富馬酸二甲酯通過Nrf2/HO-1信號通路緩解細顆粒物對雌性大鼠胎盤的氧化損傷

李江珂, 董恩恒, 張豐泉, 張俊強, 伍 源

(新鄉醫學院公共衛生學院新鄉市大氣污染健康效應與干預重點實驗室,河南 新鄉 453003)

細顆粒物(fine particulate matter,PM2.5)是指空氣動力學直徑不超過2.5 μm的微小顆粒物[1]。與較大的顆粒物相比,PM2.5粒徑小,活性強,容易富集各種微生物和有害化學物質,這些特性能使PM2.5經呼吸道透過肺泡并進入血液,對人體健康產生不良影響[2]。有研究報道,孕前和妊娠早期PM2.5暴露被認為是胎兒生長的敏感時期[3]。此外,母體暴露在空氣污染物中也逐漸成為不良妊娠結局的一個關鍵因素[4]。近年來,已有大量的流行病學調查證實,孕產婦暴露于PM2.5可能導致妊娠并發癥和不良妊娠結局的風險增加,包括先兆子癇(preeclampsia,PE)[5,6]和低出生體重(low birth weight,LBW)[7]等。

顆粒物暴露可以引起機體內活性氧(reactive oxygen species,ROS)等自由基的增加,同時抑制生物體內抗氧化劑的產生,從而誘發氧化應激反應。氧化和抗氧化之間的平衡在維持生物體內環境穩態方面有著至關重要的作用。由于機體對脂質過氧化的易感性,機體在面對外來物質入侵時已經形成了一套有效的抗氧化系統,包括總抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)、超氧化物歧化酶(super oxide dismutase,SOD)在內的其它抗氧化劑。這些抗氧化物質會以不同的方式阻止自由基對生物分子的有害攻擊,維持組織細胞功能的完整性[8]。富馬酸二甲酯(dimethyl fumarate,DMF)是一種非阿片類的口服藥物,常用于治療神經性炎癥和線粒體功能障礙[9]。DMF目前已廣泛用于治療多發性硬化癥等相關疾病[10],且在神經炎癥和毒性氧化應激的臨床前模型中表現出良好的效果[11]。研究表明,DMF能夠激活核因子E2相關因子(NF-E2 related factor 2,Nrf2)信號通路[12],這是一個重要的機體防御系統。Nrf2是編碼許多抗氧化基因和解毒酶的主要調節者,可調節機體細胞的氧化應激反應[13]。當機體受到外源性物質脅迫時,Nrf2會遷移到細胞核,與抗氧化反應原件(antioxidant response element,ARE)啟動子區域結合,來調控血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)、SOD等下游基因的表達,以對抗ROS,從而保護正常細胞免受細胞毒效應的影響[14]。在氧化應激調節中,Nrf2發揮著重要的作用。盡管目前有很多關于生殖方面的研究,但大多集中在流行病學和妊娠結局方面。胎盤作為胚胎發育過程中的關鍵器官,對其進行研究可以揭示出PM2.5對胎鼠健康的潛在風險,這有助于更深入地了解PM2.5對大鼠生殖系統的影響。因此,本文研究選用不同劑量的PM2.5,探究孕前PM2.5暴露對大鼠胎盤損傷及可能的機制,并評估DMF對孕前PM2.5暴露生殖損傷的抑制效果,從而對PM2.5誘導的生殖毒性的預防與干預提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

40只6周齡的SPF級雌性SD大鼠,體重為160～200 g,14只6周齡的SPF級雄性SD大鼠,體重為240 g～340 g,均購于北京維通利華實驗動物技術有限公司[動物生產許可證號:SCXK(京)2021-0011;動物使用許可證號:SYXK(京)2022-0052]。所有實驗大鼠都在室內溫度22～24 ℃,標準飲水、進食及明暗交替的SPF級屏障環境中飼養。本研究已獲得新鄉醫學院倫理委員會批準(XYLL-20210521)。

1.2 主要試劑與儀器

DMF購于美國MCE生物科技公司(HY-17363);SOD、丙二醛(malondialehyde,MDA)試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司(BC0175,BC0025);BCA蛋白濃度測定試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司(PC0020);T-AOC試劑盒購于武漢伊萊瑞特生物科技公司(E-BC-K136-M);白細胞介素-6(interleukin 6,IL-6)和白細胞介素-10(interleukin,IL-10)試劑盒購于武漢伊萊瑞特生物科技公司(E-EL-R0015c,E-EL-R0016c);Nrf2、HO-1、β-肌動蛋白(β-actin)抗體購于江蘇親科生物有限公司(AF0639,AF5393,AF7018)。大流量粉塵采樣器(Tisch Environmental美國);真空冷凍干燥機(2-4LD Plus,德國Marin Christ公司);電感耦合等離子體質譜儀(ICP-MS,美國Thermo公司);酶標儀(Enspire,美國PerkinElmer公司);凝膠成像系統(Fluor Chem R,美國Protein Simple)。

1.3 PM2.5的檢測

使用聚四氟乙烯濾膜采集2022年4月17日至2022年9月17日新鄉市的PM2.5樣本。本文通過ICP-MS對染毒所用的PM2.5進行了金屬成分分析。取1 mg的PM2.5粉末,加入3 mL HNO3和2 mL H2O2進行混勻。使用微波消解儀充分消解。消解完成進行趕酸,用超純水稀釋趕酸液,采用ICP-MS分析PM2.5中的各金屬元素含量。

1.4 動物分組及染毒方法

采用隨機數字法將實驗動物分為對照組(生理鹽水,Cont)、低劑量PM2.5組(1.5 mg/kg bw PM2.5,L-Exp)、高劑量PM2.5組(7.5 mg/kg bw PM2.5, H-Exp)、DMF對照組(生理鹽水+50 mg/kg bw DMF,DMF Cont)和DMF干預組(7.5 mg/kg bw PM2.5+50 mg/kg bw DMF,H-Exp+DMF)。將收集的PM2.5用生理鹽水配置成不同濃度的混懸液,采用吸入式氣管滴注法進行大鼠PM2.5染毒。具體實驗操作方法可見課題組前期研究內容[15]。30 min時,對照組、低劑量PM2.5組和高劑量PM2.5組大鼠灌胃生理鹽水,DMF對照組與DMF干預組大鼠灌胃DMF。染毒結束時,將大鼠放回鼠籠,自由飲水和進食,每2 d染毒1次,共持續染毒40 d。之后,將雄雌大鼠按照1∶2的比例進行合籠。當妊娠第19 d時,將雌鼠麻醉并解剖,通過心血管采血法收集血液,同時立即收集胎盤組織樣本。

1.5 胎盤病理組織觀察

將取出的新鮮胎盤組織用PBS充分漂洗,固定樣本,包埋后制作(5～6 μm)的石蠟切片,H&E染色,觀察大鼠胎盤組織病理學變化。

1.6 胎盤組織超氧化物歧化酶、丙二醛、總抗氧化能力含量測定

取0.1 g新鮮胎盤組織,按1∶5～10的比例加入提取液,冰上剪碎組織,用高速低溫組織研磨儀制備組織勻漿液,8 000×g/4 ℃離心10 min,取組織上清液,置冰上待測。嚴格按照試劑盒說明,采用微量法檢測SOD活性及MDA含量,分別在560 nm、532 nm及600 nm波長處用酶標儀測量吸光度。取0.1 g新鮮胎盤組織,按1∶5比例加入(0.5 mL)PBS,勻漿離心后,取組織上清液待測。采用比色法試劑盒檢測T-AOC含量,于520 nm波長處測量測定孔和對照孔的吸光度。

1.7 胎盤組織IL-6、IL-10含量測定

取0.1 g新鮮胎盤組織,按1∶5的比例加入PBS,冰上剪碎組織,將胎盤組織用高速低溫組織研磨儀制備成組織勻漿液。8 000×g/4 ℃離心15 min,取組織上清液,置冰上待測。嚴格按照試劑盒的說明,采用雙抗體夾心法檢測IL-6和IL-10的含量,酶標儀于450 nm波長處檢測酶標板中的標準品孔和樣品孔吸光度,在雙對數坐標軸上分別繪制出IL-6和IL-10的四參數邏輯函數的標準曲線并計算樣品中IL-6和IL-10的濃度。

1.8 胎盤組織核因子E2相關因子、血紅素加氧酶-1的蛋白質水平測定

取40 mg新鮮胎盤組織,按1∶10的比例加入400 μL RIPA裂解液和4.0 μL的PMSF,冰上剪碎組織,將胎盤組織用高速低溫組織研磨儀制備成組織勻漿液,70Hz研磨3～5 min,置冰上30 min,12 000 r/min,4 ℃離心15 min,取組織上清液,分裝保存,用BCA法定量總蛋白質濃度。制備濃度為8%的分離膠和5%的濃縮膠進行SDS-PAGE凝膠電泳,按照30 μg蛋白質樣品準確上樣,轉膜,封閉,加入一抗Nrf2(1∶2 000)、HO-1(1∶1 000)、β-肌動蛋白(1∶3 000),80 r/min室溫搖2 h。洗膜后加入二抗(1∶4 000),80 r/min室溫搖1 h。洗膜后,ECL發光,多功能成像系統成像,用ImageJ軟件進行灰度比值分析。以β-肌動蛋白為內參蛋白質,比較Nrf2、HO-1蛋白質的相對表達水平。

1.9 統計學分析

2 結果

2.1 新鄉地區細顆粒物中鋁、鎂、鈣、鐵、鋅5種元素質量濃度最高

PM2.5對機體健康的影響受到多種因素作用,與其組分濃度密不可分。ICP-MS結果顯示:新鄉地區夏秋季PM2.5中的鋁(aluminum,Al)、鎂(magnesium, Mg)、鈣(calcium, Ca)、鐵(iron,Fe)、鋅(zinc, Zn)等這5種元素的質量濃度最高,分別為32.94834、14.59629、7.415467、3.89415、3.52989 μg/mg (Table 1)。

Table 1 Analysis of the metal composition in PM2.5

2.2 富馬酸二甲酯對大鼠的胚胎發育具有保護作用

研究結果與對照組相比,高劑量PM2.5組的胎鼠數量降低,差異具有統計學意義(P<0.05);與高劑量PM2.5組相比,DMF干預組的胎鼠數量明顯增多,是高劑量PM2.5組的1.16倍(P<0.05)。胚胎體長是很多研究常用的指標,可作為胚胎發育狀況的參考指標。與對照組相比,低劑量PM2.5組(P<0.05)和高劑量PM2.5組(P<0.01)的胎鼠平均體長都有不同程度的降低;與高劑量PM2.5組相比,DMF干預組的胎鼠平均體長明顯增高,為高劑量PM2.5組的1.10倍(P<0.001)。上述結果表明,PM2.5可以通過胎盤屏障導致胚胎毒性的發生,DMF能抑制由PM2.5帶來的胚胎毒性,對胚胎發育具有保護作用(Fig.1)。

Fig.1 The effect of PM2.5 exposure in different doses and DMF intervention in fetal rats (A) Analysis of the number of fetal rats among different groups. (B) ImageJ software analysis of the average body length of fetal rats among groups. Data were presented as mean ± SD (n = 8).**P<0.01,*P<0.05 vs Control group; ###P<0.001,#P<0.05 vs H-Exp group

2.3 富馬酸二甲酯減輕PM2.5暴露對胎盤組織的病理損傷

由病理結果顯示,與對照組相比,低劑量PM2.5組和高劑量PM2.5組胎盤的迷路區血細胞有不同程度的減少,給予DMF干預后,與高劑量PM2.5組相比,DMF干預組胎盤迷路區的血細胞增多。且與對照組和DMF干預組相比,高劑量PM2.5組的血管脈徑不清晰,結果表明,PM2.5暴露可導致胎盤組織結構發生病理改變,而DMF可以改善因PM2.5暴露導致的胎盤病理損傷(Fig.2)。

Fig.2 Effects of PM2.5 exposure and DMF intervention on placental pathology Pathological changes in placental tissues were detected using the H&E staining method. (A) The impact on blood cells is indicated by the black arrow, which indicated blood cells. (B) The impact on the vascular vein. The blue arrow indicates the vascular vein. Scale bar, 20 μm or 40 μm as described in figures

2.4 富馬酸二甲酯減輕PM2.5暴露誘導的胎盤氧化應激反應

由氧化應激結果表明,與對照組相比,高劑量PM2.5組的MDA含量顯著增高(16.5 ± 2.85,P<0.05)。與對照組相比,高劑量PM2.5組SOD活性(41.34±8.36)和T-AOC含量(0.75 ± 0.17)明顯降低(P<0.05),經DMF處理后,DMF干預組的T-AOC顯著高于高劑量PM2.5組(1.32 ± 0.38,P<0.01)。結果表明,PM2.5暴露可以導致機體抗氧化能力降低,通過DMF進行干預能有效的提高機體的抗氧化能力(Fig.3)。

Fig.3 Indicators related to placental oxidative stress (A) SOD activity in placental tissues was detected by the microassay. (B) The content of MDA in placental tissues was detected by the micromethod. (C) T-AOC was detected by colorimetry. Data were presented as mean ± SD (n = 6).**P<0.01,*P<0.05 vs Control group;##P<0.01,#P<0.05 vs H-Exp group

2.5 PM2.5暴露能導致機體抗炎水平降低

由炎癥因子檢測的結果顯示,PM2.5暴露后,與對照組相比,不同劑量組的IL-6含量隨著PM2.5濃度的增加而增加,呈現劑量效應的趨勢,但差異無統計學意義(P>0.05)。與對照組相比,低劑量PM2.5組IL-10含量(2 714.74 ± 501.28)、高劑量PM2.5組的IL-10含量(2 657.66 ± 279.64)都明顯降低,差異具有統計學意義(P<0.05)。與高劑量PM2.5組相比,DMF干預組的IL-10水平增高,但差異無統計學意義(P>0.05)。這表明PM2.5暴露能導致機體抗炎能力下降,但DMF的干預在提高機體的抗炎能力方面并未表現出顯著的效果(Fig.4)。

2.6 富馬酸二甲酯增高Nrf2/HO-1信號通路的胎盤蛋白質表達水平

為了研究Nrf2/HO-1信號通路在PM2.5誘導的胎盤氧化應激中的作用,本文用Western印跡法檢測了Nrf2和HO-1蛋白質的表達量。結果顯示,低劑量PM2.5組Nrf2(0.99 ± 0.17)和高劑量PM2.5組Nrf2(0.86 ± 0.11)、低劑量PM2.5組HO-1(0.95 ± 0.16)和高劑量PM2.5組HO-1(0.85 ± 0.06)的蛋白質水平都明顯低于對照組(P<0.01);與高劑量PM2.5組相比,DMF干預組的Nrf2(1.06 ± 0.10)、HO-1(1.04 ± 0.17)蛋白質的表達量都明顯增高(P<0.05),差異具有統計學意義。結果表明,PM2.5暴露能使Nrf2、HO-1蛋白質的含量降低,而DMF干預組的Nrf2、HO-1蛋白質的含量增高,提示DMF可能通過Nrf2/HO-1信號通路提高機體抗氧化酶的蛋白質水平(Fig.5)。

Fig.5 Indicators related to placental protein expression The expression levels of Nrf2 and HO-1 in placental tissues were detected by Western blotting. Data were presented as the mean ± SD of three independent experiments (n=6).**P<0.01,*P<0.05 vs Control group;##P<0.01,#P<0.05 vs H-Exp group

3 討論

空氣污染是一個重大的全球公共衛生問題,由環境污染物引起的健康問題不容小覷。目前越來越多的數據表明,孕期接觸環境空氣污染與早產、LBW等一系列不良妊娠結局密切相關[16,17]。一項新的研究[18]甚至發現,孕婦產前PM2.5暴露每增加1 μg/m3,胎兒死亡的風險顯著增加8%。盡管與空氣污染有關的不良妊娠結局的機制尚未完全闡明,但有研究提示胎盤是受空氣污染直接影響的主要器官[19]。一項針對健康孕婦的研究發現,產前PM2.5暴露與胎盤整體DNA甲基化呈正相關[20]。此外,血液中的環境污染物也可能直接穿過胎盤屏障,引發缺氧或免疫介導的損傷,最終導致胎兒死亡[21]。在一項對PM2.5金屬成分和死產風險之間關系的評估中,研究觀察到鋅的含量與死產密切相關[22]。隨后,本文采用ICP-MS分析新鄉地區PM2.5的金屬成分,發現PM2.5中不同金屬元素質量濃度差異較大,其Al、Mg、Ca、Fe、Zn含量較高,Al和Fe是地殼中含量代表性元素,而Zn元素是由車輛輪胎磨損產生[23]。這表明揚塵風沙可能是構成新鄉細顆粒物的主要貢獻者。

研究證實,氧化應激、炎癥反應和DNA損傷等是PM2.5導致機體損害的主要機制[24]。通常情況下,機體內的氧化和抗氧化水平是保持動態平衡的,但當受到外來物質入侵時,機體內自由基水平會顯著升高,導致氧化應激反應。通過檢測MDA水平和SOD活性來評估PM2.5誘導的氧化損傷和抗氧化能力是一個重要的手段[25]。本研究發現,高劑量PM2.5組SOD活性與對照組相比明顯降低,高劑量PM2.5組的MDA與對照組相比,含量顯著增高,差異均具有統計學意義。T-AOC是反映機體的總抗氧化能力,本文所測T-AOC指標結果顯示,高劑量PM2.5組的抗氧化能力減弱,而DMF干預組的總抗氧化能力與高劑量PM2.5組相比顯著增高,差異具有統計學意義。實驗數據表明,高濃度PM2.5的暴露會引起大鼠胎盤組織發生氧化應激反應,通過DMF給藥可以逆轉這一現象,使機體的抗氧化能力增高。研究表明,短期給予DMF能顯著抑制巨噬細胞的炎癥反應[26]。根據本文的研究結果,促炎因子IL-6的水平隨著PM2.5暴露濃度的增加呈劑量效應性增高的趨勢,然而并未顯示出統計學意義。IL-10是反映機體抗炎能力的指標,與對照組相比,低劑量PM2.5組、高劑量PM2.5組顯著降低,具有統計學意義,這與文獻中研究結果一致[27]。與高劑量PM2.5組相比,DMF干預組IL-10含量有增高的趨勢。這表明機體的抗炎能力受到PM2.5的暴露而減弱,然而,就提升機體的抗炎機能而言,DMF的效果并不明顯。

Nrf2是堿性亮氨酸拉鏈(basic leucine zipper,bZip)轉錄因子的家族成員[28],它在抗氧化防御、氧化信號傳導、代謝、細胞增殖等方面發揮重要作用。在生理條件下,自噬、壞死和細胞程序性死亡均受抗氧化系統的調節,而抗氧化系統則受到Nrf2/HO-1的調節,但這種保護作用主要發生在細胞質中[29]。當機體組織中Keap1表達缺失或降低,會導致Nrf2泛素化-蛋白酶體降解失衡,從而增加細胞內Nrf2蛋白的含量,將Nrf2移位到細胞核,進而激活其下游HO-1的表達[30]。HO-1是血紅素加氧酶的一個亞型,參與了游離鐵誘導的血紅素分解為膽紅素。作為ARE調控的主要抗氧化劑基因,HO-1及其代謝產物具有抗氧化、抗炎和信號轉導等功能,并在人體各種器官中廣泛表達[14]。盡管有許多研究對DMF作為Nrf2激活劑的作用和有效性進行了廣泛探討,但只有少數數據評估了DMF的作用[31]。Sun等人[32]發現,口服DMF可減輕神經炎癥,并提高Nrf2和抗氧化酶(例如SOD、HO-1)的水平。但因其在生殖系統較少涉及,通過查閱文獻我們發現,目前,仍未見因DMF導致不良妊娠結局的相關研究[33]。由此本文假設,DMF給藥可以緩解胎盤氧化應激和炎癥反應。通過Western 印跡檢測,本文測定了Nrf2及其下游因子HO-1的蛋白質含量。本文結果顯示,低劑量PM2.5組和高劑量PM2.5組的Nrf2、HO-1明顯低于對照組,與高劑量PM2.5組相比,DMF干預組Nrf2、HO-1蛋白質含量增多,差異均有統計學意義。本文觀察到DMF逆轉了PM2.5誘導的Nrf2的下調。根據Fan[34]等人報告,PM2.5暴露后Nrf2蛋白量減少,而其他研究則表明,Nrf2含量被PM2.5上調[35]。這些相互矛盾的發現可以用以下原因解釋,當PM2.5誘導的氧化應激和炎癥反應隨著時間的推移而逐漸發展且代償能力不足時,Nrf2蛋白的含量及表達可能會降低。在本文的研究中發現,PM2.5暴露導致Nrf2蛋白的含量減少,同時抑制了參與細胞防御系統的抗氧化因子HO-1的表達,DMF的干預增高了Nrf2和HO-1在大鼠胎盤的表達水平。

本文研究發現,環境中PM2.5的暴露可導致胎鼠數量減少、胎鼠平均體長較短,胎盤結構發生改變等。這表明PM2.5的暴露可能對機體產生一定程度的胚胎毒性,而DMF的給予明顯的緩解了這種胚胎毒性。研究結果顯示,孕前PM2.5暴露能夠引起胎盤組織氧化損傷及抗炎因子水平的降低,而DMF的干預能夠明顯的減輕因PM2.5暴露對大鼠胎盤造成的氧化損傷,提高機體的抗氧化能力。這些數據表明,通過改善Nrf2及其下游因子HO-1的蛋白質水平,DMF可能保護組織細胞免受PM2.5誘導的氧化損傷。因此,我們推測,Nrf2/HO-1信號通路可能參與了DMF對PM2.5誘發的生殖毒性的抗氧化保護作用。