植物激素對鋁脅迫下番茄根生長的影響

蔡家輝, 王乾坤, 吳 越, 劉華彬, 祝嫦巍*

(1.安徽科技學院 農學院,安徽 鳳陽 233100;2.安徽科技學院 生命與健康科學學院,安徽 鳳陽 233100)

鋁(Al)是地殼中含量最多的金屬元素,在土壤環境中常以無毒的硅酸鹽、氧化物的形式存在。在酸性(pH<5.0)土壤中,含鋁的硅酸鹽、氧化物釋放出三價鋁離子(Al3+),抑制植物的根系生長發育,減少植物對營養物質的吸收,成為抑制植物生長、限制作物產量的重要因素[1-2]。植物的根尖組織是鋁毒害的主要靶位點,根尖轉換區(分生區和伸長區之間)是植物對鋁毒脅迫最敏感的部位,Al3+主要通過抑制這一組織部位細胞的分裂和伸長來抑制根的生長[3]。在受到鋁脅迫時,植物在長期進化和適應環境的過程中形成了內部耐受和外部排斥機制。內部耐受主要是通過液泡的區隔化和有機酸螯合以減弱鋁離子對植物細胞的毒害作用;外部排斥則主要通過植物的根系分泌有機酸以螯合根際的鋁離子,減少鋁離子進入細胞,降低鋁對植物的毒害作用[4-5]。

激素作為重要的植物生長調節物質,在植物的生長發育和逆境脅迫響應過程中發揮重要的調控作用。研究發現,水楊酸、茉莉酸、乙烯、細胞分裂素和生長素均參與植物的鋁脅迫響應過程。水楊酸(Salicylic Acid,SA)作為內源性信號響應分子,參與植物的逆境脅迫響應過程。對大豆(Glycinemax)外源施加水楊酸可以降低植物根系對鋁的吸收,促進根系分泌更多的檸檬酸鹽,從而緩解鋁的毒害作用,恢復根系生長[6]。50 μmol/L水楊酸可以提高葡萄(Vitisvinifera)根系活力[7]。鋁脅迫誘導茉莉酸合成相關基因表達上調,植物體內茉莉酸含量升高。外源施加茉莉酸甲酯(Methyl Jasmonate,MeJA)會加重鋁脅迫導致的根生長抑制[8]。此外,鋁脅迫還會導致根尖過渡區細胞分裂素信號響應增強,外源施加細胞分裂素(6-Benzylamino purine,6-BA)會增強鋁脅迫導致的根生長抑制。研究表明,鋁脅迫誘導的根尖細胞分裂素信號響應受到生長素的調控[9]。因此,生長素不僅直接參與調控植物鋁脅迫響應過程,還可以通過下游的細胞分裂素信號途徑進一步影響植物根的生長。

生長素(Auxin)是植物響應鋁脅迫過程中的關鍵信號調控分子。鋁脅迫誘導生長素在根尖分生區和轉換區的合成增加,過度積累的生長素進而抑制根的伸長生長[10]。但是,生長素在不同的植物種類中有著不同的調控機制。在擬南芥的生長中,鋁脅迫通過影響生長素在根尖的極性運輸和本地合成,導致生長素在根尖分生區和轉換區細胞的過量積累,高濃度的生長素進而抑制主根的伸長生長[11]。但是在玉米(Zeamays)的生長中,鋁處理會使根尖生長素含量降低,抑制玉米根系生長,但外源施加NAA可緩解鋁脅迫導致的玉米根生長抑制[12]。鋁脅迫下生長素在擬南芥和玉米根系生長中起到截然不同的作用,這可能是由于生長素在雙子葉植物和單子葉植物響應鋁毒脅迫過程中發揮著不同的調節機制。

本試驗以番茄(Solanumlycopersicum)為研究材料,探究不同植物激素和植物生長調節劑對鋁脅迫下番茄根生長的影響,利用生長素報告基因DR5:GUS探究番茄根部生長素對鋁脅迫的響應機制,同時通過活性氧和細胞死亡檢測研究根部細胞與鋁脅迫之間的相互作用,為在酸性土壤環境下番茄耐鋁種植提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試材料為栽培品種矮生番茄,由甘肅甘益農種業有限公司生產;本試驗所用Micro-Tom背景的DR5:GUS轉基因番茄是由DR5:GUS轉基因番茄(VF36背景,由齊明芳教授提供)通過與Micro-Tom回交4次獲得[13]。

1.2 試驗方法

1.2.1 植物培養 番茄種子使用1%NaClO溶液消毒10 min,無菌水沖洗5遍,播種在1/2MS培養基上避光萌發。萌發后選取生長一致、根長為(35±5) mm的番茄幼苗轉移至1/5Hogland營養液中,放置在人工氣候培養箱內培養,光照16 h/24 ℃,黑暗8 h/20 ℃,相對濕度為70%,光照強度為10 000 lx。

1.2.2 AlCl3處理 每組處理挑取10株生長一致的番茄幼苗,在0.5 mmol/L CaCl2溶液中預處理12 h,轉移到含不同濃度AlCl3(0、25、50、75、100 μmol/L)的1/5Hogland營養液中培養,每2天更換1次營養液,并保證每次所換溶液pH為5.0。第6天使用掃描儀掃描拍照,用Image J軟件測定根長。

1.2.3 激素處理 每組處理挑取10株生長一致的番茄幼苗,在0.5 mmol/L CaCl2溶液中預處理12 h,轉移到含有50 μmol/L AlCl3和不同植物生長調節劑(6-BA、BL、SA、MeJA、NAA、yucasin、NPA或TIBA)的1/5Hogland營養液中培養,營養液每2天更換1次,并保證每次所換溶液pH為5.0。培養至第6天時使用掃描儀掃描拍照,用Image J軟件測定根長。

1.2.4 GUS染色 量取5 mL無菌水和5 mL磷酸鹽緩沖液(pH=7.0),加入100 μL X-Gluc、50 μL鐵鹽及10 μL Triton X-100,混勻,避光儲存,獲得GUS染液。將鋁脅迫處理3 h后的番茄幼苗放入GUS染液中,37 ℃避光染色12 h,使用透明劑(水合氯醛∶無菌水∶甘油=8∶3∶1,V∶V∶V)透明,高級正置熒光顯微鏡拍照。

1.2.5 蘇木精染色 稱取0.5 g蘇木精、0.05 g KI,溶于100 mL蒸餾水,配制蘇木精染液。將番茄幼苗在含0.5 mmol/L CaCl2溶液中預處理12 h,轉移到1/5Hogland營養液中,設置對照組(CK),處理組分別設置25 μmol/L AlCl3(Al)、25 μmol/L AlCl3+50 nmol/L NAA (Al+NAA)、25 μmol/L AlCl3+4 μmol/L NPA(Al+NPA)、25 μmol/L AlCl3+4 μmol/L TIBA (Al+TIBA)、25 μmol/L AlCl3+10 μmol/L yucasin(Al+yucasin),處理30 min,處理后的番茄幼苗經過無菌水沖洗干凈,放入蘇木精染液中染色5 min,蒸餾水中沖洗5遍后使用顯微鏡觀察拍照。

1.2.6 活性氧檢測 配制1 mg/mL DAB染液。取生長一致的番茄幼苗經過50 μmol/L AlCl3、50 μmol/L AlCl3+10 μmol/L yucasin共同處理2 h,無菌水沖洗干凈,放入DAB染液中避光染色10 min,使用透明劑進行透明,高級正置熒光顯微鏡拍照。

1.2.7 細胞凋亡檢測 稱取10 g苯酚,分別量取甘油、乳酸、無菌水各10 mL,混勻,稱取10 mg臺盼藍溶于混勻液配制成臺盼藍染色液。選取生長一致的番茄幼苗經過50 μmol/L AlCl3、50 μmol/L AlCl3+10 μmol/L yucasin共同處理12 h,臺盼藍染色5 min,使用透明劑進行透明,顯微鏡拍照觀察。

1.3 數據分析

所有處理均進行至少3次獨立生物學重復試驗,使用GraphPad Prism 9.0進行數據處理和作圖(平均值±標準差),使用SPSS 22.0軟件進行單因素方差分析,使用Adobe Illustrator CC 2017進行組圖,采用Duncan檢驗法進行各處理間顯著性差異分析(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 鋁脅迫抑制番茄根的生長

為探究鋁脅迫對番茄幼苗根生長的影響,外源施加不同濃度的AlCl3進行處理,分析番茄幼苗根長。番茄幼苗在不同鋁脅迫處理下培養6 d(圖1A),結果顯示,低濃度的鋁脅迫(10、25 μmol/L AlCl3)處理對番茄根的生長沒有明顯抑制作用,當濃度達到50 μmol/L時,番茄幼苗主根生長明顯受到抑制,且隨著鋁濃度的增加,鋁誘導的根生長抑制越嚴重(圖1B)。

圖1 不同濃度AlCl3對番茄根生長的影響Fig.1 Effects of different concentrations of AlCl3 on tomato root growth注:比例尺=10 mm;不同字母代表具有顯著性差異(P<0.05)。下同。

2.2 不同激素對鋁脅迫下番茄根生長的影響

為探究不同激素對鋁脅迫下番茄根生長的影響,外源施加細胞分裂素(6-BA)、油菜素內酯(BL)、水楊酸(SA)、茉莉酸甲酯(MeJA)分別與50 μmol/L AlCl3共同處理番茄幼苗,分析不同的植物激素在番茄鋁脅迫過程中的作用。結果表明,低濃度(0.5、1、2 nmol/L)的6-BA處理對鋁脅迫下根的生長沒有明顯影響,較高濃度(5 nmol/L)的6-BA加重鋁脅迫誘導的根生長抑制(圖2A、B)。盡管較低濃度(0.1 nmol/L)的BL對鋁脅迫誘導的根生長抑制有所緩解,但是外源施加BL并不能顯著緩解鋁脅迫對番茄的抑制作用(圖2C、D)。低濃度(5、10 μmol/L)的外源SA對鋁脅迫下根的生長沒有明顯影響,較高濃度(20、40 μmol/L)的SA加重鋁脅迫誘導的根生長抑制(圖2E、F)。低濃度的外源MeJA不影響番茄根對鋁脅迫的敏感性,隨著MeJA濃度的增加,番茄響應鋁脅迫的敏感性增強,鋁誘導的根生長抑制出現加重的現象(圖2G、H)。

2.3 生長素在番茄鋁脅迫響應過程中的作用

為探究生長素在番茄鋁脅迫過程中的作用機制,通過外源施加生長素類似物(NAA)、生長素合成抑制劑(yucasin)、生長素運輸抑制劑(NPA、TIBA),分析其對鋁脅迫下番茄根生長的影響。試驗發現,當外源施加NAA時,鋁脅迫誘導的番茄根生長受到明顯影響,隨著外源NAA濃度的增加而加重(圖3A、B)。當外源施加生長素合成抑制劑yucasin時,鋁脅迫誘導的根生長抑制現象得到明顯緩解,且較低濃度即可有效減弱鋁脅迫對番茄根的毒害作用(圖3C、D)。當外源施加生長素運輸抑制劑NPA或TIBA時,鋁脅迫誘導的根生長抑制現象也明顯隨著外源抑制劑濃度的增加而加重(圖3E～H)。

圖3 生長素對鋁脅迫下番茄根生長的影響Fig.3 Effects of auxin on tomato root length under aluminum stress

2.4 鋁誘導根尖生長素含量的增加

為進一步探究生長素合成途徑如何參與番茄鋁脅迫響應過程,試驗利用生長素報告基因DR5:GUS分析鋁脅迫對番茄根尖生長素響應的影響。結果顯示,鋁(25 μmol/L AlCl3)處理誘導生長素在番茄根尖分生區、轉換區和側根冠積累,外源施加yucasin處理明顯減少鋁脅迫誘導的生長素在根尖的積累(圖4)。結果表明,鋁脅迫通過誘導根尖生長素的積累抑制根的伸長生長,而外源yucasin可以通過減少生長素的積累緩解鋁脅迫導致的生長抑制。

圖4 外源yucasin對鋁脅迫下番茄根尖生長素響應的影響Fig.4 Effects of exogenous yucasin on auxin response to aluminum stress in tomato root tips注:比例尺=200 μm。

2.5 外源yucasin減少鋁在根部的積累

為分析yucasin在番茄鋁脅迫下的作用,試驗進一步檢測了鋁離子在根部的積累情況。結果發現,與CK相比,25 μmol/L AlCl3處理后番茄根尖組織染色較深,表明有大量的鋁離子積累(圖5)。外源施加50 nmol/L NAA、4 μmol/L NPA 和4 μmol/L TIBA分別與25 μmol/L AlCl3共同處理后,染色加深,表明根尖組織積累更多的鋁離子(圖5)。外源施加10 μmol/L yucasin與25 μmol/L AlCl3共同處理后,染色明顯減弱,表明鋁離子在根尖組織的積累減少(圖5)。結果表明,外源生長素或生長素運輸抑制劑均可增加鋁離子在根尖的積累,從而加重鋁脅迫對根的毒害作用;而生長素合成抑制劑可以減少鋁離子在根尖的積累,從而緩解鋁脅迫對根的毒害。

圖5 外源生長素及相關抑制劑對番茄根尖鋁離子積累的影響Fig.5 Effects of exogenous auxin and related inhibitors on Al accumulation in tomato root tips注:比例尺=100 μm。

2.6 鋁脅迫對番茄根部活性氧和細胞死亡的影響

活性氧(ROS)的產生是植物響應逆境脅迫的重要信號分子,為分析生長素合成途徑對鋁脅迫下ROS產生的影響,通過外源施加yucasin檢測鋁脅迫下ROS的積累情況。結果表明,與CK相比,50 μmol/L AlCl3處理導致ROS在番茄根尖分生區和轉換區積累,特別是轉換區組織細胞中有大量的ROS積累,這也表明轉換區是根對鋁脅迫更為敏感的區域(圖6A)。外源施加yucasin可以明顯減少ROS在根尖的積累,減弱鋁脅迫對根尖組織的傷害(圖6A)。通過臺盼藍染色觀察發現,鋁脅迫處理導致根尖組織細胞染色明顯加深,yucasin可以減弱根尖的染色,表明yucasin可以緩解鋁脅迫導致的根尖組織細胞的死亡(圖6B)。

圖6 外源yucasin對鋁脅迫下番茄根尖細胞活性氧產生(A)和細胞死亡(B)的影響Fig.6 Effect of exogenous yucasin on reactive oxygen species production (A) and cell death (B) in tomato root tip cells under aluminum stress注:比例尺=200 μm。

3 結論與討論

植物激素在植物的生長發育和鋁脅迫響應過程中起到重要調控作用[14]。研究發現,細胞分裂素響應基因ARR3和ARR4受到鋁脅迫的誘導,鋁處理會誘導細胞分裂素在根尖組織過多積累[9]。本研究發現外源施加細胞分裂素(6-BA)會進一步加重鋁脅迫導致的番茄根生長抑制(圖2A)。外源施加油菜素內酯(BL)會加重鋁脅迫誘導的根生長抑制,而油菜素內酯合成抑制劑(PPZ)則可以緩解鋁脅迫導致的根生長抑制[15-16]。本試驗中,發現低濃度的BL對鋁脅迫導致的根生長抑制有所緩解,而隨著BL濃度的增加,鋁脅迫導致的根生長抑制并沒有得到緩解,且側根數明顯減少(圖2C),這表明低濃度的外源BL可以提高番茄的耐鋁能力,而高濃度的BL會加重鋁脅迫對植物的傷害。水楊酸是植物響應逆境脅迫的關鍵信號分子[17]。水楊酸過量積累的擬南芥突變體snc1表現出對鋁脅迫的高敏感性,而水楊酸積累減少的擬南芥轉基因植株NahG則對鋁脅迫有一定的耐受性[18]。當外源施加水楊酸時,鋁脅迫誘導的根生長抑制更加嚴重(圖2E),表明SA在植物的鋁脅迫過程中發揮負調控作用。盡管如此,在對大豆幼苗外源施加水楊酸則緩解了鋁對植株的毒害作用,降低了大豆根尖的鋁含量,提高了大豆的鋁毒抗性[6]。因此,可以推測這可能是由于在不同植物中水楊酸參與植物鋁脅迫的調控機制存在差異導致的。茉莉酸是植物應對生物及非生物脅迫的重要調節因子[19]。COI1是茉莉酸信號途徑中的關鍵受體,與野生型擬南芥相比,coi1-2功能缺失突變體對鋁脅迫的敏感性降低,外源施加茉莉酸甲酯則加重鋁脅迫導致的根生長抑制[8]。與此一致的是,外源施加茉莉酸甲酯同樣增加番茄對鋁脅迫的敏感性,加重鋁脅迫導致的根生長抑制(圖2G),表明茉莉酸在植物的鋁脅迫響應過程中發揮負調控作用。

研究表明生長素參與調控植物鋁脅迫響應過程,生長素在不同的植物中發揮不一樣的調控功能[11-12]。鋁脅迫處理導致玉米根尖生長素的積累減少,根的伸長生長受到抑制,外源施加NAA后根的生長得到顯著緩解[12]。然而,外源施加NAA會加重鋁脅迫下擬南芥根的抑制,生長素積累過量的相關突變體yucca、sur2和sur1-3在鋁處理后也出現了嚴重的根生長抑制[20]。與此一致的是,本研究也發現外源施加NAA會加重鋁脅迫對番茄主根的生長抑制(圖3A)。當施加生長素合成抑制劑(yucasin)處理時,鋁脅迫誘導產生的根生長抑制得到顯著緩解(圖3C)。進一步研究表明yucasin處理減少了鋁脅迫誘導的生長素在根尖的積累(圖4),這與對擬南芥的研究結果一致[15]。生長素運輸抑制劑NPA和TIBA處理均會加重鋁誘導的番茄根生長抑制(圖3E、G)。而對玉米的研究則表明生長素極性運輸途徑相關突變體zmpgp1表現出對鋁毒脅迫的不敏感[12]。通過蘇木精染色,表明鋁誘導的根伸長生長與鋁離子在植物根尖的積累有關。在玉米中,zmpgp1突變體或NAA處理后的根尖鋁離子積累明顯減少[21]。在番茄中,外源施加NPA、TIBA或NAA處理均會導致鋁離子在根尖的積累增加而加重鋁脅迫對植物的傷害,外源施加yucasin可以降低鋁離子在根尖的積累而減輕鋁脅迫傷害(圖5)。以上結果也表明,在不同的植物種類中,生長素的調控機制也不盡相同。然而,其中深入的分子機制還需要進一步的研究。

ROS是植物響應逆境脅迫的重要信號分子,植物體內ROS的產生及清除處于動態平衡狀態。在植物受到鋁脅迫時,ROS的產生和積累增加,從而引發細胞程序性死亡等級聯反應[22]。本研究中,鋁脅迫導致番茄根尖ROS積累增加,細胞死亡增多,外源施加yucasin可以明顯減少ROS的積累和細胞死亡,緩解鋁脅迫對植物根尖造成的傷害(圖6)。本研究通過生長素合成途徑探究植物響應鋁脅迫的調控機制,從鋁離子的積累、ROS的產生和細胞死亡等方面解析生長素參與調控植物鋁脅迫的途徑,以期為提高番茄的耐鋁能力提供理論依據。