河北省圈養貉子隱孢子蟲流行現狀調查

陳東前, 張玉瑾, 王建秋, 王明星, 祝玉巧, 羅 輝, 王秋悅, 劉欣超, 李文超*

(1.安徽科技學院 動物科學學院,安徽 鳳陽 233100;2.動物營養調控與健康安徽省重點實驗室,安徽 鳳陽 233100;3.河北科技師范學院 河北省預防獸醫重點實驗室,河北 秦皇島 063000)

隱孢子蟲病(Cryptosporidiosis)是由隱孢子蟲(Cryptosporidiumspp.)引起的一種呈全球性分布的人獸共患原蟲病,主要感染脊椎動物,其癥狀表現為腹瀉、營養不良、生長發育受阻等[1-3]。該蟲通過糞-口途徑傳播,人或動物通過攝入被隱孢子蟲卵囊污染的水或食物,或直接接觸隱孢子蟲病患者或患病動物而引起感染,嚴重會導致死亡[4-5]。

貉子(NyctereutesprocyonoidesGray)為食肉目(Carnivoraes)、犬科(Canidae)、貉屬(Nyctereutes)動物,其作為一種珍貴的毛皮動物,具有很高的經濟價值。寄生蟲病嚴重威脅貉子健康的一類疾病,尤其是人工飼養的貉子,其飼養密度較高,活動范圍窄,易引起寄生蟲病流行。目前,已報道貉子可感染犬隱孢子蟲(C.canis)、微小隱孢子蟲(C.parvum)和安氏隱孢子蟲(C.andersoni)等3種常見人獸共患隱孢子蟲蟲種,其中C.parvum還是人最常感染的兩種隱孢子蟲之一[6-12]。

目前中國貉子養殖主要分布在東北三省及山東、河北等省份[13]。迄今,中國山東[6]、河南[7]、新疆維吾爾自治區[14]、東北三省[8,15]等省份已有貉子隱孢子蟲感染的相關報道,河北省作為貉子養殖大省之一,目前僅見昌黎地區有貉子隱孢子蟲感染的報道[7],因此相關研究不能很好地反映河北省貉子隱孢子蟲感染與蟲種/基因型分布的真實情況。鑒于此,本研究對河北省多地人工養殖的貉子進行隱孢子蟲的分子流行病學調查,了解貉子中隱孢子蟲流行情況并評估其可能蘊含的公共衛生風險,為相關研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2022年6—12月,分別從河北省石家莊市、邯鄲市、秦皇島市和張家口市等地區的5家貉子場共采集389份新鮮糞便樣品。上述養殖場中,貉子均飼養在聯排金屬籠子中,糞便直接漏到籠子下方的地面上。成年貉子(6月齡以上)一般一籠單只飼養,幼齡貉子分窩前(45～60日齡斷奶分窩)和母貉子合籠飼養,分窩后多只合并飼養一段時間后再分籠飼養。采樣時從籠具下方的糞堆上部采集新鮮糞便10～20 g,每個籠子僅采1次。糞便裝入潔凈自封塑料袋中,編號并記錄對應采樣場、貉子年齡及糞便狀況等信息,放置于4 ℃冰箱內冷藏待檢。

1.2 主要儀器與試劑

T100型PCR儀(伯樂生命醫學產品(上海)有限公司),Tanon1600凝膠成像系統(上海天能科技有限公司)。糞便DNA提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司),rTaq DNA聚合酶(上海澤葉生物科技有限公司);BIOWESTE瓊脂糖(北京沃比森科技有限公司)。本研究所用引物均委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 糞便基因組提取

依照產品說明書進行操作,提取的DNA保存于-20 ℃冰箱待檢。

1.4 隱孢子蟲SSU rRNA基因擴增

參照Xiao等[16]的研究,用巢式PCR方法擴增隱孢子蟲SSUrRNA基因,引物見表1。2輪PCR反應體系體積相同,依次加入38.55 μL超純水、5 μL 10×PCR緩沖液、1 μL DNA模板(首輪PCR用提取的貉子糞便基因組DNA,第2輪PCR用首輪PCR產物)、0.6 μL 20 mol/L各正反引物、4 μL 1.25 mmol/L dNTP和0.25 μL 5 U/μL rTaq酶。首輪PCR反應參數設置為94 ℃ 5 min;94 ℃ 45 s,55 ℃ 45 s,72 ℃ l min,共35個循環;72 ℃ 10 min。第2輪PCR除退火溫度調整為58 ℃外,其余參數同首輪PCR。用感染隱孢子蟲的豬糞便基因組DNA作陽性對照,隱孢子蟲陰性豬糞便DNA提取物作陰性對照。

表1 本研究中所用引物Table 1 PCR primers used in the present study

1.5 隱孢子蟲gp60基因擴增

參照Jiang等[17]的引物與方法,對獲得的隱孢子蟲SSUrRNA陽性樣本進行隱孢子蟲gp60基因的擴增,引物見表1。2輪PCR反應體系體積相同,含1 μL貉子糞便基因組DNA(首輪PCR)或2 μL首輪PCR產物(第2輪PCR)、0.6 μL 20 mol/L各正反引物、5 μL 10×PCR緩沖液、4 μL 1.25 mmol/L dNTP、0.3 μL 5 U/μL rTaq酶、38.50 μL超純水。2輪PCR反應擴增反應的參數相同,為94 ℃ 5 min;94 ℃ 45 s,52 ℃ 45 s,72 ℃ 80 s,共35個循環;72 ℃ 10 min。

1.6 測序與分析

第2輪PCR擴增后,產物進行凝膠電泳分離,所獲陽性擴增產物送相關公司,分別用擴增基因的第2對引物從正方和反方進行雙向測序。測序序列用Dnaman軟件進行編輯,在GenBank數據庫中經Blast搜索。為評價所獲隱孢子蟲蟲種/基因亞型的遺傳關系,所獲序列經Clustal X軟件比對,采用最大似然法(Maximum-likelihood Method)在Mega軟件中構建進化樹,可逆取代模型用于替代率的計算,自展值設為1 000。新發現的隱孢子蟲基因亞型根據既定的命名系統命名[15]。

1.7 統計分析

應用SPSS 20.0軟件對本研究中的數據進行Fisher's 精確檢驗分析,P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 河北省貉子隱孢子蟲感染情況

389份貉子糞便樣本中,基于SSUrRNA基因的巢式PCR方法共檢出6份隱孢子蟲陽性樣品,河北省圈養貉子隱孢子蟲感染率為1.5%(6/389)(表2)。隱孢子蟲陽性樣本分布在邯鄲、秦皇島和張家口貉子養殖場,感染率分別為2.9%(3/103)、2.0%(2/100)和1.2%(1/86),石家莊未檢出隱孢子蟲陽性樣品,不同地區感染率差異無統計學意義(χ2=3.059,P=0.063)。6月齡以上貉子隱孢子蟲感染率為1.2%,6月齡以下貉子隱孢子蟲感染率為1.6%,二者差異不顯著(χ2=0.096,P=0.384)。糞便正常和非正常貉子隱孢子蟲感染率分別為0.6%和11.1%,差異顯著(χ2=23.18,P=0.001)(表3)。

表3 河北省圈養貉子隱孢子蟲感染在不同年齡、糞便類型中的分布情況Table 3 Prevalence of Cryptosporidium spp. among different age, and feces form groups of raccoon dogs in Hebei Province

2.2 貉子隱孢子蟲遺傳分析情況

對所獲得的6份隱孢子蟲SSUrRNA基因PCR陽性產物進行測序和比對,顯示本研究中得到的6個隱孢子蟲SSUrRNA基因序列完全一致,Blast分析顯示其均為C.canisSSUrRNA基因,與GenBank中參考序列AF112576有100%同源性。進化構建樹顯示分離得到的隱孢子蟲SSUrRNA基因與已報道的多個C.canis分離株聚為一支,進一步表明本研究中所獲得的隱孢子蟲蟲種為C.canis(圖1)。

圖1 基于SSU rRNA基因構建的隱孢子蟲進化樹(最大似然法,可逆取代模型)Fig.1 Phylogeny of Cryptosporidium spp. based on the partial SSU rRNA gene (the maximum-likelihood method, and the general time-reversible model)注:▲為本研究所獲犬隱孢子蟲SSU rRNA基因序列。

6份隱孢子蟲SSUrRNA基因陽性樣本中,5份樣本gp60基因被成功擴增和測序,序列經比對,剔除相同序列,得到兩個隱孢子蟲gp60序列,Blast分析顯示其分別與C.canis基因亞型XXa2(登錄號為MT954605)和XXa4(登錄號為MT954607)序列一致。構建進化樹顯示分離得到的兩個隱孢子蟲gp60基因分別與已報道的C.canis基因亞型XXa2(登錄號為ON863566和MT954605)和C.canis基因亞型XXa4(登錄號為ON863565和MT954607)聚為一支,進一步表明本研究中所獲得的兩個C.canis其基因亞型分別為XXa2和XXa4(圖2)。

圖2 基于gp60基因構建的犬隱孢子蟲亞型家族進化樹(最大似然法,可逆取代模型)Fig.2 Phylogenetic relationship of C. canis gp60 nucleotide sequences (the maximum-likelihood method, and the general time-reversible model)注:▲為本研究所獲犬隱孢子蟲gp60基因序列。

2.3 貉子隱孢子蟲蟲種/基因亞型分布情況

本次調查在河北省圈養貉子中共發現2種C.canis基因亞型,即XXa2和XXa4,分別占總樣本的0.5%(2/389)和0.8%(3/389)。除石家莊未檢出隱孢子蟲陽性樣品以及張家口貉子養殖場所獲陽性樣本測序不成功外,邯鄲和秦皇島貉子養殖場均檢出這2種C.canis基因亞型(表2)。

3 結論與討論

迄今,全球有關貉子隱孢子蟲的相關報道不多,且主要集中在中國、日本和波蘭等國,已報道的貉子隱孢子蟲感染率為2.5%～37.7%[6-8,10,14-15,18]。本研究中,河北省圈養貉子隱孢子蟲感染率為1.5%,低于目前相關報道,但高于王步康等[9]關于河北昌黎地區貉子的報道(感染率為0)。本研究中,6月齡以上貉子和6月齡以下貉子隱孢子蟲感染率間無顯著差異(χ2=0.096,P=0.384),這一結果與Zhang等[8]、Qian等[14]的研究結論一致,但與Wang等[6]、王步康等[9]的研究不一致,分析不同研究中結論不一致的原因,可能與不同研究中所用樣本量大小、采樣地點、飼養管理及樣本處理方法等不同有關。同時,本研究中,糞便不正常貉子隱孢子蟲感染率(11.1%)顯著高于糞便正常的貉子(0.6%)(χ2=23.18,P=0.001),分析其差異原因可能與動物的飼養環境與衛生管理等相關。

本研究中,C.canis是河北省圈養貉子檢出的唯一隱孢子蟲蟲種,這一結果與中國黑龍江[8]、新疆維吾爾自治區[14]、山東[6]等地的報道一致。C.canis是對人有致病性的5種最常見的隱孢子蟲蟲種之一,頻繁地發生于發展中國家人群[19]。從事貉子等毛皮動物養殖、銷售、加工的從業人員應了解該蟲種的傳播途徑等相關知識,做好自身防護,嚴防出現人畜共患傳播。

借助于新近開發的基于gp60基因的分型工具,分析顯示河北省圈養貉子感染的C.canis共存在2個基因亞型,即XXa2和XXa4,顯示貉子源C.canis具有一定的遺傳多樣性[17]。此外,XXa2和XXa4基因亞型在美國、秘魯、埃塞俄比亞和牙買加的人群中已有報道,進一步顯示貉子源C.canis具有人畜共患性,應引起高度重視[17]。Wang等[6]等研究顯示不同的毛皮動物感染的C.canis基因亞型不同,如貉子主要感染XXa,水貂只感染XXd和XXf,狐貍僅感染XXg,暗示毛皮動物源C.canis如同其他人群中常見的隱孢子蟲蟲種C.parvum,C.hominis和C.ubiquitum一樣,存在明顯宿主適應性[20]。未來尚需進一步加大對毛皮動物隱孢子蟲流行蟲種、傳播模式等的研究,以積累更多流行病學數據,進而闡明其隱孢子蟲蟲種遺傳多樣性和宿主適應性等特征。