,能使腸壁變薄,從而促進營養物質的吸收,有效提高飼料的利用率[5]。同時,黃霉素抗菌譜較窄, 主要對革蘭氏陽性菌有效,不容易與別類抗生素產生交叉耐藥性[6-8],曾一度被廣泛用于畜禽和水產品飼料中。研究表明,長期服用黃霉素類藥物對人的骨骼發育會有嚴重影響,甚至會產生造血功能障礙[9,10]。2005年歐盟農業部長會議[11]決定, 黃霉素等4種抗生素自2006年起禁止使用。日本肯定列表(Japan Positive List System)和美國環境保護局(EPA)等部門也相繼出臺了禁用規定。目前我國檢驗檢疫部門已將黃霉素列為飼料和動物源性食品殘留監控計劃[12]。

黃霉素為多組分混合物,主要由5種活性成分黃霉素A、黃霉素A12、黃霉素C1、黃霉素C3、黃霉素C4組成,其化學特性和抗菌活性均十分相似。其中,黃霉素A為最突出的活性組分。然而黃霉素混合物的純度不高,5種活性成分的分離成本極大,無法得到各自單獨的標準品。迄今為止,黃霉素檢測技術的發展并不理想,全球有關黃霉素檢測的研究中均僅測定黃霉素A的含量,結果并不準確。我國《獸藥質量標準》中也僅規定,可以通過檢測黃霉素A的含量間接監控基質中黃霉素物質的添加量[13,14]。

黃霉素檢測方法包括:微生物法[15,16]、高效液相色譜法[17,18]、液相色譜-串聯質譜法[19]和超高效液相色譜-高分辨四級桿飛行時間質譜法[20]等。其中,微生物法屬于篩選法,定量不準確,并且缺乏特異性;高效液相色譜法(HPLC)具有更好的特異性,在特定的波長下能夠準確測定黃霉素的不同成分,但是其檢出限較高,無法測定低含量的基質;液相色譜-串聯質譜法(LC-MS/MS)具有高選擇性、高精確度、高通量的獨特優勢,能精確測定基質中黃霉素A的含量,但因5類物質碎片離子的分子量相近,無法準確分離5種黃霉素活性成分,結果會有一定的誤差;液相色譜-高分辨四級桿飛行時間質譜法(LC-Q-TOF-MS)可以對不同組分的精確分子量與特征碎片進行有效分離和定性分析,但無法準確定量。至今為止,各種檢測方法都有一定的局限性。在全球范圍中,均沒有關于黃霉素權威性的標準,國際標準化組織(ISO)體系中也沒有黃霉素相關標準的發布。

因此,本實驗參考了國內外文獻,根據不同類別飼料基質的特性,對前處理方法進行了研究,利用通透式固相萃取技術,結合高效液相色譜和液相色譜-串聯質譜的特點,探索能同時滿足黃霉素各活性成分均充分分離的方法,并準確測定黃霉素A的含量,經高分辨四極桿飛行時間質譜確認檢測結果中黃霉素A的唯一性后,最終利用面積歸一化法精確折算出基質中黃霉素的總殘留量。該方法選擇性強、靈敏度高,重復性好,可為飼料基質中黃霉素總含量檢測標準的制定提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

黃霉素固體標準品(11015-37-5, 92%)。折算后,將黃霉素標準儲備液質量濃度配制為1 000.0 μg/mL,黃霉素標準中間液質量濃度配制為100.0μg/mL(現配現用)。甲醇、乙腈(色譜純);甲酸、氨水(色譜純);乙酸銨(分析純);甲酸銨(分析純)。Oasis PRiME HLB 6cc/200 mg。

e2695 Separations Module液相系統,2998 PDA detector檢測器,XEVO TQ-XS三重四極桿串聯質譜儀,電噴霧離子源(ESI),AcquityR UPLC H-CLASS 液相色譜系統,SYNAPT XS High Resolution Mass Spectrometer四級桿,Synapt HDMS質譜分析系統,MSZO 204S型電子天平,JM-03D-40超聲波清洗機,D-91126多管渦旋振蕩器,Centrifuge 5804高速離心機,Preekem-N1全自動氮吹濃縮儀,Milli-Q超純水系統。

1.2 試樣處理

提取:稱取試樣5 g (準確至0.01 g),置于50 mL離心管中,準確加入25 mL體積分數0.1%甲酸甲醇溶液,渦旋振蕩5 min,超聲10 min,在10 000 r/min離心機上,離心5 min,取上清液置于50 mL容量瓶中,重復步驟,合并上清液,用體積分數0.1%甲酸甲醇溶液定容至刻度。

凈化:吸取10 mL提取液至Oasis PRiME HLB通透式固相萃取小柱中,減壓過濾并保持流速為1～2滴/s,直接收集過濾液。取1 mL凈化后的過濾液經0.22 μm有機相濾膜過濾后供液相色譜-串聯質譜分析。

1.3 標準溶液配制

1.3.1 面積歸一法(供高效液相色譜分離)

將黃霉素標準中間溶液(100 μg/mL)用甲醇稀釋成質量濃度為50 μg/mL的標準工作液,用于測定標樣中各活性成分的峰面積。

1.3.2 基質加標標準工作曲線(供液相色譜-串聯質譜定量)

將黃霉素標準中間溶液100 μg/mL用甲醇逐級配制成質量濃度為1.0、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0μg/mL的標準系列溶液,稱取與試樣基質相應的陰性樣品5.0 g,分別加入各標準系列溶液0.5 mL,與試樣同時提取和凈化。

1.4 色譜條件

1.4.1 高效液相色譜

色譜柱:DiKMA Platisil 5 μm ODS, 250.0 mm×4.6 mm;柱溫:35 ℃;進樣體積:20 μL;流動相體積比:20 mmol/L乙酸銨溶液(甲酸調節pH 至5.0)∶乙腈=55∶45;紫外檢測器:258 nm。

1.4.2 液相色譜-串聯質譜

液相色譜條件:色譜柱: Atlantis T3(100.0 mm×2.1 mm, 3 μm);柱溫:35 ℃;進樣體積:10 μL。流動相A:5 mmol/L 乙酸銨溶液(pH 5.0);流動相B:乙腈;流速0.4 mL/min。梯度洗脫程序:0.0～1.0 min,10%B;1.0～1.1 min,10%B～95%B;1.1～4.0 min,95%B;4.0～4.1 min,95%B～10%B,4.1～7.0 min,10%B,質譜儀器條件:電噴霧負離子模式(ESI-),多反應監測(MRM);毛細管壓力:3.0 kV;椎孔電壓:40 V;離子源溫度:150 ℃;脫溶劑氣溫度:550.0 ℃;脫溶劑氣流速:1 000 L/h;反吹氣流速:150 L/h;碰撞氣流速:0.15 mL/min;霧化氣壓力:0.7 MPa。母離子、子離子、去簇電壓(DP)、碰撞氣能量(CE),見表1。

表1 黃霉素A化合物的母離子、子離子、去簇電壓和碰撞能

2 結果與分析

2.1 高效液相色譜條件的優化

2.1.1 色譜柱的選擇

黃霉素為強極性弱酸性混合物,在反相柱上不易保留。普通改良的C18色譜柱并不適用于黃霉素混合物。黃霉素C1、黃霉素C3、黃霉素C4幾乎沒有得到有效的分離,并且,黃霉素A12與黃霉素A被同時洗脫,形成很強的前伸效應,導致峰形很寬。結果表明,黃霉素混合物能在更適合酸性鹽流動相體系下的鉑金柱DIKMA Platisil 5 μm ODS, 250.0 mm×4.6 mm中得到較好的分離,提供更好的峰型(圖1),其可能與鉑金柱中去活化的酸性游離硅羥基固定相對5種活性組分在四氫吡喃基團上不同的R1、R2、R3基團有不同的分子間作用力(表2),從而產生了不同的分離結果。

圖1 黃霉素混合物的高效液相色譜分離圖

表2 黃霉素活性成分的結構信息

2.1.2 流動相的確定

以DB32/T 1279—2008[21]標準為依據,將20 mmol/L甲酸銨和乙酸銨分別作為預選水相,乙腈和甲醇作為預選有機相。實驗表明,甲酸銨和乙酸銨均屬于弱酸弱堿鹽,陰離子和陽離子均水解,水溶液顯中性,無法分離得到目標物,需要將溶液環境用甲酸調整到pH 5.0后能得到較明顯的目標峰。通常,在pH 3.5～5.5時,相同濃度的乙酸銨-酸溶液比甲酸銨-酸溶液緩沖能力略強,最終選擇20 mmol/L乙酸銨為水相。同時,當有機相采用甲醇時,目標物的保留時間都更早,導致黃霉素A12與黃霉素A,黃霉素C3與黃霉素C4都包裹在一起,乙腈的極性相對較弱,更適合于黃霉素混合物的分離。

另外,當有機相的比例大于48%時,黃霉素A12與黃霉素A分離效果理想,但黃霉素C1、黃霉素C3、黃霉素C4的出峰時間明顯前移,與主峰黃霉素A同時被洗脫;當有機相的比例小于43%時,黃霉素A12會延后,同樣會與黃霉素A同時被洗脫。最終,當有機相的比例為45%時,能得到最清楚和最穩定的分離結果。5個化合物在6次平行性實驗得出保留時間的偏差在0.16 s以內。

2.1.3 黃霉素標準品各組分含量的確定

根據國內外飼料生產企業所提供的信息,在黃霉素被廣泛使用時,主要由4家公司制備合成黃霉素類抗生素。利用高效液相色譜條件測定黃霉素標樣(50 μg/mL),分離后的黃霉素各活性組分經面積歸一化法和統計模型加權平均后(表3),得出黃霉素A質量分數為86.2%,RSD為0.66%。值得一提的是,黃霉素雜質峰在258 nm處的光譜圖均與黃霉素主要活性成分的光譜圖不符(圖1),已在配制標準儲備液時進行了折算,不在研究考慮范圍之內,不納入面積歸一法中進行計算。

表3 黃霉素A在不同黃霉素標準品中的質量分數(n=6)

2.2 液相色譜串聯質譜條件的優化

2.2.1 色譜條件的優化

黃霉素極性較強,普通的C18柱子容易受到基質效應的影響,峰形不理想。Atlantis?T3色譜柱使用高純度硅膠及雙鍵鍵合C18技術,并對填料的孔徑大小、端基封口以及 C18的鍵合密度進行優化,從而使色譜柱具有對黃霉素A保留能力強,對低pH條件下的色譜十分有利,能保證黃霉素A具有良好的分離穩定性,色譜柱峰形尖銳對稱,靈敏度更高,保留時間也更適合。

研究分別選取乙腈、甲醇作為備選有機相,以超純水、體積分數0.1%氨水為備選水相,流動相兩兩配比。結果表明甲醇和乙腈作為有機相,都能較好地分離出黃霉素A,但乙腈相對于甲醇,系統整體的柱壓下降了13%,目標峰的保留時間也更為穩定。在負離子模式下,微量的氨水可以提供ESI源在Q1四極桿內離子化所需的負離子,從而提高離子化效率,得到更好的色譜峰形和更高的靈敏度[22]。但本實驗發現,在高pH值的流動相環境下,黃霉素A的響應值反而降低,主要與黃霉素呈弱酸性有關。相反,實驗同樣嘗試了pH 5.0的5 mmol/L乙酸銨溶液作為水相,其使得黃霉素A的離子峰形更加尖銳,響應也更高。

黃霉素是以黃霉素A(C69H108N5O34P)、黃霉素A12(C68H106N5O34P)、黃霉素C1(C62H96N5O28P)、黃霉素C3(C63H98N5O28P)、黃霉素C4(C63H98N5O29P)為主的多組分混合物?？紤]到5種活性成分的分子質量均在1 000 u以上,將配制的質量濃度為1.0 μg/mL的黃霉素標準溶液通過注射泵注入質譜儀中進行一級質譜全掃描(分子量掃描范圍:50～2 000 u),黃霉素在電離過程中產生2個明顯的母離子,分別為[M-2H]2-m/z1 580.7和[M-2H]2-m/z789.9,其中[M-2H]2-m/z789.9的響應遠高于[M-2H]2-m/z1 580.7(圖2),因此在質譜優化過程中以[M-2H]2-m/z789.9作為黃霉素的母離子。根據文獻可知,[M-2H]2-m/z789.9為黃霉素A的母離子,因此實驗利用液相色譜—串聯質譜主要測定黃霉素混合物中黃霉素A的含量。

同樣地,將母離子[M-2H]2-m/z789.9進行二級質譜全掃描(分子質量掃描范圍:50～800 u),只找到了2對離子[M-2H]2-m/z789.9/553.9和[M-2H]2-m/z789.9/575.9,且2個通道幾乎都沒有雜質干擾(圖2)。因此實驗對2對離子進行CE優化,并選取相對豐度較高且穩定的特征碎片離子[M-2H]2-m/z789.9/575.9作為定量離子,[M-2H]2-m/z789.9/553.9作為定性離子對,以滿足歐盟657/2002/CE指令對禁用藥物定性檢測的規定,即滿足1個母離子和至少2個子離子共4個識別點數的要求[23]。圖3為黃霉素A的多反應監測色譜圖。

圖2 黃霉素標樣的一級掃描和二級全掃描質譜圖

圖3 黃霉素A的TIC和MRM色譜圖(100.0 ng/mL)

另外,為了驗證黃霉素A的色譜分離具有唯一性,不受其他組分的影響。實驗還利用LC-Q-TOF-MS高分辨四極桿飛行時間質譜儀在相同的流動相條件下研究了黃霉素混合物的分離結果。最終發現,黃霉素A在9.087min保留,此時無其他黃霉素活性成分(圖4)。由上而下依次為8.933 min處黃霉素A12[M-2H]2-m/z1 567.6/782.8的母離子全掃圖;9.087 min處黃霉素A [M-2H]2-m/z1 581.6/789.9的母離子全掃圖;9.606 min處黃霉素C1[M-2H]2-m/z1 389.6/693.8的母離子全掃圖;9.995 min處黃霉素C3[M-2H]2-m/z1 403.6/700.8的母離子全掃圖;10.279 min處黃霉素C4[M-2H]2-m/z1 419.6/708.8的母離子全掃圖。LC-Q-TOF-MS能較好地分離5種活性成分,但定量的穩定性卻不是很理想,相對標準偏差在16%以上。

圖4 黃霉素混合物在超高分辨質譜儀中分離的結果(100.0 ng/mL)

2.2.2 提取條件的選擇

通過對黃霉素A分子結構的研究,可知其僅溶于水和低分子醇。實驗考察了甲醇和甲醇/水對飼料基質加標樣品回收率的影響(禽濃縮飼料、禽配合精飼料、禽添加劑預混合飼料、畜濃縮飼料、畜配合精飼料、畜添加劑預混合飼料)。結果表明,當提取溶劑為甲醇,6種基質提取效率均較高,接近80%,而甲醇/水提取效率較低(見表4)?？赡苁且驗辄S霉素為弱酸性物質,水為弱電離介質,水中的羥基對黃霉素A的作用力要遠小于甲醇中的羥基。實驗進一步考查了體積分數10%氨化甲醇溶液和0.1%甲酸甲醇溶液對于黃霉素A回收率的影響。0.1%甲酸甲醇溶液有助于提升黃霉素A的回收率,甲酸除了能降低提取液的pH值,還具有協助甲醇沉淀蛋白類雜質的作用,可以進一步降低基質效應。另外,考慮到黃霉素A在電離過程中會失去電子,本實驗嘗試用10%氨化甲醇溶液作為提取液,但回收率有一定的下降,這是因為氨化甲醇作為提取液更適用于肉制品基質中黃霉素A的提取[24,25],對于基質更為復雜的飼料基質來說,氨水提取時,會造成飼料黏糊成小顆粒,降低提取回收率的同時,影響結果的穩定性。因此,實驗最終選擇10%甲酸甲醇溶液作為提取劑。

表4 不同提取劑對6種飼料基質中黃霉素A提取回收率的影響(n=6)

2.2.3 凈化條件的確定

基質經過0.1%甲酸甲醇提取后,吸取10 mL上清液,選擇C18、Oasis HLB, Oasis PRiME HLB和氨基Amino-NH2固相萃取小柱進行凈化條件考察(飼料基質中,抗生素的添加含量通常較高,無需濃縮)。由表5可見,只有Oasis PRiME HLB固相萃取對于黃霉素A的回收率有一定的提升作用。

利用普通C18和Oasis HLB凈化提取液,得到的黃霉素A回收率均有一定的下降,無法充分地去除雜質。主要由于黃霉素A用甲醇提取,而常用的SPE(Solid-Phase Extraction)通常用強極性溶劑(如甲醇)洗脫,導致目標物大多在上樣時沒有保留。另外,在洗脫過程中,因為飼料基質的復雜性,導致SPE柱經常堵塞,對結果的穩定性也有一定的影響。而Oasis PRiME HLB能有效地將雜質保留在填料中,其通過篩板、填料以及制作工藝上的特殊設計,使樣品經提取后直接過柱凈化、收集,將黃霉素A在凈化過程中的損失降低到了最低。6種基質的總體回收率上升了1.6%,特別能將添加劑預混合飼料基質的回收率提升至80%左右。同時,整個凈化過程較為穩定,樣品更加潔凈,基質效應更小;Amino-NH2適合于極性化合物,弱陰離子交換萃取,但對于黃霉素A的保留結果也不理想,并且伴有較強的基質效應。因此,本實驗選用Oasis PRiME HLB固相萃取作為凈化方式。

表5 不同凈化條件對飼料中黃霉素A的提取效率的影響(n=6)

2.3 方法學評價

2.3.1 檢出限、定量限和線性關系

飼料基質復雜,本實驗選擇畜用(牛)和禽用(雞)各3類基質的空白樣品作為考察對象。在空白基質中添加一定濃度的黃霉素對照品,按照該方法進行測定。在液相色譜-串聯質譜儀上,依據定量離子信號與噪聲比例,即s/n≥3的含量為檢出限(LOD),s/n≥10的含量為定量限(LOQ)的原則,確定質譜方法的檢出限為100 μg/kg,定量限為250 μg/kg。黃霉素A在10.0～1 000.0 ng/mL范圍內線性良好。其中,畜濃縮飼料基質的線性相關系數(R2)為0.999 8,線性方程為Y=246.899X+1 164.82。圖5為(牛)預混飼料基質的空白和加標總離子流圖。

注:加標水平:5 LOQ。圖5 (畜)預混料基質色譜圖

2.3.2 回收率和精密度

選取畜和禽的空白基質進行為期1個月的加標回收率及精密度實驗,樣品分別添加低、中、高3個濃度的標準溶液(6基質×6平行×4批次)。不同飼料基質中黃霉素A的平均加標回收率為69.69%～88.60%,RSD為0.96%～3.38%。

由表6可知,濃縮飼料基質的回收率結果較為理想,回收率較高,穩定性也較強。濃縮飼料的顆粒較大,比表面積較小,目標物更容易被有機溶劑提取[26];基質相對復雜的添加劑預混合飼料為一種或多種微量組分與稀釋劑或載體按要求配比,均勻混合后制成的中間型配合飼料產品。添加劑預混合飼料顆粒最細,目標物通常較難被提取,基質效應導致禽類和畜類基質整體的回收率均偏低,約3%;配合精飼料主要由能量飼料和蛋白質飼料組成,基質本身最為復雜,其中的顆粒大小不同,但平均比表面積較小[27]。因此,配合精飼料與添加劑預混合飼料的平均回收率沒有顯著差異,但配合精飼料結果的相對標準偏差更小,結果更為穩定。實驗結果均滿足食品質量規范技術要求,因此可以說明本方法的準確性和精密度均較為理想,能夠滿足黃霉素精確定量的檢測要求。

表6 不同飼料基質中黃霉素A及其折算后黃霉素的加標回收率及相對標準偏差(n=6)

3 結論

黃霉素A在液相色譜-串聯質譜法測定下的線性范圍為10.0～1 000.0 ng/mL,基質曲線線性相關性均良好,線性相關系數均>0.998 6。各飼料基質的最低檢出限為100 μg/kg,定量限為250 μg/kg,加標回收率在69.69%～88.60%之間,RSD在0.96%～3.38%之間。同時,黃霉素5種活性成分可以通過高效液相色譜法分離而得,經面積歸一化法可知黃霉素A的所占比例為86.2%,RSD為0.66%,實驗結果穩定,可以用黃霉素A來折算黃霉素的含量,最終得出各類飼料基質中,黃霉素類抗生素殘留量的回收率在80.66%～102.55%之間。結果符合《獸藥殘留檢測標準操作規程》和GB/T 23182—2008相關標準要求。因此,該方法適用于常用飼料中黃霉素的測定,對黃霉素總殘留量檢測在飼料領域標準的制定具有較高的參考價值。

致謝

感謝農業農村部農產品質量安全監管司和上海市食品質量安全檢測與評價專業技術平臺對本實驗的支持,感謝農業部委員會專家對本實驗方法的認可和優化意見,并感謝上海市獸藥飼料檢測所的專家和美國普渡大學食品科學與工程學院的教授對本實驗的指導和建議。