生防菌代謝產物與化學殺菌劑對棉花枯萎病菌的抑制活性研究

周 慧, 段海明, 楊勝雨, 張 健

(安徽科技學院 農學院,安徽 鳳陽 233100)

棉花是我國重要的經濟作物之一,其產量一直位于世界前列,然而棉花枯萎病對我國乃至全球范圍內的棉花產量與質量均造成嚴重損失,屬于毀滅性病害[1]。棉花枯萎病在棉花整個生育期都會引起危害,苗期會引起棉苗大量死亡,棉花生長后期會導致植株枯萎、鈴重減輕,對棉花種子的發芽率、成熟度以及棉花纖維的強度與長度都會產生重要影響,開展該病害的防治措施研究具有重要意義[2]。

目前,棉花枯萎病的防治措施主要以化學防治為主。李海微等[3]得出0.30%四霉素水劑可有效防治南疆地區棉花枯萎病DD11和DD22菌株,抑菌效果分別達97.91%和99.35%;郭明程等[4]研究表明60%吡唑醚菌酯·代森聯WG以1 080 g/hm2的劑量防治棉花枯萎病,防效為58.52%～62.84%,并具有促生增產作用;鄭德有等[5]發現寧南霉素對棉花枯萎病菌抑制率達68.24%,EC50為8.03 mg/L。生物防治由于綠色無污染而日益引起研究者的重視。戴蓬博等[6]采用生物學特性觀察和16S rDNA基因序列分析等方法得出菌株SC11為壯觀鏈霉菌(Streptomycesspectabilis)是一株棉花枯萎病拮抗菌,其防效可達42.51%,且能提高棉花產量。張克誠等[7]進行了室內和田間試驗得出了鏈霉菌(Streptomycesspp.) S-5能有效抑制棉花枯萎病菌,防治效果為66.50%;Hao等[8]從棉花根組織分離得到的內生細菌DG3-1抑制棉花枯萎病同時增加葉綠素含量,鑒定為耐鹽農桿菌(Agrobacteriumspp.)。趙瑩瑩等[9]采用枯草芽孢桿菌KXZ-33發酵液處理種子和地上部噴施10 mg/L的甲基硫菌靈相結合可以提高防治棉花枯萎病的效果;高景凱等[10]從廣東石豆蘭中篩選內生細菌-枯草芽孢桿菌BK27發酵液,其對棉花枯萎病尖孢鐮刀菌萎蔫?；鸵种坡蕿?0.78%?；瘜W農藥大量過頻使用會引起病菌抗藥性、藥物殘留和環境污染等突出問題威脅農產品安全[11]。生物防治對環境無污染,但是對病害發揮效應較為緩慢。因此,化學防治和生物防治結合起來開展棉花枯萎病的防治具有重要意義。本研究開展了8種化學殺菌劑對棉花枯萎病菌的室內抑制活性和解淀粉芽孢桿菌所產發酵上清液和脂肽粗提物對病菌的的抑制效果研究,旨在篩選出對棉花枯萎病菌抑制效果較好的化學藥劑和生防菌株,從而為后續棉花枯萎病的綜合治理提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試殺菌劑 95%苯醚甲環唑原藥、96%戊唑醇原藥、96%腈菌唑原藥、96%多菌靈原藥、95%甲基硫菌靈原藥、97.6%萎銹靈原藥、95.6%丙環唑原藥由安徽省錦江農化有限公司提供。70%丙森鋅可濕性粉劑由拜耳作物科學有限公司提供。多菌靈使用0.1 mol/L HCl溶液配成1.0×104μg/mL,其它殺菌劑原藥采用丙酮溶解,配制成1.0×104μg/mL母液,置于4 ℃冰箱中保存備用;丙森鋅由滅菌水溶解配制而成。

1.1.2 供試菌株和培養基 棉花枯萎病病菌(Fusariumoxysporiumf. sp.vasinfectum)和解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)SJ06由本研究室提供。供試培養基包括PDA培養基、NA培養基和NB培養基[12]。

1.2 試驗方法

1.2.1 解淀粉芽孢桿菌SJ06與棉花枯萎病菌的對峙培養 接種環挑取SJ06菌苔接入距PDA平板中心相互垂直2 cm的四點處,再將棉花枯萎病菌菌餅(直徑7 mm)接至平板中心,以不接細菌的平板為對照,重復3次,置于26 ℃恒溫箱中培養,4 d后測量病菌直徑,計算抑制率。

1.2.2 不同稀釋倍數的發酵上清液對棉花枯萎病菌的抑制活性測定 接種解淀粉芽孢桿菌SJ06至NB培養基中,發酵培養時間為72 h。培養結束后以10 000 r/min,4 ℃離心制得發酵上清液分別稀釋到不同的濃度,然后取5 mL加入到冷卻到50 ℃左右的45 mL PDA培養基充分混勻,使得發酵上清液在PDA培養基中的終濃度分別為6.25、8.33、12.50、25.00和100.00 μL/mL,中央接種病菌后置于26 ℃恒溫箱中培養96 h,然后按照十字交叉法測定不同稀釋倍數的發酵上清液處理病菌的菌落直徑,采用SPSS 13.0軟件計算發酵上清液對棉花枯萎病菌的EC50。

1.2.3 脂肽粗提物的制備及抑制活性測定 采用李寶慶等[13]方法制備脂肽粗提物,將制得的脂肽粗提物稀釋不同梯度,取5 mL的脂肽粗提物與冷卻到50 ℃的45 mL PDA培養基充分混勻,使得脂肽粗提物的含量分別為673.96、1 015.00、2 030.00、4 060.00、8 120.00 μg/mL。然后計算脂肽粗提液對棉花枯萎病菌的EC50。

1.2.4 8種化學殺菌劑對棉花枯萎病菌的室內毒力測定 測定苯醚甲環唑、戊唑醇、腈菌唑、丙環唑、萎銹靈、多菌靈、甲基硫菌靈和丙森鋅對棉花枯萎病菌的抑制活性,8種化學殺菌劑在PDA中培養基的終濃度見表1。接種完畢后置于26 ℃恒溫箱中培養96 h,用十字交叉法測量菌落直徑。采用SPSS 13.0軟件求出8種化學殺菌劑對病菌的毒力回歸方程、EC50值、95%置信區間和R2。

表1 8種化學殺菌劑質量濃度設置Table 1 Concentration gradient of 8 fungicides

2 結果分析

2.1 解淀粉芽孢桿菌SJ06與棉花枯萎病菌對峙培養結果

由圖1可見,菌株SJ06對棉花枯萎病菌抑制效果明顯,能抑制病菌菌絲生長,抑制率平均值為78.24%,而且發現生防菌菌株SJ06可以將病原菌完全包圍,阻止其進一步發生擴展下一步可進行菌株產發酵上清液和脂肽粗提物對病菌的抑制活性研究。

圖1 解淀粉芽孢桿菌SJ06與棉花枯萎病菌對峙結果Fig.1 Effect of confrontation culture between B. amyloliquefaciens SJ06 and F. oxysporum f. sp. vasinfectum注:A為菌株SJ06與病菌對峙結果;B為對照。

2.2 不同稀釋倍數的發酵上清液對棉花枯萎病菌的抑制活性

由表2可見,解淀粉芽孢桿菌SJ06發酵上清液的濃度從6.25 μL/mL增至100.00 μL/mL,在26 ℃恒溫恒濕培養箱中培養96 h對棉花枯萎病菌的抑制率從46.90%增至80.30%,高濃度的發酵上清液對棉花枯萎病菌抑制作用較強(圖2)。經SPSS 13.0軟件分析得出發酵上清液對棉花枯萎病菌的EC50為7.37 μL/mL(R2=0.95)。

圖2 不同稀釋倍數的發酵上清液對棉花枯萎病菌的抑制效果Fig.2 Inhibitory effect of fermentation supernatant with different dilution times on F. oxysporium f. sp. vasinfectum

表2 不同稀釋倍數的發酵上清液對棉花枯萎病菌的抑制率Table 2 Inhibition rate of different dilution times of B. amyloliquefaciens fermentation supernatant to F. oxysporium f. sp. vasinfectum

2.3 不同稀釋倍數的脂肽粗提物對棉花枯萎病菌的抑制活性

由表3、圖3可知,脂肽粗提物的濃度從673.96 μg/mL增至8 120.00 μg/mL,在27 ℃恒溫恒濕培養箱中培養96 h對棉花枯萎病菌的抑制率從19.90%增至77.30%(表3),分析得出脂肽粗提物對棉花枯萎病菌的EC50為2 720.20 μg/mL(R2=0.98)。

圖3 不同稀釋倍數的脂肽粗提物對棉花枯萎病菌的抑制效果Fig.3 Inhibitory effect of crude lipopeptide extracts with different dilution times on F. oxysporium f. sp. vasinfectum

表3 不同稀釋倍數的脂肽粗提物對棉花枯萎病菌的抑制率Table 3 Inhibition rate of different dilution times ofcrude lipopeptide extract to F. oxysporium f. sp. vasinfectum

2.4 8種化學殺菌劑對棉花枯萎病菌的抑制活性

由表4可知,棉花枯萎病病菌對戊唑醇的敏感性最高,EC50為0.34 μg/mL,其次為多菌靈,其對病菌的EC50為0.49 μg/mL。苯醚甲環唑和腈菌唑對棉花枯萎病菌的EC50分別為1.34 μg/mL和1.07 μg/mL,丙環唑對病菌的EC50為1.54 μg/mL。甲基硫菌靈對病菌的EC50為7.87 μg/mL,萎銹靈對病菌的EC50為10.65 μg/mL。丙森鋅對病菌的抑制活性最差,其EC50為63.25 μg/mL。

3 結論與討論

棉花枯萎病是棉花生產中的重要土傳病害,一旦發病難以防治,對于棉花生產造成了重大威脅[14]。陳淑珍等[15]在棉花現蕾前連續使用10%惡霉靈納米乳1 500倍液灌根20 d之后對棉花枯萎病菌的防治效果為97.22%。劉春英[16]發現多菌靈對棉花尖孢鐮刀菌的EC50是0.06 mg/L;韓新才等[17]采用生長速率法測定了多菌靈對棉花枯萎病菌的抑制活性,EC50達10.30 μg/mL。本研究通過菌絲生長速率法比較了8種化學殺菌劑對棉花枯萎病的抑制活性得出戊唑醇對棉花枯萎病的抑制活性優異,其EC50為0.34 μg/mL;其次多菌靈EC50為0.49 μg/mL,可以看出棉花枯萎病菌對同一種藥劑的毒力水平存在較大差異,這與不同來源的菌株有關,所以不同地區的棉花枯萎病的防控推薦用藥應根據當地病菌的藥敏性作具體分析隨著農藥使用量零增長以及植病生防的推廣,生防菌的使用能夠明顯減少化學藥劑的用量,用于棉花枯萎病的生防菌報道有短小芽孢桿菌[18]、蠟狀芽孢桿菌YUPP-10[19]、壯觀鏈霉菌SC11[6]等。李玉洋等[20]采用平板稀釋法分離獲得一株對棉花枯萎病抑制活性為65.19%的菌株SN06;丁建朋等[21]通過田間試驗發現解淀粉芽孢桿菌HFW217對棉花枯萎病的防效達80.97%。張一白等[22]通過田間試驗得出奧瑞根(地衣芽孢桿菌制成)可濕性粉劑對棉花枯萎病的防治效果為28.4%～51.5%。余利等[23]將解淀粉芽孢桿菌脂肽粗提物分別與克菌丹質量比1∶100、代森錳鋅5∶100時,增效系數SR達1.78和1.74。本試驗通過菌絲生長速率法檢測解淀粉芽孢桿菌SJ06發酵上清液的10倍稀釋液對棉花枯萎病菌的抑制率達80.2%,而脂肽粗提物100倍稀釋液對病菌的抑制率達到77.30%,在棉花枯萎病的生物防控方面具有潛在的利用價值。本研究初步探索了生防菌發酵上清液、脂肽粗提物和8種化學殺菌劑對棉花枯萎病菌的抑制效果,為進一步探究化學殺菌劑和生防菌劑的復配及其抑制機理提供了基礎數據。