水稻愈傷組織誘導及不定芽分化培養體系建立

唐靖雯, 錢晶晶, 王 寧, 曹柳晴, 洪文靜, 張從宇

(安徽科技學院,安徽 鳳陽 233100)

水稻(Oryzasativa.L)是人類重要的糧食作物之一[1-2],養育了全球超過1/2的人口。60多年來,中國科學家們圍繞水稻高產目標,通過一系列的品種選育與應用推廣,極大地提高了水稻的產量,為保障中國和世界糧食安全做出了巨大的貢獻[3]。如今,隨著生物技術的快速發展,中國水稻育種技術迎來新的挑戰和機遇。傳統育種面臨水稻產量低、抗性差等問題[4]。水稻育種技術的深入研究和基因組學技術的進步為水稻育種提供了新的思路[5-6]。因此,采用傳統育種和分子育種結合的方法,可以快速、準確地鑒定品種基因型,在保證其原有優良性狀的基礎上實現多基因聚合選育,從而獲得高產、穩定、優質、多抗等優良性狀的水稻新品種,以滿足未來市場的需求。

但水稻分子育種依然面臨許多技術問題[7],其中建立高效的再生體系是實現分子育種的必要前提[8]。水稻再生體系受基因型、外植體類型、基本培養基、植物生長物質和培養條件(光周期和溫度)等諸多因素影響[9]。目前,有關水稻組織培養已有相關報道[10-11],但存在分化率低、不定芽生長能力弱等問題[12]。因此,如何提高水稻的組培再生能力成了亟待解決的問題。

本研究以‘潤珠香占’成熟胚為外植體,探究不同培養基以及植物生長物質濃度配比對愈傷組織和不定芽誘導的影響,建立高效水稻愈傷組織誘導與不定芽分化培養體系,以期為水稻的快繁提供參考,同時為優良品種選育、遺傳轉化及基因功能研究等奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試水稻品種為‘潤珠香占’,由湖北中香種業科技股份有限公司提供。選取飽滿的成熟胚為外植體。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體消毒 挑選飽滿成熟水稻種子,手工剝去穎殼,用自來水沖洗30 min,在超凈工作臺上用無菌水沖洗4次,75%乙醇浸泡30 s,0.1% HgCl2消毒8 min,再用無菌水沖洗4～6次。將成熟胚接種于不同類型的培養基中,置于(25±2) ℃溫度下、光周期為12 h/d、光照為1 500～2 000 lx、相對濕度為60%～70%的培養室中進行培養。

1.2.2 不同培養基類型對愈傷的誘導 每種培養基(N6、B5、MS、WPM)內加入30.0 g/L蔗糖和6.0 g/L瓊脂,pH調至6.0±0.2,加入2.0 mg/L 2,4-D、0.1 mg/L VB8、1.0 mg/L VB1、1.0 mg/L VB6,放入高壓滅菌鍋中121 ℃下滅菌20 min。在超凈工作臺上將成熟胚放進培養基中,共4種類型的培養基,每種培養基處理7瓶,每瓶接入成熟胚3個,15 d后,觀察水稻種子成熟胚出愈情況并記錄數據。

1.2.3 不同濃度2,4-D對愈傷組織的誘導 以N6為基本培養基,加入30.0 g/L蔗糖、6.0 g/L瓊脂、pH調至6.0±0.2,加入0.1 mg/L VB8、1.0 mg/L VB1、1.0 mg/L VB6后,分別加入6種不同質量濃度2,4-D(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/L),放入高壓滅菌鍋中121 ℃下滅菌20 min,在超凈工作臺上完成接種工作。共6個梯度,每個濃度重復3次,每個濃度梯度接種5瓶,每瓶3個接入愈傷組織。接種完成后,置黑暗條件下36 d,觀察記錄并計算誘導率。

1.2.4 不同植物生長物質濃度配比對愈傷組織不定芽的分化 將分化能力強的愈傷組織接種至N6+30.0 g/L蔗糖+6.0 g/L瓊脂,pH調至6.0±0.2,加入0.1 mg/L VB8、1.0 mg/L VB1、1.0 mg/L VB6后,加入8種不同濃度的6-BA、KT、NAA,放入高壓滅菌鍋中121 ℃下滅菌20 min。在超凈工作臺上選取生長狀態良好的愈傷組織為外植體,接至不同濃度6-BA、KT、NAA的培養基中。共8組處理,每組3次重復。32 d后統計數據并計算愈傷分化率。

1.3 試驗數據處理

使用SPSS軟件對數據進行單向方差分析、雙向方差分析和鄧肯多重范圍檢驗,P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 不同培養基類型對愈傷誘導的影響

由表1可知,培養15 d后, B5、MS與N6培養基差異不顯著,WPM與N6、B5、MS培養基差異顯著。且N6培養基誘導的愈傷組織為淡黃色,分化能力強。因此,N6為水稻愈傷組織誘導的最佳培養基。

表1 不同培養基類型對愈傷誘導的影響Table 1 Effects of different media types on callus induction

2.2 不同2,4-D濃度對誘導愈傷組織的影響

由表2可知,不同2,4-D濃度誘導的水稻愈傷組織之間存在顯著差異。B4與B1、B2、B3、B5、B6處理組之間存在顯著差異; B1、B2、B5、B6與B3處理組之間存在顯著差異;B5和B6處理組之間差異不顯著。因此,水稻愈傷組織誘導適宜的2,4-D濃度為2.0 mg/L。

表2 不同2,4-D濃度對愈傷組織誘導的影響Table 2 Effects of different 2,4-D concentrations on callus induction

2.3 不同植物生長物質濃度配比對愈傷組織不定芽分化的影響

將愈傷組織切成0.5 cm2的小塊接至分化培養基中,培養20 d后愈傷組織長出嫩綠色小芽,32 d左右長出肉眼可見的嫩芽(見圖1)。由表3可知,T5處理組與其他處理組存在顯著差異;T7與T1、T2、T3、T4、T6、T8處理組之間差異顯著;T6與T1、T3、T8處理組之間差異不顯著。當NAA濃度為0.5 mg/L時,愈傷組織分化率較低,且叢生芽生長情況由黃色逐漸變為褐色,甚至死亡;但隨著NAA濃度增加至1.0 mg/L時,愈傷組織分化率顯著高于0.5 mg/L;當其為1.0 mg/L時,加入1.0 mg/L 6-BA和1.0 mg/L KT,愈傷分化率為71.67%;而加入1.0 mg/L 6-BA和2.0 mg/L KT,愈傷組織分化不定芽的能力較弱,低于50%。因此,當6-BA、KT、NAA的濃度為1∶1∶1時,愈傷組織分化不定芽能力強。

圖1 水稻愈傷組織的誘導及不定芽分化培養生長過程Fig.1 Induction of rice callus and growth process of adventitious bud differentiation culture注:A為N6培養基中成熟胚誘導的愈傷組織(15 d);B為愈傷組織生長情況(36 d);C為愈傷組織誘導的不定芽生長情況(32 d);D為愈傷組織誘導的不定芽生長情況(50 d)。

表3 不同植物生長物質濃度配比對愈傷組織從生芽分化的影響Table 3 Effects of different plant growth substance concentrations and proportions on callus differentiation from buds

3 結論與討論

本試驗通過對培養基類型、植物生長物質濃度等對水稻組織培養過程的影響進行篩選得出,N6為誘導水稻愈傷組織的最佳培養基,出愈率達到100%。最佳培養基配方為N6+30.0 g/L蔗糖+6.0 g/L瓊脂+2.0 mg/L 2,4-D+0.1 mg/L VB8+1.0 mg/L VB1+1.0 mg/L VB6,誘導出的愈傷組織結構緊實、顏色微黃,適于誘導分化苗。在探討不同植物生長物質濃度比例對水稻愈傷組織不定芽分化的影響中,當6-BA、KT、NAA的質量濃度比為1∶1∶1時,愈傷組織分化率達到71.67%,即最佳培養基配方為N6+30.0 g/L蔗糖+6.0 g/L瓊脂+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L KT+1.0 mg/L NAA+2.0 mg/L 2,4-D+0.1 mg/L VB8+1.0 mg/L VB1+1.0 mg/L VB6。本研究建立了水稻愈傷組織誘導及不定芽分化培養體系,為水稻育種奠定了研究基礎。

通過試驗得出,不同培養基對水稻組織培養具有一定的影響。以成熟胚為外植體,采用N6、B5、MS培養基為主。本研究得出,N6較其他培養基而言,對水稻愈傷組織的誘導有著積極的作用。張玲等[13]在水稻組織培養研究中表明N6對愈傷組織誘導有較好的促進作用;本研究結果與張智奇等[14]、袁云香等[15]研究結果一致。

研究表明,植物生長物質在植物組織培養中起著較大的作用[16-17]。本試驗中2.0 mg/L 2,4-D愈傷組織誘導為100%,與閻麗娜等[18]研究結果相同。郭曉麗等[19]研究同樣表明加2.0 mg/L 2,4-D可提高愈傷組織的誘導率,與本研究結果相同。生長素和細胞分裂素共同作用對于誘導不定芽的分化和生長有著積極的作用[20]。本試驗NAA是重要的激素之一,同時配以6-BA、KT效果較好,與朱克明等[21]所用的激素名稱一致,具體濃度不一致,可能是因為不同水稻品種對激素的耐受能力及敏感性不同。