高效液相色譜法測定菜用大豆鮮籽粒VC含量

鐘文娟，石盛佳，陳四維，戢沛城，龔一耘，牟方生

（四川省農業科學院經濟作物育種栽培研究所，四川 成都 610300）

菜用大豆（Glycine max(L.)Merr.）亦稱鮮食大豆、毛豆，鼓粒后期籽粒尚未完全飽滿，以幼嫩莢果和鮮籽粒作為蔬菜食用的一類專用大豆[1]，富含蛋白質、碳水化合物、膳食纖維、維生素和多種礦物元素，口味獨特，深受消費者青睞，是一種具有營養和保健功能的優質食品[2]。

維生素C（VC）又名抗壞血酸，廣泛存在于新鮮果蔬中，是維持人體正常生理代謝的一種重要化合物[3]，但人體自身不能合成VC，需要從食物中攝取。菜用大豆含有豐富的VC，是其重要的營養品質之一[2]。已知VC 含量測定的主要方法有熒光法[1]、紫外-可見分光光度法[4]、2,6-二氯靛酚鈉鹽滴定法[5-7]、2,4-二硝基苯肼比較法[8-9]、高效液相色譜法（High performance liquid chromatography，HPLC）4 種[10-11]。陳華濤等[1]采用GB/T 5009.86—2003《蔬菜、水果及其制品中總抗壞血酸的測定（熒光法）》測定出9個菜用大豆品種籽粒中VC平均含量為16.60～27.67 mg/100 mg。徐兆生等[7]采用2,6-二氯靛酚鈉鹽滴定法測定了55份菜用大豆VC含量，發現鮮籽粒中VC含量為14.70～40.80 mg/100 g，平均值為27.56 mg/100 g，變異系數為21.03%。

目前尚未見用其他方法測定菜用大豆VC 含量的研究報道。同時，菜用大豆鮮籽粒中蛋白質和淀粉含量高[7]，采用2,4-二硝基苯肼比較法和熒光法測定時干擾因素較其他果蔬多。高效液相色譜法相對于其他方法具有高效、簡單、準確性好、靈敏度高等特點，且不受樣品顏色的影響，廣泛用于果蔬中VC含量的測定[12-15]，但是目前尚未見用高效液相色譜法檢測菜用大豆鮮籽粒VC含量的報道。因此，本研究采用HPLC 對菜用大豆鮮籽粒VC 含量進行檢測，同時優化VC提取條件和方法，建立了菜用大豆鮮籽粒VC提取的前處理方法。采用HPLC測定菜用大豆鮮籽粒VC 方法具有簡便、穩定和高效的特點，為測定菜用大豆鮮籽粒中VC含量提供理論參考，并為高VC菜用大豆品種的選育提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料與試劑

菜用大豆樣品于2021 年6 月采摘于四川省成都市青白江區試驗基地，采摘后于-20 ℃條件下保存，其他信息詳見表1。L（+）抗壞血酸標準品（純度為99.23%），德國Dr.Ehrenstorfer GmbH 公司；甲醇（色譜純），美國Fisher 公司；偏磷酸（分析純），天津市科密歐化學試劑有限公司；超純水，實驗室自制。

表1 供試菜用大豆信息Table 1 Test vegetable soybean information

1.1.2 儀器與設備

Agilent-1200 型高效液相色譜儀（帶紫外檢測器和自動進樣器），美國安捷倫公司；AUW220D 型電子分析天平（精確度0.000 01 g），日本島津公司；T-203型電子分析天平（精確度0.001 g），美國丹佛儀器公司；AvantiJ-E型大容量高速冷凍離心機，貝克曼庫爾特有限公司；JYL-C022E 型料理機，九陽股份有限公司；ECO-Q15 型純水機，上海和泰儀器有限公司；SCIENTZ-IIF型超聲萃取儀，寧波新芝生物科技股份有限公司；GM-0.33Ⅱ型真空泵，天津市津騰實驗設備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 VC標準溶液的配制

準確稱取0.025 00 g L(+)抗壞血酸標準品，采用30 g/L偏磷酸溶液將其溶解并定容至25 mL，得到質量濃度為1 000μg/mL的標準儲備液。分別吸取標準儲備液0.05、0.10、0.20、0.40、0.70、1.00 mL 于棕色容量瓶中，用30 g/L偏磷酸溶液定容至25 mL，得到質量濃度分別為2.0、4.0、8.0、16.0、28.0、40.0μg/mL 的VC標準溶液。

1.2.2 樣品前處理與制備

取菜用大豆鮮莢若干，剝殼后將鮮籽粒置于冰上。稱取鮮籽粒20.000 g（精確至0.001 g），置于制漿杯中，加入30 g/L 偏磷酸溶液40 mL，用料理機處理90 s 將其制成勻漿，用置于冰上的100 mL 燒杯收集勻漿。稱取15.000～20.000 g（精確至0.001 g）勻漿，置于離心管中，再向離心管中加入30 g/L 偏磷酸溶液20 mL。

將裝有勻漿的離心管放入超聲萃取儀低溫（4 ℃）提取20 min，完成后將其置于離心機中以8 000 r/min的轉速在4 ℃下離心10 min。隨后將上清液轉移至50 mL容量瓶中，用30 g/L偏磷酸溶液定容并搖勻，獲得樣液。用針式注射器吸取部分樣液，通過0.45μm濾膜過濾注入樣品瓶中，4 ℃保存待上機分析。

1.2.3 色譜條件

色譜柱為Agilent Eclipse XDB-C18柱（4.6 mm×250 mm×5μm），流動相為1 g/L偏磷酸溶液∶甲醇=96∶4（V/V），流速0.8 mL/min，檢測波長243 nm，柱溫25 ℃，進樣量20.0μL。

1.2.4 提取溶劑種類和濃度的選擇

VC具有較強的還原性，易受空氣、熱、光等因素影響，但在酸性溶液中有良好的穩定性。菜用大豆籽粒中蛋白質和淀粉含量多，為防止樣品VC的氧化分解，以及將VC與其他物質有效分離，在李國秀等[12]研究的基礎上，并參考GB 5009.86—2016[16]中還原性抗壞血酸的浸取劑，選用偏磷酸溶液作為提取劑。分別用10、20、30、40、50 g/L偏磷酸溶液提取同一菜用大豆樣品VC，同時溶解標準樣品，測定出不同質量濃度溶劑制備的標準樣品及樣品所對應的保留時間和峰面積，依照外標對照法計算VC含量和相對標準偏差（RSD）。

1.2.5 流動相的選擇

流動相需考慮使VC 穩定所需的酸性環境以及色譜柱的pH適用范圍，選擇1 g/L偏磷酸溶液作為流動相的主體，再配以適當比例的甲醇作為流動相。

1.2.6 標準曲線的繪制

將VC 標準溶液用0.45 μm 濾膜過濾到樣品瓶中，按“1.2.3”中的色譜條件進行分析，測定其峰面積，以VC標準溶液質量濃度（μg/mL）為橫坐標，峰面積（mAU·s）為縱坐標，繪制標準曲線。

1.2.7 精密度試驗設計

將菜用大豆樣品‘川鮮豆2 號’按“1.2.2”所述方法制得樣品溶液后，按照“1.2.3”中的色譜條件連續進樣測定6次，計算樣品中VC含量和RSD值。

1.2.8 穩定性試驗設計

將菜用大豆樣品‘81-5’按照“1.2.2”所述方法制得樣品溶液后，于4 ℃條件下靜置8 h，按照“1.2.3”中的色譜條件分別于0、1、2、3、4、5、6、7、8 h進樣分析，計算樣品中VC含量和RSD值。

1.2.9 重復性試驗設計

將菜用大豆樣品‘川鮮豆1 號’按“1.2.2”所述方法平行制備6份供試樣品溶液，按照“1.2.3”中的色譜條件分別進樣分析，計算樣品中VC含量和RSD值。

1.2.10 回收率試驗設計

精密稱取已知VC 含量的菜用大豆樣品‘81-5’，加入VC標準溶液適量，按照“1.2.2”所述方法制備6份供試樣品溶液和“1.2.3”中的色譜條件分別進樣分析。

1.2.11 數據處理

所有試驗數據均用Excel 2007軟件計算處理。

2 結果與分析

2.1 提取溶劑質量濃度的確定

由表2可見，以質量濃度為30、40、50 g/L 的偏磷酸溶液作為提取溶劑，檢測到的VC含量平均值無顯著性差異，因此選擇30 g/L偏磷酸溶液作為浸取劑提取菜用大豆鮮籽粒中VC。

表2 提取劑質量濃度選擇試驗結果Table 2 Selection test results of extractant concentration

2.2 流動相的確定

以1 g/L 偏磷酸∶甲醇=96∶4（V/V）為流動相時，VC 與鄰近雜質峰能夠達到基線分離，液相色譜峰尖銳且樣品分析時間短，因此，本研究以1 g/L 偏磷酸∶甲醇=96∶4（V/V）為流動相。圖1 為VC 標準品色譜圖，圖2 為菜用大豆樣品溶液色譜圖。由圖1 和圖2可見，VC標準樣品和菜用大豆樣品中VC的保留時間分別為4.327 min和4.329 min。

圖1 VC標準溶液高效液相色譜圖Fig.1 Chromatogram of vitamin C standard solution by HPLC

圖2 菜用大豆樣品溶液高效液相色譜圖Fig.2 Chromatogram of vegetable soybean sample solution by HPLC

2.3 標準曲線繪制結果

如圖3 所示，VC 標準曲線回歸方程為y=80.751x-6.409 4，R2=1.000，表明VC 質量濃度范圍為2～40μg/mL時，其峰面積與質量濃度的線性關系良好。

圖3 VC標準曲線Fig.3 Standard curve of VC

2.4 精密度試驗結果

由表3可見：RSD值為0.13%，說明本試驗方法測定菜用大豆鮮籽粒VC含量的精密度良好。

表3 精密度試驗結果Table 3 Precision test results

2.5 穩定性試驗結果

表4 顯示：8 h 時樣品VC 含量為23.34 mg/100 g，RSD 值為0.30%，說明供試樣品溶液在4 ℃低溫下可保持8 h穩定。

表4 穩定性試驗結果Table 4 Stability test results

2.6 重復性試驗結果

由表5可見：RSD值為1.03%，說明本試驗方法測定菜用大豆鮮籽粒VC含量的重復性良好。

表5 重復性試驗結果Table 5 Repeatability test results

2.7 回收率試驗結果

由表6可見：平均加標回收率為108.14%，6次測定結果的RSD 值為1.70%，表明本試驗方法準確度良好。

表6 回收率試驗結果Table 6 Recovery rate test results

2.8 樣品測定

將12 個菜用大豆樣品按照“1.2.2”所述方法和“1.2.3”中的色譜條件，分別制備3份供試溶液進樣分析，依照外標對照法計算VC含量，結果見表7。由表7 可見，12 個菜用大豆品種鮮籽粒中VC 平均含量范圍為19.63～27.59 mg/100 g。與陳華濤等[1]采用熒光法測定9 個菜用大豆品種籽粒中VC 的平均含量（16.60～27.67 mg/100 g）范圍較一致。表明此方法能有效檢測出菜用大豆鮮籽粒中的VC含量。

表7 不同菜用大豆品種中VC含量測定結果Table 7 Determination results of VC content in different vegetable soybean varieties 單位：mg/100 g

3 討論與結論

菜用大豆鮮籽粒質地較硬且含有豐富的蛋白質和淀粉[10]，將樣品進行勻漿處理比較困難，不易得到較高質量的勻漿樣品。本研究優化的菜用大豆鮮籽粒前處理方法能有效地將鮮籽粒進行勻漿處理，得到品質較好的鮮籽粒勻漿，提高了樣品中VC 萃取率，并配合低溫提取減少鮮籽粒中VC 的氧化，盡量減少測定樣品中VC 含量的損耗，降低試驗誤差，是一種有效的前處理方法。同時，該樣品前處理方法也可為菜用大豆鮮籽粒中其他營養成分檢測提供參考。

菜用大豆鮮籽粒中的VC 含量沒有獼猴桃樣品中的含量高[12]，采用提取試劑10 g/L偏磷酸濃度試驗效果不理想，同時采用GB 5009.86—2016[16]中提供的參考質量濃度20 g/L 檢測時VC 也沒有目標峰，因此對菜用大豆鮮籽粒VC 提取的最適偏磷酸質量濃度進行了探究。試驗結果表明：不同提取劑質量濃度對檢測結果影響較大，30 g/L偏磷酸適宜用于菜用大豆鮮籽粒VC 的提取，因此建議在檢測不同作物VC含量時需要對相應的提取試劑質量濃度進行篩選，以獲得更加精準的試驗數據。

本研究采用高效液相色譜法測定菜用大豆鮮籽粒中VC含量，以30 g/L偏磷酸溶液作為提取溶劑，低溫提取菜用大豆鮮籽粒中VC，操作簡便，可避免樣品中VC 被氧化和其他基質成分的干擾。從穩定性試驗數據可以看出，8 h 內VC 含量變化不顯著，能夠保證樣品和對照品溶液在測定的時間內穩定。供試樣品色譜峰對稱性良好，既能達到基線分離的要求，又有適宜的保留時間，測定結果穩定準確，且靈敏度高。綜上所述，該方法適用于測定菜用大豆鮮籽粒中VC含量。