堿性蛋白酶水解時間對玉米谷蛋白理化性質及抗氧化活性的影響

董 原, 劉曉蘭, 鄭喜群, 孟 杰, 姜彩霞, 李冠龍

(齊齊哈爾大學食品與生物工程學院1,齊齊哈爾 161006) (黑龍江省玉米深加工理論與技術重點實驗室2,齊齊哈爾 161006) (黑龍江八一農墾大學國家雜糧工程技術中心3,大慶163319) (齊齊哈爾市檢驗檢測中心4,齊齊哈爾 161005)

玉米是世界上總產量最多的糧食作物,具有廣泛的經濟和社會價值。玉米蛋白粉(CGM)是玉米濕磨工藝的主要副產物,含質量分數約67%～71%的蛋白質[1]。CGM蛋白含有豐富的疏水性氨基酸、亮氨酸、丙氨酸和苯丙氨酸,被認為是制備生物活性肽的良好來源[2]。玉米谷蛋白約占CGM總蛋白質質量分數的30%,是一種復雜的大分子蛋白質,由大約20個分子質量為11～127 ku的蛋白質亞基構成[3]。玉米谷蛋白中含有豐富的谷氨酰胺,能夠有效促進腸道代謝和提高人體免疫力[4,5]。由于玉米谷蛋白中大部分蛋白質亞單位通過二硫鍵和疏水鍵相互作用緊密相連,因此在水溶液中很難溶解[6,7]。為了擴大玉米谷蛋白在食品工業中的應用,必須改善其溶解性和其他功能性質。

酶法水解主要是通過生物酶破壞主鏈中的肽鍵修改蛋白質結構,從而達到改善蛋白質溶解性和其他功能性質。另外水解產物常含有一定量的二肽和三肽,使其具有更好的吸收作用[8,9]。Jiang等[10]利用復合蛋白酶水解玉米谷蛋白鑒定出4種具有不同抗氧化活性的新肽,具有較高的羥自由基清除能力。堿性蛋白酶能水解具有廣泛特異性的蛋白質,由堿性蛋白酶制備的水解物顯示出更好的溶解性和良好的生物活性[11]。王彬彬等[12]和崔寧等[13]分別采用堿性蛋白酶和雙酶協同水解玉米谷蛋白的方法制備的水解物具有較高的抗氧化活性,并對乙醇誘導損傷的LO2細胞具有保護。目前利用堿性蛋白酶水解玉米谷蛋白改善其功能特性的研究較少,本研究通過探究不同水解時間獲得的玉米谷蛋白水解物的表面疏水性、二硫鍵含量、熱性能、分子質量分布、溶解性、乳化性、起泡性及其抗氧化活性,為玉米谷蛋白水解物的應用推廣提供技術支持,以期將谷物副產物轉化為功能性食品和營養劑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

玉米蛋白粉:黑龍江省;堿性蛋白酶(2.1×105U/g);ANS,DNTB,Ellman,抑肽酶,桿菌肽,藍色葡聚糖2000均為色譜純;其他試劑均為分析純。

RF-5301PC型Versafluor熒光計系統,1100高效液相色譜,DSC-60 Plus差示掃描量熱儀,CR30NX冷凍離心機,Millrock真空冷凍干燥機。

1.2 實驗方法

1.2.1 玉米谷蛋白的制備

稱取一定量經擠壓膨化和脫淀粉后的玉米蛋白粉按1∶10(g/mL)加入丙酮攪拌30 min以去除色素,經4 000 r/min 離心15 min收集沉淀物,再按照1∶10(g/mL)加入體積分數為70%乙醇溶液于60 ℃水浴中浸提2 h,經4 000 r/min 離心15 min收集沉淀物以去除醇溶蛋白。所得沉淀物經低溫烘干后按1∶10(g/mL)加入0.1 mol/L NaOH溶液于60 ℃水浴中浸提2 h,冷卻至室溫,離心收集上清液,調節pH值至4.8,離心得沉淀后分別經體積分數為70%乙醇溶液和蒸餾水洗滌3次,冷凍干燥得玉米谷蛋白。

1.2.2 玉米谷蛋白水解物的制備

稱取一定量玉米谷蛋白與pH 8.0的Tris-HCl緩沖液(0.02 mol/L)配制成質量分數為5%的蛋白懸液,堿性蛋白酶添加量為1 g/100 g底物、溫度為60 ℃、水解時間90～180 min,沸水浴15 min終止反應。經5 000 r/min離心15min上清液進行冷凍干燥。

1.2.3 水解度的測定

根據文獻[13]中的表述,采用pH-stat法。

1.2.4 蛋白含量的測定

采用福林酚法[14]測定可溶性蛋白含量。

1.2.5 二硫鍵含量測定

參照Wen等[15]和Tang等[16]的方法測定玉米谷蛋白及其水解物的巰基含量(SH)和二硫鍵含量(SS)。

式中:D為稀釋系數(6.08);C(mg/mL)為受試樣品中的蛋白質含量;A412為412 nm處相對于試劑空白的吸光度。

1.2.6 表面疏水性的測定

參照Zheng[17]的方法,使用ANS作為疏水熒光探針,準確稱取30 mg樣品溶于10 mmol/L PBS緩沖液(pH 7.0),經10 000 r/min離心10 min,上清液用0.22 μm濾膜過濾,經磷酸鹽緩沖液將樣品質量濃度稀釋至0.01 ～0.02 mg/mL。取其中5 mL樣品溶液與25 μL 8 mmol/L ANS溶液混合,在390 nm(激發光)和470 nm(發射光)波長處測量其熒光強度。通過線性回歸分析計算相對FI與蛋白質質量濃度(mg/mL)圖的初始斜率(S0),并將其用作表面疏水性(H0)的指數。

1.2.7 差示掃描熱量法(DSC)的測定

稱取干燥的樣品約3 mg于預先稱重的鋁盒,并從0 ℃加熱至200 ℃,加熱速度為10 ℃/min。以空鋁盒對對照,利用相關軟件計算峰值溫度(Tp)和總熱量焓(ΔH)。

1.2.8 分子質量分布的測定

利用高效液相色譜(HPLC)法測定玉米谷蛋白及其水解物的分子質量分布。上樣量為5 μL,色譜柱為Superdex肽10/300 GL柱(10 mm×300 mm),洗脫液為含0.15 mol/L NaCl溶液的20 mmol/L PBS緩沖液(pH 7.0),流速0.25 mL/min。以標準抑肽酶(6.5 ku)、桿菌肽(1.4 ku)作對照。利用藍色葡聚糖2 000(2 000 ku)測量柱的空隙體積。在214 nm處監測洗脫液的吸光度。

1.2.9 玉米谷蛋白及其水解物理化性質表征

參照文獻[11]的方法測定樣品的溶解度。另外將樣品配制成質量分數為1%的蛋白質溶液,參照文獻[18]分別測定樣品的乳化性與乳化穩定性、起泡性與泡沫穩定性。

1.2.10 玉米谷蛋白水解物抗氧化活性測定

參照JIN[19]的方法測定玉米谷蛋白水解物的DPPH自由基清除率、羥自由基(·OH)清除率以及Fe2+螯合率,其中樣品質量濃度為2 mg/mL,以質量濃度0.01 mg/mL的抗壞血酸(VC)作為陽性對照組。

1.3 數據處理

所有數據均測量3次,結果以“平均值±標準誤差(SD)”表示。通過方差分析(ANOVA)比較不同組別之間的差異性(P<0.05),并利用Origin2019繪圖。

2 結果與分析

2.1 玉米谷蛋白的水解

課題組前期實驗結果表明堿性蛋白酶水解玉米谷蛋白的最適底物質量分數為5%、pH 8.0、溫度為60 ℃、堿性蛋白酶添加量為1 g/100 g底物。本研究以水解度(DH)和可溶性蛋白含量為指標考察不同水解時間60、90、120、150、180 min對玉米谷蛋白水解物的影響,結果如圖1所示。玉米谷蛋白DH和可溶性蛋白含量都隨著反應時間的增加而增加,反應最初迅速增加,當水解時間為150 min時,玉米谷蛋白DH為(19.04±0.41)%,可溶性蛋白質量分數為(22.46±0.62)mg/L,較Zheng等[17]利用復合蛋白酶水解玉米谷蛋白在相同水解時間下蛋白DH明顯提高,說明堿性蛋白酶更利于玉米谷蛋白的水解。

注:字母不同表示差異顯著(P<0.05)。圖1 不同水解時間玉米谷蛋白水解物的水解度和可溶性蛋白含量

2.2 玉米谷蛋白及其水解物的二硫鍵含量、表面疏水性和熱性能

大量研究發現蛋白質中二硫鍵含量、表面疏水性和熱性能等都與蛋白質的構象和功能性質密切相關[20,21]。如表1所示,玉米谷蛋白中二硫鍵含量較高,說明其蛋白結構具有高度聚集性。經堿性蛋白酶水解后玉米谷蛋白水解物中二硫鍵含量顯著降低(P<0.05),表明水解作用可以增強二硫鍵與巰基的活性,促進了巰基與二硫鍵之間的轉化,導致二硫鍵含量的變化,進而有效降低玉米谷蛋白聚集的傾向性,有利于提高其在水中的溶解度和其他功能特性。而玉米谷蛋白水解物90 min內其表面疏水性明顯高于初始的玉米谷蛋白,可能的原因是谷蛋白內部的疏水斑塊由于去折疊化而暴露于分子的外表面[22],但實驗過程中發現并不會產生聚集現象,且隨著水解時間的增加其表面疏水性呈現降低趨勢。一般而言高Tp值通常意味著高熱穩定性,因此玉米谷蛋白及其水解物的高Tp值表明其都具有良好的熱穩定性。另外,水解可以顯著降低玉米谷蛋白的總熱量焓ΔH(P<0.05),表明水解過程中蛋白質的有序結構和聚集傾向降低。

表1 玉米谷蛋白及其水解物的二硫鍵含量、表面疏水性和熱性能

2.3 玉米谷蛋白及其水解物的溶解性

溶解性是蛋白質功能特性的重要先決條件,并直接影響其在食品工業中的應用。如圖2所示,玉米谷蛋白在蒸餾水(pH 7.0)中溶解度僅為(1.99±0.28)%,可能是由于玉米谷蛋白為剛性大分子結構,含有較多的分子間和分子內二硫鍵和疏水相互作用力。經堿性蛋白酶水解后玉米谷蛋白水解物的溶解性顯著增加(P<0.05),當水解時間為150 min時玉米谷蛋白水解物的溶解度為(97.28±0.83)%。與玉米谷蛋白相比,其水解物的溶解度提高可能歸因于肽鏈的展開、蛋白酶水解引起的尺寸減小以及更多帶電殘基和極性基團的暴露等因素有關,這些結構變化改善了蛋白質與水的相互作用,從而提升了溶解性[23]。

注:字母不同表示差異顯著(P<0.05),余同。圖2 不同水解時間玉米谷蛋白水解物的溶解性

2.4 玉米谷蛋白水解物的分子質量分布

蛋白質水解物的分子質量分布作為最重要的特性之一能直接影響其作為功能食品的應用。由于谷蛋白水解液中形成了多種類型的肽,因此肽類型的數量超出了凝膠過濾色譜柱的分辨率,因此玉米谷蛋白水解物按分子質量大小可分為:Mw>2 000 u、600 u

圖3 不同水解時間玉米谷蛋白水解物的分子質量分布

2.5 玉米谷蛋白及其水解物的乳化性和乳化穩定性

玉米谷蛋白及其水解物在pH 7.0時的乳化性和乳化穩定性如圖4所示。玉米谷蛋白水解物的乳化性顯著提升(P<0.05),均保持在較高的水平,表明水解后玉米谷蛋白的溶解度增加,使蛋白質容易擴散到油/水界面。但不同水解時間對玉米谷蛋白及其水解物的乳化穩定性變化不大,可能是水解過程中形成的可溶性聚集體可以在油水界面形成一層剛性膜,防止油滴的緊密接觸,避免絮凝和聚結[24]。

圖4 不同水解時間玉米谷蛋白水解物的水解度乳化性/乳化穩定性

2.6 玉米谷蛋白及其水解物的起泡性和泡沫穩定性

玉米谷蛋白及其水解物在pH 7.0時的起泡性和泡沫穩定性如圖5所示。玉米谷蛋白的起泡性為(83.13±8.24)%,低于大米蛋白的起泡性(118.8%)[25](P<0.05),這可能是由于玉米谷蛋白在pH 7.0的水中溶解度差。玉米谷蛋白水解物的起泡性和泡沫穩定性均顯著高于玉米谷蛋白(P<0.05),可能是由于堿性蛋白酶水解能顯著提高蛋白質的溶解性,降低了其分子質量和二硫鍵含量,從而促進了界面膜的形成和泡沫的產生。

圖5 不同水解時間玉米谷蛋白水解物的起泡性、泡沫穩定性

2.7 玉米谷蛋白水解物抗氧化活性

大量文獻表明DPPH自由基清除率、羥自由基(·OH)清除率以及Fe2+螯合率已廣泛用于評估天然化合物的抗氧化活性。由于玉米谷蛋白本身幾乎不溶于蒸餾水,因此未檢測其抗氧化活性。由圖6可知,所有測試樣品對DPPH、·OH都表現出良好的清除能力和較高的Fe2+螯合率,當水解時間為150 min時,玉米谷蛋白水解物DPPH清除率為(54.46±1.43)%,羥基自由基(·OH)清除率為(74.06±1.49)%,Fe2+螯合率為(86.69±1.35)%,均顯著高于其他水解物組(P<0.05),而質量濃度為0.01mg/mL的VC組對Fe2+幾乎沒有螯合能力。結果表明,玉米谷蛋白水解物含有電子供體物質,可與自由基反應,將其轉化為穩定產物,終止自由基連鎖反應。同時,玉米谷蛋白水解物具有良好的羥清除活性,可以保護食物或生命系統免受羥自由基誘導的損傷。另外,當水解時間小于150 min時,可能是由于酸性和堿性氨基酸側鏈中的羧基濃度增加導致水解物的Fe2+螯合能力增強[26]。

圖6 不同水解時間玉米谷蛋白水解物的抗氧化活性

3 結論

堿性蛋白酶可有效水解玉米谷蛋白,獲得具有較強抗氧化活性的玉米谷蛋白水解物,增加了其水解物的表面疏水性,降低了蛋白質的分子質量和二硫鍵含量,并最終在水解過程中將其不溶性天然聚集體轉化為可溶性聚集體。玉米谷蛋白及其水解物都保持了較高的熱穩定性。與玉米谷蛋白相比,其水解物具有更高的溶解性,改善了蛋白的起泡性和乳化性。