晚期非小細胞肺癌患者骨轉移灶與內臟病灶的全身藥物治療反應差異分析

丁朝偉 梁海杰 尉然 于沂陽 郭衛

肺癌是我國乃至全球男性和女性癌癥發病率及相關病死率均較高的惡性腫瘤，近年來其發病率和病死率呈明顯上升趨勢[1-2]。80% 的肺癌患者其病理亞型為非小細胞肺癌 ( non-small-cell lung cancer，NSCLC )，其中腺癌又是最常見的亞型。隨著基于靶向藥物的個性化藥物的出現與發展[3]，以及免疫檢查點抑制劑免疫療法的常規使用[4]，包括手術治療、放療及全身藥物治療的綜合治療方案正應用于所有NSCLC 患者，化療、免疫治療以及新型靶向藥物的聯合應用可顯著改善晚期肺癌患者的預后，總生存期( overall survival，OS ) 甚至可遠長于 5年[5]。然而，在大多數 NSCLC 患者中，遠處轉移 ( distant metastasis，DM ) 的存在仍然是高病死率的原因之一[6]，并且在藥物治療過程中獲得耐藥性的出現更讓晚期 NSCLC 患者的治療效果不盡如意[7]。

臨床觀察表明，通過遠處轉移部位可以在一定程度上預測其預后情況。晚期 NSCLC 患者的轉移發展優先轉移到骨骼、大腦、肝臟、對側肺和腎上腺[8-9]，其中約 20%～30% 的 NSCLC 患者在診斷時就伴有骨轉移，約 30%～40% 的晚期患者會發生骨轉移[10]，骨轉移灶的出現會導致疼痛、骨骼相關事件 ( skeletal related events，SRE ) 發生及行動能力和生活質量下降，會對患者及社會造成很大的心理和經濟負擔。既往研究表明伴有骨轉移的晚期 NSCLC患者預后不如伴有腦轉移及其它內臟轉移者，其總生存率顯著下降，術后 1年的 OS 從 71.6% 降至46.8%[11]。

可見，用于晚期 NSCLC 患者的全身藥物治療方案，對于已發生骨轉移灶者或內臟轉移灶者的療效反應存在差異。然而，既往對 NSCLC 骨轉移研究重點是在早期階段識別“高風險”患者[12]，而關于NSCLC 骨轉移治療的報道很少，這與骨轉移的高發生率是不一致的。

本研究旨在探究晚期 NSCLC 患者的骨轉移灶與內臟轉移灶對全身藥物治療的反應差異，從臨床特征及基因表達層面，尋找其相關因素，進而為NSCLC 骨轉移患者的綜合治療方案提供理論基礎。

資料與方法

一、納入標準與排除標準

1. 納入標準：( 1 ) 2010年 1月至 2020年 12月，在我院骨腫瘤科就診的晚期 NSCLC 骨轉移患者；( 2 ) 通過穿刺活檢或術后病理以及影像學檢查確診為晚期 NSCLC 者；( 3 ) 臨床資料完整者；( 4 )骨轉移灶術前長期接受全身藥物治療 ( 包括術前長期化療、免疫治療或靶向治療 ) 者；( 5 )年齡 ＞18 歲者。

2. 排除標準：( 1 ) 骨轉移灶術前未進行全身藥物治療者；( 2 ) 無法評估骨轉移或內臟轉移灶的藥物反應者；( 3 ) 攜帶非 EGFR 突變類型患者。

二、研究對象

基因表達數據來自 GEO ( gene expression omnibus )數據庫中 GSE76194 數據集，挑選其中 4 對中國來源的肺癌原發灶和相應的骨轉移灶樣本數據，探針基于 GPL570 ( Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array ) 平臺轉換成基因表達矩陣。

三、臨床資料收集

本研究共納入 74 例。收集患者的一般資料 [年齡、性別、體質量指數 ( body mass index，BMI )、吸煙史、肺癌確診時間、初診分期、病理分型及基因突變情況、初診是否有轉移及轉移部位、發生內臟轉移時間及骨轉移時間 ]、全身藥物治療資料 ( 全身藥物治療開始時間及具體方案、是否使用雙磷酸鹽或地諾單抗等骨保護藥物及開始時間 ) 及全身藥物治療后資料 ( 原發灶及轉移灶是否進展、是否出現新發轉移灶、是否行局部放療、是否進行骨轉移灶手術、骨轉移灶手術前的生化指標 )。數據來自醫院病歷記錄或直接從患者或患者家屬處獲得。

四、分組及評價標準

根據全身藥物治療后首次進展時間將患者分為內臟病灶優先進展組與骨轉移灶優先進展組，下文中簡稱為內臟病灶組與骨病灶組。全身藥物治療方案根據確診時患者分期制定，主要觀測指標為疾病進展時間 ( time to progression，TTP )，即從開始全身藥物治療到骨轉移灶或內臟病灶發生進展的時間，根據實體瘤療效評價標準 ( response evaluation criteria in solid tumors，RESIST ) 1.1 版制定療效評價標準，利用電子計算機斷層掃描 ( computed tomography，CT )測量靶病灶最長徑變化以監測治療反應，骨轉移灶進展定義為接受全身藥物治療后出現新發骨轉移或可測量骨轉移靶病灶最長徑之和增加 20%；內臟病灶進展定義為接受全身藥物治療后內臟病灶出現新發轉移或內臟轉移靶病灶最長徑之和增加 20%。

五、臨床數據分析

定量數據用±s( 范圍 ) 表示，定性數據用計數 ( 百分比 ) 表示。采用單因素及多因素 Logistic 回歸分析，比較影響病灶進展先后的臨床因素。使用單變量 Cox 回歸模型對骨轉移優先進展預后因素進行分析，進展情況采用 Kaplan-Meier 方法估計，并使用對數秩檢驗進行比較，采用 Cox 比例風險模型進行多因素分析進一步探索骨轉移灶優先進展的獨立預后因素。檢驗水準 α 值取雙側 0.05。所有分析均使用 R 4.1.3 軟件完成。

六、基因表達數據分析

首先在 R 4.1.3 軟件上，使用 GEOquery 軟件包下載基因表達矩陣文件和注釋文件。使用 Idmap1 軟件包進行注釋獲得基因表達譜，并通過 Limma 軟件包[13]篩選在親本細胞原發灶與骨轉移灶的差異表達基因，差異表達基因篩選標準為P＜ 0.05 以及對兩組基因表達量比值 ( fold change，FC ) 取 2 為底的對數的絕對值 ( | Log2 ( FC ) | ＞ 2。使用 Pheatmap 包對上調和下調基因進行聚類分析。通過 GSEA ( gene set enrichment analysis ) ( Version 3.0 ) 進行骨轉移組和原發灶組差異表達的基因耐藥相關生物學途徑富集。耐藥相關 Geneset 通過以“Drug Resistance”和“Lung Cancer”為關鍵詞檢索分子特征數據庫( molecular signatures database，MsigDB ) 獲得。P＜0.05 以及標準化富集得分 ( normalized enrichment score，NES ) 的絕對值 ＞ 1 的富集結果被認為是顯著的，并由錯誤發現率 ( false discovery rate，FDR ) ＜0.25 進行校正。

結 果

一、骨轉移灶及內臟病灶全身藥物治療反應性差異

本組 74 例 中 15 例晚期肺癌患者接受全身藥物治療后發現內臟病灶優先進展 ( 內臟病灶組 )，59 例出現骨轉移灶優先進展 ( 骨病灶組 )，骨轉移灶優先進展率及內臟病灶優先進展率分別為 79.7% 以及20.3%。Wilcoxon 符號秩檢驗顯示，骨轉移和內臟轉移的優先轉移率差異有統計學意義 (P＜ 0.05 )，最終 26 例發現內臟病灶進展，74 例均發現骨轉移灶進展。內臟轉移灶與骨轉移灶中位進展時間分別為18.0 ( 14.8～21.2 ) 個月與 15.0 ( 11.2～18.8 ) 個月。兩組在性別、年齡、BMI、吸煙史、轉移部位、原發病理類型、實驗室檢驗結果等基線特征上差異無統計學意義 ( 表 1 )。

表1 兩組患者的變量描述性統計 ( n = 74 )Tab.1 Descriptive statistics of variables with no missing data collected and used for research ( n = 74 )

二、全身藥物治療反應性差異相關因素

內臟病灶組作為對照組，骨病灶組作為病例組進行 Logistic 回歸分析。結果提示存在 EGFR 突變、藥物治療前伴有內臟轉移以及藥物治療前內臟轉移部位是骨轉移灶優先進展的相關因素。將單因素分析結果中P＜ 0.05 的因素納入，行多因素 Logistic 回歸分析，結果顯示 EGFR 突變狀態以及藥物治療前內臟轉移部位是獨立相關因素 ( 表 2 )。

表2 骨病灶組與內臟病灶組單因素及多因素 Logistic 回歸分析結果Tab.2 Results of univariate and multivariate Logistic regression analysis in bone lesion group and visceral lesion group

三、晚期 NSCLC 患者骨轉移優先進展預后因素

本組 59 例出現骨轉移灶優先進展。單因素分析結果提示藥物治療前有骨轉移灶、僅使用靶向藥物以及內臟病灶接受放療是影響骨轉移灶優先進展的預后因素 ( 表 3 )。將單因素分析結果中P＜ 0.1 的因素進一步納入多因素 Cox 回歸分析，結果顯示有吸煙史、僅使用靶向藥物、內臟病灶接受放療以及藥物治療前伴腹腔內轉移可能是影響骨轉移灶優先進展的獨立危險因素，使用 Kaplan-Meier 方法構建進展曲線 ( 圖 1～4 )。

圖1 吸煙史分組骨轉移灶優先進展率的 Kaplan-Meier 圖Fig.1 Kaplan-Meier plot of the priority progression rate of bone metastases in groups with smoking history

圖2 全身藥物治療前骨轉移分組骨轉移灶優先進展率的Kaplan-Meier 圖Fig.2 Kaplan-Meier plot of the priority progression rate of bone metastases in groups with primary bone metastases

圖3 全身藥物治療方案分組骨轉移灶優先進展率的Kaplan-Meier 圖，C 代表單一化療，T 代表單靶向，C + T 代表化療聯合靶向治療，C + I 代表化療聯合免疫治療Fig.3 Kaplan-Meier plot of the priority progression rate of bone metastases in groups with drugs. C: Single chemotherapy; T: Single target; C + T: Chemotherapy combined with targeted therapy; C + I:Chemotherapy combined with immunotherapy

圖4 內臟轉移部位分組骨轉移灶優先進展率的 Kaplan-Meier 圖Fig.4 Kaplan-Meier plot of the priority progression rate of bone metastases in groups with visceral metastasis sites

表3 晚期 NSCLC 患者骨轉移灶進展 Cox 比例風險模型分析結果Tab.3 Results of Cox proportional risk model analysis of bone metastasis progression in advanced non-small cell lung cancer patients

四、骨轉移灶與原發灶差異表達基因 ( DEGs )篩選

本研究首先從 GEO 數據集 ( GSE76194 ) 中獲得了 4 對晚期肺癌骨轉移灶與原發灶的基因表達譜?；?R 統計軟件中 Limma 包的差異基因分析，獲得了樣本的基因表達矩陣，共鑒定出 20 188 個基因。使用P＜ 0.05 和 | Log2 ( FC ) ＞ 2 的標準進行篩選，本研究發現 938 個顯著差異表達的基因，其中376 個基因上調，562 個基因下調。差異表達 mRNA譜結果的表達水平以熱圖和火山圖的形式表達( 圖 5 )。

圖5 骨轉移灶及原發灶差異基因篩選 a：差異基因火山圖，位于坐標圖區域內的紅色和藍色點表示差異表達基因，而灰色點表示未差異表達的基因，橫軸表示 Log2 ( fold change )，縱軸表示-Log ( P value )，篩選標準為 | Log2( FC ) | ＞ 2 以及 P ＜ 0.05。藍色，下調基因；紅色，上調基因；DEG，差異表達基因。b：差異基因熱圖，顯示低 ( 藍色 ) 到高 ( 紅色 ) 基因表達水平在 NSCLC 骨轉移灶中具有不同的分布。通過基因進行聚類，每列頂部的條形圖顯示以下內容：藍綠色代表原發灶，橘紅色代表骨轉移灶Fig.5 Volcano plot ( a ) and heat map ( b )visualizing the screening of DEGs of GSE76194. For volcano plot ( a ), the horizontal axis represented Log2 ( fold change ), and the vertical axis showed the reliability of -Log ( P value ). The red and blue points falling within the region of interest in the plot represented the differentially expressed genes, while the grey dots represented genes that are not differentially expressed, defined by | Log2 ( FC ) | ＞ 2 and P ＜ 0.05. Blue, down expression; Red, up expression; DEG, differentially expressed gene. Heat map ( b ) illustrating lower ( blue ) to higher ( red ) gene expression levels with distinct profiles across NSCLC bone metastasis. Rows were clustered by genes. Bars at the top of each column indicated the following:Turquoise = parental; Flame = bone metastasis

五、骨轉移灶與原發灶耐藥性差異驗證

本研究采用 GESA 方法對 GSE76194 中獲得的基因表達矩陣進行富集分析，共得到 1 個顯著富集的上調表達通路以及 3 個顯著富集的下調表達通路 ( 圖 6a、b )。結果顯示，骨轉移灶中吉非替尼( Gefitinib ) 耐藥相關通路上調，達沙替尼 ( Dasatinib )藥物敏感性相關通路下調。

圖6 骨轉移灶與原發灶差異表達基因 GSEA 分析 a：GSEA 顯著富集的耐藥相關上調表達通路；b：GSEA 顯著富集的耐藥相關下調表達通路，篩選標準為 P ＜ 0.05 且 FDR ＜ 0.25，以及 | NES | ＞ 1Fig.6 GSEA analysis of differentially expressed genes between bone metastases and primary site a: GSEA significantly enriched drug-resistance-related up-regulated expression pathways;b: GSEA significantly enriched drugresistance-related down-regulated expression pathway. The criteria: P ＜0.05, FDR ＜ 0.25 and | NES | ＞ 1

討 論

一、NSCLC 骨轉移灶與內臟病灶反應性差異

本研究中晚期 NSCLC 患者骨轉移灶與內臟病灶全身藥物治療后，骨轉移灶優先進展率明顯高于內臟病灶，分別為 79.7% 以及 20.3% (P＜ 0.05 )。提示接受全身藥物治療時骨轉移灶對全身藥物的反應性相較于內臟病灶可能更差，骨轉移灶進展過程中發生骨骼相關事件的可能性也會更大[14]。既往 Schmid等[15]的研究也證實了骨轉移灶進展率較高的結果，但由于納入病例數較少，故未與內臟病灶做有效的統計學檢驗。而在 Yoneda 等[16]的研究中則指出，晚期 NSCLC 患者在使用免疫檢查點抑制劑治療時，骨轉移灶的存在是 PFS 和 OS 較差的獨立危險因素，提示骨轉移灶對全身藥物治療反應性相對較差。骨轉移患者中 SRE 的發生率較高，發生 SRE 的患者需接受放療、手術治療在內的局部治療，且一旦發生會嚴重影響患者的生活質量和生存率，可能導致伴有骨轉移的晚期 NSCLC 患者預后更差。

二、全身藥物治療反應性差異相關因素

伴有 EGFR 突變的晚期肺癌患者骨轉移灶全身藥物治療反應性更差。本研究的單因素及多因素 Logistic回歸分析結果顯示，EGFR 突變與全身藥物治療反應性差異高度相關 (P= 0.009 )，OR為 6.76，95% 置信區間為 1.60～28.60。這與既往研究是相符的，Chen等[17]對伴有 EGFR 突變的晚期 NSCLC 患者的單中心回顧分析研究結果顯示，骨轉移組患者接受 EGFRTKI 治療的 PFS 和 OS 更短，骨轉移為靶向治療預后差的獨立危險，并且單用 EGFR-TKI 治療骨轉移灶的進展時間較靶向治療聯合化療的短[18]。因此，對于晚期 NSCLC 患者應積極進行基因檢測，尤其是對于全身藥物治療后骨轉移灶進展的患者，得知患者常見驅動基因的突變狀態可以預測患者預后并指導綜合治療方案的制訂。

晚期 NSCLC 患者腹腔器官轉移灶相對于骨轉移灶對全身藥物治療反應性更差。本研究 Logistic 回歸結果提示，全身藥物治療前有腹腔器官轉移時骨轉移灶優先轉移風險更低 (P= 0.001 )，OR為 0.078，95% 置信區間為 0.017～0.35。既往有研究提示肝轉移是靶向治療預后差獨立危險因素[19-20]，提示腹腔器官轉移灶，尤其是肝轉移灶相較于骨轉移灶對全身藥物治療的反應性可能更差。當患者出現上述部位轉移后須密切監測病灶變化，及時調整藥物治療方案，甚至可采用聯合用藥的方式控制病灶進展。至于單因素 Logistic 回歸中P＜ 0.05 但未納入回歸方程的因素，包括放療及藥物治療前是否有內臟轉移，這些也可能是影響全身藥物治療反應性差異的相關因素，在之后的研究中應著重關注這些因素與病灶進展的關系。

三、骨轉移灶優先進展的影響因素

有吸煙史的晚期 NSCLC 患者更可能發生骨轉移灶進展。眾所周知，吸煙是罹患肺癌的高危因素，也與 NSCLC 患者不良預后相關。本研究結果顯示吸煙可能降低骨轉移灶對全身藥物治療的反應性，HR( 95%CI) 是 4.4 ( 1.67～11.59 )，以致患者骨轉移灶進展的風險更大[21]。因此，須密切關注有吸煙史的NSCLC 患者，及時進行骨骼相關的影像學檢查，及時更換用藥方案或采用聯合用藥。

除吸煙史外，僅靶向藥物治療的晚期 NSCLC 患者可能發生骨轉移灶。本研究結果表明僅靶向治療是單純化療后骨轉移灶進展風險的 2.94 倍，95% 置信區間為 1.37～6.29，如表 3 所示。有研究證實發生骨轉移，提示靶向治療晚期 NSCLC 患者預后較差[17]，也有研究顯示對于晚期 NSCLC 患者聯合治療比單一治療反應性更好[22]。這提示目前應用于臨床的靶向藥物可能對肺癌骨轉移灶的治療療效較差，應積極尋找新的治療靶點，甚至采用聯合治療方式，降低骨轉移灶的進展率，從而延長晚期肺癌患者的總生存時間。

四、骨轉移灶耐藥性

為進一步驗證骨轉移灶與內臟病灶，對全身藥物治療反應性的差異，并尋找 NSCLC 骨轉移新的治療靶點。本研究進行了差異表達基因的篩選，結果顯示骨轉移灶中有與全身藥物治療耐藥相關的表達通路上調。這從另一方面證明骨轉移灶與內臟病灶對藥物的反應存在差異。

EGFR 是公認的 NSCLC 的原癌驅動基因，在首次發現其致癌突變后，EGFR 酪氨酸激酶抑制劑( tyrosine kinase inhibitors，TKI ) 成為了 EGFR 突變陽性晚期患者的一線療法[23]。既往的研究顯示 EGFR過表達能夠促進肺癌細胞增殖、侵襲遷移[3]，從而促使肺癌發生與轉移，下調其表達可以明顯抑制腫瘤細胞的增殖，起到抑癌的作用。本研究結果顯示NSCLC 骨轉移灶與原發灶相比 EGFR 表達下調，這與達沙替尼藥物敏感性下降有關。骨轉移灶有其獨有的間質細胞及免疫微環境，腫瘤相關成纖維細胞可以分泌多種炎癥因子及生長因子參與腫瘤細胞增殖、凋亡的調控中[24-25]，這個過程可能形成旁調節通路，從而誘導骨轉移灶腫瘤細胞耐藥性的產生，導致其對全身藥物治療的反應更差。引起反應性的差異具體機制仍須進一步研究。

五、本研究的局限性

本研究存在的局限性：( 1 ) 樣本量只有 74 例相對較小，可能會導致預測模型過擬合；( 2 ) 作為回顧性研究，納入患者的臨床特征、長期隨訪結果很難全面獲得；( 3 ) 患者藥物治療方案具有異質性，樣本采集時間 2010-2021年，患者接受的藥物治療方案可能受治療時間影響；( 4 ) 本研究未能收集到納入患者的基因表達數據，無法直接驗證耐藥后骨轉移灶與原發灶基因表達的差異。

總之，晚期 NSCLC 患者骨轉移灶與內臟病灶對全身藥物治療反應存在差異，骨轉移灶存在耐藥相關通路的表達上調，伴有 EGFR 突變的患者骨轉移灶較腹腔外內臟病灶對全身藥物治療反應性更差，建議對全身藥物治療反應性差的 NSCLC 骨轉移患者采取積極的局部治療。