體外炎性誘導星形膠質細胞激活及功能分析

程瑩瑩 ， 武建軍， 蔡海燕， 焦旭文， 馬江波， 丁銀秀*

1.寧夏醫科大學基礎醫學院人體解剖學系，寧夏 銀川 750006； 2.西安醫學院第二附屬醫院神經外科，陜西 西安 710038； 3.寧夏回族自治區人民醫院神經內科，寧夏 銀川 751006

神經炎癥作為一種基本的細胞內進展，是腦內穩態喪失的一種預警信號[1]。研究報道，機體受損時，反應性星形膠質細胞可能參與并加劇神經炎癥過程，通過其形態及功能變化、釋放大量炎性物質，如IL-1β、IL-6、NO 等，導致神經變性、死亡[2～4]。研究表明，占大腦內神經膠質細胞85%～95%的星形膠質細胞，在中樞神經系統的發育和功能中起著至關重要的作用，包括支撐營養、維持突觸內穩態、調節并保護神經元、參與血腦屏障等[5,6]，揭示星形膠質細胞幾乎在所有的中樞神經系統疾病中都發揮著重要的神經保護或神經毒性作用[7,8]，而其在炎癥反應中具體的變化及發揮的作用仍不清楚。因此，本實驗通過體外給予LPS、IFN-γ炎性刺激，模擬體內病理狀態下的大腦微環境，通過觀察星形膠質細胞的激活及功能變化，從而為神經炎癥發生發展的作用機制提供初步的實驗依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

C57BL/6 野生型新生仔鼠（1～3 d），由寧夏醫科大學實驗動物中心提供，SPF 級，符合倫理學規定，遵循實驗動物管理條例。

1.2 主要試劑

DMEM 培養基、胎牛血清、0.25% 胰蛋白酶、HBSS 液 購 自Gibco 公 司；lipopolysaccharide (LPS)、interferon-γ (IFN-γ) 購 自Sigma 公 司；兔 抗iNOS、ARG1、β-actin、TNF-α、IL-10，鼠抗IL-6 均購自CST 公司，兔抗GFAP 購自DAKO 公司，TGF-β1 購自Sigma公司；Alexa Fluo594 熒光標記山羊抗兔IgG 和山羊抗鼠IgG、Alexa Fluo488 熒光標記山羊抗兔IgG 和山羊抗鼠IgG 抗體均購自Invitrogen 公司。H-1000 封片劑購自Vector 公司。

1.3 方法

1.3.1 星形膠質細胞的原代培養 按照常規細胞培養流程，進行小鼠皮層星形膠質細胞的原代培養。取出生1～3 d 的野生型C57BL/6 仔鼠的大腦皮層，鏡下剔除血管及被膜，0.25%胰蛋白酶消化液處理剪碎的組織，終止消化后，吹打，200 目篩網過濾，離心棄上清，制成單細胞懸液。以1×106密度接種在T 75 cm2培養瓶，于37 ℃孵育箱中培養，隨后每3 d 換液1 次，待細胞長至90%，進行細胞純化、傳代。傳至第3 代，GFAP 免疫染色鑒定純度達95%以上用于后續實驗。

1.3.2 實驗分組 參照文獻報道的炎性刺激方法[9,10]，取100 ng /ml LPS 和20 ng /ml IFN-γ 劑量，隨機分 為Control、LPS（100 ng/ml）、IFN-γ（20 ng/ml）、M1（LPS，100 ng/ml+IFN-γ，20 ng/ml）4 組。給藥處理24 h 后進行實驗。

1.3.3 免疫細胞化學 細胞炎性處理后，4%多聚甲醛室溫固定30 min，封閉液（0.3% Triton X-100+1%BSA）室溫孵育1 h，加入一抗（GFAP）溶液4 ℃孵育過夜，加入熒光二抗，室溫避光孵育2 h，胞核復染10 min，H-1000 封片劑封片。Olympus 激光共聚焦顯微鏡觀察并采集圖像。

1.3.4 CCK-8 細胞活力檢測 將第3 代細胞種植于多聚賴氨酸包被的96 孔板內。培養4 d 時，鏡下觀察細胞生長良好，細胞數量達到70%以上，LPS 和或IFN-γ 作用24 h 后，CCK-8 檢測，492 nm 處檢測吸光度，分析各組細胞的活力狀態。

1.3.5 Western blot 蛋白電泳 各組細胞加入RIPA 裂解液，超聲震碎儀冰上裂解30 min 后，4 ℃下13 000 r/min 離心15 min，收集樣本。BCA 蛋白定量。經配膠、上樣、電泳（80～120 V）、轉膜（300 mA, 2 h,冰上）、封閉（室溫, 搖床30 r, 2 h）后，加入第一抗體（iNOS、ARG1、IL-10），4 ℃搖床孵育過夜。入HRP標記的二抗，室溫/搖床孵育2 h。發光顯影，記錄圖像數據用于定量分析。

1.4 統計學分析

應用GraphPad Prism 5.0 軟件，采用One-way ANOVA 分析對數據進行統計學分析，結果以均數±標準誤( mean±SEM )表示。當組間比較P值小于0.05時，差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 星形膠質細胞的原代培養與鑒定

鏡下觀察發現，原代培養星形膠質細胞10 d 時，細胞貼壁生長，數量較多，呈“鋪路石”樣排列，胞核較大，呈圓形或卵圓形，胞體呈梭形，折光性偏暗，可發出許多胞突。傳代至第3代時，GFAP/Hoechst免疫熒光染色鑒定，星形膠質細胞的純化率達95%以上（圖1）。

圖1 星形膠質細胞的原代培養與純度鑒定A：倒置相差顯微鏡下觀察星形膠質細胞的生長情況（10 d，視野下灰色區域為星形膠質細胞，上層較小的發亮的細胞為小膠質細胞） B：GFAP 陽性細胞率95%以上（紅色）Fig.1 Primary cultured astrocytes and its purity identification. A:The growth of astrocytes was observed under inverted phase contrast microscope(10 days, the gray and diffuse areas were astrocytes in the visual field, the smaller, shiny cells in the upper layer were microglia); B: The ratio of GFAP positive astrocytes was over 95% (red).

2.2 炎癥環境中，星形膠質細胞形態改變，GFAP 陽性細胞數量增多

給予M1 刺激24 h 后，GFAP 陽性細胞胞體腫脹變大，形態改變并扭曲，突起變長，細胞數量明顯增多。統計分析發現，與Control 組相比，M1 組GFAP 陽性細胞明顯增多，差異有統計學意義（P＜0.001）（圖2）。

圖2 LPS 和IFN-γ 聯合刺激下星形膠質細胞的形態改變和數量變化A:免疫熒光染色發現，各組GFAP 陽性細胞的形態學改變（紅色）B:各組的GFAP 陽性細胞數量***P＜0.001Fig.2 The morphological and quantitative changes of astrocytes after LPS and IFN-γ combined stimulation. A:The morphological changes of GFAP positive astrocytes in each group were detected by immunocytochemical staining (red); B: The cell numbers of GFAP positive astrocytes in each group; ***P＜0.001.

2.3 炎癥干預下，星形膠質細胞活力下降

給予LPS 和或IFN-γ 炎性刺激24 h 后，測定細胞活力。結果顯示，與Control 組相比，LPS 組、IFN-γ 組及M1 組的吸光度（Absorbance Values）均升高；其中M1 組吸光度顯著升高，表明其死亡細胞數目增多，細胞活力下降（P＜0.001）（圖3）。

圖3 炎癥刺激下星形膠質細胞的細胞活力的變化情況各組細胞的吸光度比較,***P＜0.001 ns,無統計學意義Fig. 3 Cell viability of astrocytes under inflammatory stimulation. The absorbance values of each group were compared. ***P＜0.001, ns, no statistical significance.

2.4 炎癥干預下，星形膠質細胞上誘導促炎因子表達升高

炎癥干預下，測定星形膠質細胞GFAP 及促炎因子（iNOS、IL-6、TNF-α）表達的變化情況。Western blot 結果顯示，給予M1 刺激24 h 后，GFAP 及促炎因子iNOS、IL-6、TNF-α 的 蛋 白 表 達 顯 著 升 高，與Control 組、LPS 組和IFN-γ 組相比，差異有統計學意義（P＜0.001）（圖4）。

圖4 Western blot 蛋白分析法測定炎癥刺激下促炎因子的蛋白表達水平A: GFAP, iNOS, IL-6, TNF-α和β-actin 的免疫蛋白條帶B: 各組的灰度值比較, *P＜0.05, **P＜0.01, ***P＜0.001,ns.無統計學意義Fig. 4 The protein expression of pro inflammatory factors under inflammatory stimulation by Western blot. A: The immunoblotting bands of GFAP, iNOS, IL-6, TNF-α and β-actin; B:The gray values of each group were compared; *P＜0.05, **P＜0.01, ***P＜0.001, ns,no statistical significance.

2.5 炎癥環境中，星形膠質細胞上誘導抗炎因子表達情況

炎癥干預下，測定星形膠質細胞抗炎因子（ARG1、IL-10 、TGF-β1）表達的變化情況。Western blot 結果顯示，與Control 組相比，給予LPS、IFN-γ 炎性刺激24 h 后，ARG1、IL-10 、TGF-β1 各組的表達水平呈上調趨勢；其中，與LPS 組相比，M1 組的ARG1表達明顯下降，差異有統計學意義（P＜0.01）（圖5）。

圖5 Western blot 法測定炎癥刺激下抗炎因子的蛋白表達水平A:ARG1, IL-10,TGF-β1 和βactin 的免疫蛋白條帶 B-D:各組的灰度值比較 *P＜0.05, **P＜0.01, ***P＜0.001,ns.無統計學意義Fig.5 The protein expres sion of anti-inflammatory factors under inflammatory stimulation by Western blot. A: The immunoblotting bands of ARG1, IL-10, TGF-β 1 and β-actin; B-D: The gray values of each group were compared; *P＜0.05， **P＜0.01， ***P＜0.001， ns, no significance.

3 討論

神經炎癥作為一種基本的細胞內進程，依賴其與神經元、星形膠質細胞、血腦屏障和中樞神經系統中浸潤的T 細胞的細胞間相互作用，是阿爾茲海默癥、帕金森病、急性創傷性腦損傷及感染性神經病理學等神經系統疾病的典型特征[11]。

近年來，對星形膠質細胞在神經炎癥中扮演的角色仍存在較大的分歧和爭議。研究表明，星形膠質細胞被激活后，分泌營養因子等發揮神經保護作用，而過度激活時，會分泌大量炎性因子，導致神經損傷[12,13]。本研究旨在探討星形膠質細胞參與神經炎癥的功能意義，采用細胞培養、免疫細胞化學、免疫印跡等方法，觀察炎性刺激下星形膠質細胞的激活及其功能變化。結果表明：炎性刺激后，星形膠質細胞被異常激活，數量增多，形態改變，促炎因子iNOS、IL-6、TNF-α 表達上調，發生A1 樣功能極化表現。

結合文獻報道及前期研究發現，神經炎癥是把“雙刃劍”，核心環節是神經膠質細胞的激活，在促炎環境中，小膠質細胞發生M1/M2 極化，分泌部分炎性因子，一方面作用于神經元，引起變性死亡，另一方面激活星形膠質細胞，分泌細胞因子，加重神經炎癥與損傷；相反，在抗炎環境中，M2 型小膠質細胞作用星形膠質細胞，使其發生A2 表型，二者協同發揮神經保護或神經修復作用[14-16]。前期研究發現，LPS 作用于小膠質細胞后，小膠質細胞發生M1/M2 極化，而在星形膠質細胞作用不顯著；給予M1 刺激后，星形膠質細胞極化效果顯著。也就是說，部分的星形膠質細胞被LPS 激活后，同時釋放促炎因子和抗炎因子，一方面引發/加速炎癥反應，另一方面清除細胞碎屑、營養修復受損細胞。因此，LPS 組的促炎因子和抗炎因子均表達上調。給予M1 刺激后，顯著激活星形膠質細胞發生極化，與LPS 組相比，促炎效應明顯大于抗炎效應，導致促炎因子表達明顯升高，而部分抗炎因子表達呈下調趨勢；引起我們思考的是，與CON 組相比，LPS 組和M1 組的抗炎因子均上調，M1 組僅比LPS 組表達略低，可能是因為在LPS 作用下，被激活的部分星形膠質細胞為抗炎型細胞，為了穩定細胞/機體狀態，分泌部分抗炎因子（ARG1、IL-10、TGF-β 1），發揮神經保護作用；而在M1 作用下，星形膠質細胞明顯激活極化，促炎型細胞數量明顯多于抗炎型細胞數量，但抗炎型細胞仍有部分存活，從而炎性因子明顯上調，而抗炎因子降低。此外，TGF-β1 作為星形膠質細胞特異性分泌因子，星形膠質細胞受不同程度刺激后均會分泌TGF-β1，TGF-β1 表達上調。該結果提示炎性刺激誘導星形膠質細胞發生A1 樣極化及功能變化，有助于深入認識星形膠質細胞在神經炎癥中的角色及機制問題。

盡管有學者認為，主導神經炎癥發生的是小膠質細胞的“第一觸發或反應識別”，但我們認為星形膠質細胞在神經炎癥的后續發展中扮演著不容忽視的角色。一是星形膠質細胞在中樞神經系統中分布廣泛，二是其在生理穩態和病理進程中的價值，都值得我們強烈關注。此外，在神經炎癥的發生發展中，小膠質細胞與星形膠質細胞之間的互作效應也值得深入研究。