FSHR基因多態性、BMI及性激素與多囊卵巢綜合征發病風險的相關性分析

昝志芳，土增榮，王淇蓉，段毓，劉建兵，李莉*

1山西醫科大學基礎醫學院醫學細胞生物與遺傳學教研室，山西太原 030001；2山西醫科大學第一醫院生殖醫學科，山西太原 030001

多 囊 卵 巢 綜 合 征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是育齡婦女常見的內分泌及代謝疾病[1‐3]，全球患病率為4%～18%[4‐5]，我國的患病率約為5.6%[6]，占無排卵性不孕癥的75%[7]，且發病率呈逐年上升趨勢。PCOS臨床表現為月經稀發或閉經、無排卵性不孕、肥胖、痤瘡和多毛等[8‐9]。遠期并發癥有代謝性疾病、子宮內膜癌、糖尿病、高血壓及不良的妊娠結局等[9‐10]，嚴重危害女性的生活質量和生育能力，是生殖領域面臨的巨大挑戰之一[11]。目前普遍認為，PCOS的發生與遺傳、環境、生活習慣及心理健康等密切相關，但其發病機制及影響因素至今尚未完全闡明、診斷標準尚未統一[12]，因此，進一步探討PCOS的易感基因及多態性對于更好地了解該疾病具有重要意義。PCOS的臨床表現具有高度異質性，其發生發展與機體紊亂的激素水平密切相關[13]，肥胖也會增加特定妊娠和分娩并發癥的風險[14]。越來越多的證據表明，PCOS是一種多基因復雜病[15‐16]，而卵泡刺激素受體(follicle stimulating hormone receptor，FSHR)基因異常在PCOS 發病中扮演了重要角色。FSHR基因的rs2268361和rs2349415是與PCOS具有顯著關聯的單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism，SNP)位點[17]，目前國內外已針對FSHR基因SNP位點的多態性進行了廣泛研究，但結論存在一些矛盾[18]，主要體現在FSHR基因多態性與PCOS是否具有相關性及其機制方面。本研究通過分析PCOS 患者與健康對照者的外周血及卵泡液、檢測體重指數(body mass index，BMI)及血清性激素指標，探究FSHR基因rs2268361 和rs2349415 位點的多態性分布，以及該基因不同基因型個體卵巢顆粒細胞中FSHRmRNA 的表達水平及其與PCOS 發病的關系，以期為PCOS 的早期診斷及治療提供相關分子標志。

1 資料與方法

1.1 研究對象 本研究為病例對照研究。選擇2021年3—8月在山西醫科大學第一醫院生殖醫學科診治的213 例PCOS 患者作為PCOS 組。納入標準：(1)PCOS 診斷符合2003 年《鹿特丹共識》[19]；(2)年齡20～40 歲女性；(3)非妊娠育齡期；(4)近3 個月內未服用過影響激素變化的藥物。排除標準[20]：(1)其他原因導致的高雄激素表現或月經異常；(2)臨床確診為高泌乳素血癥、甲狀腺功能障礙、糖尿病等疾??；(3)嚴重臟器功能不全、惡性腫瘤等疾??；(4)伴有子宮疾病、反復流產、染色體異常等。同期納入同一醫院中身體健康、由于輸卵管因素或男方因素來院檢查的207名健康非PCOS女性作為對照組。采用隨機號碼表法(即利用隨機號碼表抽取樣本的方法)從上述PCOS 組與對照組中隨機收集實施體外受精‐胚胎移植者的卵泡液各32例(選擇取卵日穿刺的第1個直徑≥16 mm 的卵泡，盡量減少卵泡液中混入血液，拾卵后收集廢棄的卵泡液)，比較兩組FSHRmRNA相對表達量。本研究已獲山西醫科大學倫理委員會審批(批準號：2021GLL87)，所有研究對象均已簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 指標檢測與外周血DNA提取 測量所有受試者的身高、體重，計算BMI。所有受試者于月經周期第2～5 天(月經稀發或閉經者在B 超檢查無優勢卵泡時)，清晨空腹靜息10 min后采集外周靜脈血。非抗凝管采血5 ml，EDTA 抗凝管采血2 ml。非抗凝血于30 min 內4000 r/min 離心10 min，取上清液，采用免疫化學發光全自動生化分析儀及配套試劑盒(日本東曹株式會社)檢測血清性激素六項[卵泡刺激素(follicle stimulating hormone， FSH)、 黃 體 生 成 素(luteinizing hormone，LH)、雌 二 醇(estradiol，E2)、睪酮(testosterone，T)、孕酮(progesterone，P)、泌乳素(prolactin，PRL)]的水平?？鼓杉蠓胖糜? ℃冰箱保存，并在3 d內采用全血DNA提取試劑盒(美國OMEGA 公司)抽提全血DNA，利用微量核酸測定儀測定樣本濃度與純度，選擇吸光度值A260/A280比 值 為1.8～2.1，A260/A230＞1.5 的DNA 樣 本，置 于-20 ℃低溫冰箱備用。

1.2.2 DNA擴增與基因分型 利用Primer 5.0軟件和NCBI 數據庫進行FSHR基因SNP 位點rs2268361 和rs2349415 的引物設計。引物序列：rs2268361，上游5'‐TGGCTTTGATGCTGTGAGAC‐3'，下游5'‐CAACA‐TCCACCAATGAAAGATC‐3'；rs2349415，上游5'‐AA‐ACTTTATTCATAAAAACAGGTG‐3'，下游5'‐ATCTA‐GGACAGTGTCACTGAACTAC‐3'。采用聚合酶鏈式反應(PCR)擴增DNA：10 μl 的PCR 反應體系中2×TaqMaster Mix 5 μl，模 板DNA 1 μl，上下 游 引物(10 μmol/L)各0.1 μl，高低溫內標MIX 0.2 μl，LC Green 0.8 μl，去離子水2.8 μl補充至10 μl；熱循環參數：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s、52 ℃ 30 s、72 ℃ 7 s，循環35 次；72 ℃ 7 min，95 ℃ 30 s，25 ℃ 2 min，94 ℃30 s，24 ℃ 4 min。使用高分辨熔解曲線分析(HRM)系統(美國Idaho Technology 公司)進行基因分型，所有結果均經雙人核對并對有疑問的樣本進行測序驗證。為保證準確的基因分型結果，每個SNP 位點的基因型隨機選擇3 個樣本，對PCR 產物進行測序驗證。測序由北京華大基因科技有限公司完成。

1.2.3 外周血總RNA提取與實時定量聚合酶鏈反應(qRT‐PCR) Trizol 法提取總RNA，利用瓊脂糖凝膠電泳分析RNA完整性及是否存在污染，利用微量核酸測定儀測定樣本濃度和純度，選擇吸光度值A260/A280比值在1.8～2.1，A260/A230＞1.5 的RNA 樣本，置于-80 ℃低溫冰箱保存，檢測合格的樣本采用反轉錄試劑盒(日本TaKaRa 公司)反轉錄為cDNA。FSHR基因引物序列：上游5'‐GTGCATTCAATGGAACCCAAC‐TAGA‐3'， 下 游5'‐TCCGTGGAAAACATCATTAGGC‐3'。用SYBR Green? Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒(日本TaKaRa公司)進行qRT‐PCR 反應，每個樣本設置3 個復孔。采用實時定量PCR 儀(美國Thermo Fisher Scientific 公司)檢測FSHRmRNA的表達水平。用內參β-actin、目的基因FSHR基因相對拷貝數，計算2-ΔΔCt，比較PCOS組與對照組FSHR基因mRNA相對表達量。

1.2.4 卵巢顆粒細胞總RNA 提取與qRT‐PCR 收集受試者取卵日穿刺的第1個直徑≥16 mm的卵泡(盡量減少血液混入)，并將卵泡液混勻后置于15 ml 離心管中，1500 r/min離心10 min，將紅細胞層上方的白色絮狀物吸出，置于1.5 ml EP 管中，添加紅細胞裂解液500 μl，充分震蕩，冰上靜置5 min。加1 ml PBS重懸沉淀，1500 r/min離心5 min，棄上清，重復2～3次至沉淀為白色。使用Trizol法提取卵泡液中顆粒細胞總RNA，反轉錄為cDNA，進行qRT‐PCR 反應，并計算FSHR基因mRNA相對表達量。

1.3 指標分析 比較兩組間各臨床指標的差異，并分析各指標之間的相關關系；比較兩組FSHR基因rs2268361和rs2349415位點的基因型和等位基因頻率分布；在探究單一變量與PCOS 發病的關系時，因無法消除其余指標對PCOS 發病的影響，本研究以年齡、BMI、E2、P、PRL、LH、FSH、LH/FSH為自變量，以是否發生PCOS 為因變量，構建多因素logistic回歸方程分析性激素、BMI、SNPs與PCOS發生的相關性；采用qRT‐PCR 檢測PCOS 組與對照組外周血和部分受試者卵泡液中卵巢顆粒細胞中FSHRmRNA 水平，探究rs2349415 位點不同基因型是否影響FSHRmRNA的表達水平。

1.4 統計學處理 采用SPSS 26.0 和R 語言對數據進行統計分析。計量資料以±s表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；計數資料以例(%)表示，組間比較采用χ2檢驗。采用多因素logistic回歸分析PCOS發生易感的影響因素。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 兩組臨床指標間的關系 Pearson 相關分析顯示，LH 與LH/FSH 呈明顯正相關(r=0.88，P＜0.05)，FSH 與LH/FSH 呈弱負相關(r=-0.30，P＜0.05)；其他指標之間兩兩相關系數均較低(中位數0.06)，且差異無統計學意義，表明各指標間相互獨立(圖1)。

圖1 臨床指標間散點圖及其Pearson相關系數Fig.1 Scatter diagram of clinical indicators and Pearson correlation coefficient

2.2 兩組臨床指標比較 PCOS 組體重、BMI、E2、LH、T 及LH/FSH 均明顯高于對照組(P＜0.05)，而FSH 水平明顯低于對照組(P＜0.001)；兩組年齡、身高、PRL、P 水平比較差異無統計學意義(P＞0.05，表1)。

表1 PCOS組與對照組臨床指標比較(x±s)Tab.1 Comparison of clinical indicators between the PCOS and control groups (x±s)

2.3 兩組FSHRSNP 位點基因型和等位基因頻率分布比較 HRM 檢測結果顯示，對照組FSHR基因rs2268361 和rs2349415 多態性位點符合Hardy‐Weinburg 平 衡。PCOS 組 與 對 照 組rs2268361 位 點 的CC、CT、TT 3種基因型頻率及C、T等位基因頻率差異均無統計學意義(P＞0.05)；兩組rs2349415 位點的CC、CT、TT 基因型頻率(χ2=7.529，P=0.023)及C、T 等位基因頻率(χ2=6.044，P=0.014)差異有統計學意義(表2)。

表2 PCOS組與對照組FSHR基因型和等位基因頻率分布比較[例(%)]Tab.2 Comparison of frequency distribution of FSHR genotypes and alleles between PCOS and control groups [n(%)]

2.4 多因素logistic回歸分析PCOS發生的相關因素多因素logistic 回歸分析顯示，高水平的BMI(OR=1.112， 95%CI 1.059～1.167)、 E2(OR=1.009， 95%CI 1.003～1.014)、LH(OR=1.178，95%CI 1.114～1.247)均 為PCOS 發生的獨立危險因素，而相對高水平的FSH(OR=0.832，95%CI 0.768～0.901)則可降低PCOS 的發生風險(P＜0.05)；與rs2349415 位點CC 基因型相比，攜帶CT 基因型可增加PCOS 的發生風險(P=0.009)；經校正年齡、BMI后，rs2349415位點CT基因型仍為PCOS發生的獨立危險因素(OR=1.933，95%CI 1.275～2.932)(圖2)。

圖2 Logistic回歸分析臨床指標和SNP位點比值比(OR)的森林圖Fig.2 Logistic regression analysis of odds ratio (OR) of clinical indicators and genotypes of SNP

2.5 兩組rs2349415 位點的多態性及FSHRmRNA 表達水平 在外周血中，FSHRmRNA 水平在PCOS 組與對照組間、在rs2349415 位點CC、CT、TT 3 個基因型間差異均無統計學意義(圖3A、B)；在卵巢顆粒細胞中，PCOS 組FSHRmRNA 水平明顯高于對照組(P=0.004)，rs2349415 位 點 上TT 基 因 型 的FSHRmRNA 表達水平高于CC 和CT 基因型，差異有統計學意義(P=0.002；P=0.035；圖3C、D)。

圖3 兩組間及rs2349415位點不同基因型個體的外周血及卵巢顆粒細胞中的FSHR mRNA表達水平Fig.3 FSHR mRNA expression levels in peripheral blood and ovarian granulosa cells of PCOS and control groups and individuals with different genotypes at rs2349415

3 討 論

調整生活方式已逐漸被公認為是PCOS 的一線治療方法，可緩解患者的代謝功能紊亂并改善生殖障礙[21]。在PCOS 的發生發展過程中，肥胖既是臨床特征，又參與PCOS病理機制形成的各個環節[22]。肥胖女性性激素結合球蛋白水平下降[23]，可使雄激素水平升高，進而破壞排卵功能[24]。本研究PCOS組的BMI 明顯高于對照組，進一步提示肥胖是導致PCOS易感性增高的原因之一，建議肥胖PCOS患者通過減重來達到有效的干預。PCOS組LH、LH/FSH及T水平較對照組明顯升高，而FSH水平明顯下降，與以往的研究結果基本一致[25]。雄激素為卵泡發育與成熟所必需的條件，但PCOS 患者異常增高的雄激素水平反而阻礙了優勢卵泡的發育，雄激素過量也可能提示PCOS 的潛在易感性增加[26]。本研究中PCOS患者E2水平明顯升高，除與患者體內雌酮(E1)明顯增多，與E2相互轉化外，也可能與PCOS 患者基礎竇卵泡數量較多、所分泌的雌激素增加有關。LH和FSH屬于糖蛋白激素，可直接作用于卵巢，提高顆粒細胞活性進而加速卵泡發育。PCOS患者垂體對促性腺激素釋放激素的敏感性增加，分泌過量的LH，臨床上LH/FSH≥2，可輔助診斷PCOS[27]。本研究各臨床指標間相關性分析顯示，LH與LH/FSH 呈明顯的正相關，而FSH 與LH/FSH 呈弱負相關，提示高LH水平紊亂對于協助PCOS診斷更具敏感性。

遺傳因素在PCOS 發病中的作用越來越受到關注。最近的全基因組關聯研究(genome‐wide association studies，GWAS)發現了18種與PCOS明顯相關的遺傳變異[18]，包括DENND1、INSR、FSHR、LHCGR等基因或附近的變異。FSHR基因位于2p16.3，由10個外顯子和9 個內含子組成，是促卵泡激素和性腺發育功能的受體。一項跨種族的Meta 分析結果顯示，FSHR的SNP位點rs2268361 T等位基因和rs2349415 T等位基因增加了PCOS 的發病風險[28]；針對泰國婦女的大多數研究并未證實FSHR多態性增加PCOS的易 感 性[28]；中 國 女 性 的GWAS‐Meta 研 究 發 現，rs2268361 與中國婦女PCOS 易感性明顯相關[29]；一項針對中國南方漢族的研究發現，在卵巢多囊樣變與非多囊樣變組間SNP 位點rs2268361 GG 基因型的等位基因分布存在明顯差異，而在rs2349415位點上則未發現明顯差異[30]。在本研究人群中，FSHR基因rs2268361 位點的等位基因型分別為CC、CT 和TT，PCOS 組中最小等位基因頻率C 為48.6%，該位點多態性與PCOS 易感性無明顯相關，與一項涉及中國和澳大利亞的跨種族Meta分析發現不一致[28]，提示可能在不同人群、種族、民族和地域間存在一定的遺傳互作；rs2349415 位點的等位基因組成CC、CT和TT 3 種基因型，PCOS 組中最小等位基因頻率T為27.0%，明顯高于對照組的19.8%(P=0.014)，提示在本研究人群中，rs2349415‐T 等位基因增加了PCOS的發病風險。

FSHR主要由卵巢顆粒細胞分泌，顆粒細胞在原始卵泡的啟動和生長發育中起著重要的調控作用[31]。本研究發現，兩組外周血中FSHRmRNA表達水平差異無統計學意義，而在卵巢顆粒細胞中PCOS 組FSHRmRNA 表達水平明顯高于對照組(P=0.014)。此外，本研究檢測了rs2349415位點不同基因型個體卵巢顆粒細胞中FSHRmRNA 的表達水平，結果發現TT 基因型個體FSHRmRNA 表達水平高于CC 和CT基因型，提示不同的基因型可影響FSHR的表達。FSHR基因的多態性一方面影響PCOS 的易感性，另一方面也影響了促排卵治療時FSHR 對外源性FSH的敏感性[18]，FSH‐FSHR相互作用可促進卵巢顆粒細胞分化及卵泡成熟[32‐33]，可能影響PCOS的發生，因此，在輔助生殖促排卵用藥中，有望依據患者FSHR基因rs2349415位點不同基因型使用不同劑量的外源性FSH，從而指導臨床用藥。

綜上所述，本研究發現，高水平的BMI、E2、LH 以及rs2349415 T 等位基因是PCOS 發生的危險因素，不同的基因型可影響卵巢顆粒細胞FSHRmRNA的表達，為PCOS 的早期篩查與治療提供了潛在分子標志，對闡明PCOS 的發病機制，以及早期識別與管理提供理論基礎。本研究仍存在局限性：納入的樣本量偏小，且為單一的醫療中心。但是本研究為PCOS 的早期篩查提供了一定的科學依據，未來應聯合多中心以擴大樣本量及地域范圍，以期獲得更全面的研究結果，對PCOS 患者乃至整個家庭及社會均有重要意義。