一例耳聾患者及其家庭成員的基因突變分析

閆蘭竹,林 靜,孫曉彤,李東坤,侯兵兵,喬順義

耳聾是人類最常見的先天缺陷之一,在新生兒中發生率約為1‰,其中50%～70%是由遺傳因素引起的[1,2],可導致非綜合征型耳聾(約70%,僅聽力損失)與綜合征型耳聾(約30%,聽力損失伴其他組織器官病變)[3]。在我國最常見的非綜合征型耳聾遺傳基因主要有GJB2、SLC26A4(PDS)、GJB3與mtDNA[4]。GJB2基因主要引起先天性重度、極重度感音神經性耳聾;SLC26A4基因主要引起大前庭導水管綜合征(EVAS);GJB3是中國首個克隆的遺傳疾病基因,主要引起后天高頻感音神經性耳聾[2,5];mtDNA為母系遺傳基因[6],其中線粒體12SrRNA與tRNA基因已被證明是與聽力損失相關的突變熱點[7,8],12SrRNA表現為使用氨基糖苷類藥物不當時發生聽力損失,稱為“藥物致聾”,tRNA表現為遲發性耳聾[5]。我院通過耳聾易感基因檢測發現一例mtDNA 7445A>G基因位點突變引起的聽力障礙病例,并對其家庭成員進行檢測,均證實為母系遺傳。

1 病例報告

1.1 研究對象 先證者(成員1),男,32歲,因聽力障礙于2023年5月來我院進行耳聾易感基因檢測,其家庭成員包括先證者父親(成員2)、母親(成員3)、弟弟(成員4)。所有受檢人員均簽署了知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 血液基因組DNA(gDNA)的提取 采集待檢測人員外周靜脈全血2 ml,放置于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管內,按照離心柱型血液gDNA提取試劑盒(潮州凱普生物化學有限公司)說明書操作流程提取全血gDNA。

1.2.2 耳聾基因檢測 采用聚合酶鏈式反應(PCR)對目的DNA進行擴增,完成后將擴增產物進行加熱解鏈使其成為單鏈DNA,然后嚴格按照DNA雜交試劑盒(潮州凱普生物化學有限公司)說明書,利用低密度基因芯片+導流雜交技術在醫用核酸分子雜交儀上,對4個遺傳性耳聾相關基因的13個突變位點(GJB2基因235delC、299-300delAT、176-191del16、35delG、155delTCTG,mtDNA基因1494C>T、1555A>G、7445A>G、12201T>C,GJB3基因538C>T和SLC26A4基因IVS7-2A>G、2168A>G、1229C>T)進行檢測。經過孵育、雜交、化學顯色反應后,通過斑點顏色改變可以得到清晰可見的檢測結果。

1.2.3 Sanger測序驗證 將所有待檢測樣本寄送至廣州凱普醫學檢驗所對可疑突變位點進行Sanger雙脫氧鏈終止法測序驗證。

1.3 結果

1.3.1 基因檢測結果 該家庭成員中,先證者父親未檢測到檢驗范圍內的耳聾基因突變,先證者為mtDNA 7445A>G均質突變,先證者母親及弟弟均為mtDNA 7445A>G異質突變(圖1)。

圖1 mtDNA 7445A>G基因位點突變患者及其家人基因檢測結果A.先證者父親mtDNA 7445A>G未見突變;B.先證者mtDNA 7445A>G均質突變;C.先證者母親mtDNA 7445A>G異質突變;D.先證者弟弟mtDNA 7445A>G異質突變。

1.3.2 基因測序結果 對候選基因突變位點進行測序驗證,顯示與基因檢測結果一致(圖2)。

圖2 mtDNA 7445A>G基因位點突變患者及其家人測序結果(突變位置使用紅框標注)A.先證者父親mtDNA 7445A>G未見突變;B.先證者mtDNA 7445A>G均質突變;C.先證者母親mtDNA 7445A>G異質突變;D.先證者弟弟mtDNA 7445A>G異質突變。

2 討 論

聽力喪失是一種常見的交流障礙,全球每1000個活產新生兒中就有1～3個受到影響[7]。世界衛生組織調查數據顯示,在3.6億聽力喪失的患者中,有3200萬是兒童[7]。目前,新生兒聽力篩查技術在我國已廣泛開展,由于可能會對遲發性聽力損失患兒漏診,且不能對耳聾進行病因學診斷,因而具有一定的局限性[9]。本文中采用的耳聾易感基因變異篩查技術,不但能夠發現先天性遺傳性耳聾患者,更重要的是能及早發現常規物理聽力篩查漏檢的藥物敏感性和遲發性耳聾基因攜帶者,同時對耳聾進行遺傳學診斷,為患者家庭提供遺傳咨詢、治療決策和預后判斷。

耳聾易感基因檢測結果顯示該患者為線粒體DNA 7445A>G位點突變。線粒體DNA為母系遺傳基因,我們對該患者家庭成員進行檢測證實并進一步研究。據文獻[10]報道,線粒體DNA容易受到氧自由基的攻擊,并且由于缺少組蛋白保護與有效的自我修復機制,因而突變率高。完整的線粒體DNA測序可以檢測致病性突變,目前報道的線粒體DNA常見突變基因有12SrRNA與tRNA[7,8]。本研究家庭的突變位點7445A>G為線粒體tRNA突變,位于tRNASer(UCN)轉錄前體3’末端[11,12],目前發現該位點的突變方式除7445A>G外,還有7445A>C和7445A>T 兩種[11]。7445A>G突變可降低tRNASer(UCN)穩定性,導致線粒體tRNA代謝功能衰竭,影響線粒體內多肽合成以及ATP產生,改變線粒體呼吸作用和功能[7,8],逐漸引起毛細胞萎縮甚至凋亡,從而造成非綜合征型耳聾[13];同時7445A>G突變可導致讀取相鄰細胞色素氧化酶基因CO1的終止密碼子AGA,從而向多肽的C-末端添加3個氨基酸(Lys-Gln-Lys)[7,8,14],輕鏈RNA前體在加工過程中產生缺陷[8],使細胞色素C氧化酶肽鏈延長,改變細胞色素C氧化酶空間結構與生理功能,最終導致耳聾[12]。7445A>C、7445A>T 突變的致病機制可能與7445A>G相似[11,14]。

線粒體DNA突變型與野生型共存的現象稱為線粒體DNA異質性[10,15]。研究發現,異質性可以促進腫瘤的生長,并與衰老密切相關[16]。本病例僅存在線粒體DNA突變型,且為均質突變;患者母親及弟弟線粒體DNA突變型與野生型共存,為異質突變。在異質性細胞中,致病性線粒體DNA突變的表型由突變型和野生型基因組的比例決定,如果比例達到閾值,則導致疾病的發生[10,17],這可能為該患者出現臨床癥狀的原因之一。而該患者與其母親、弟弟的基因型不同,可能有多方面原因。據研究,線粒體DNA與核DNA不同,是伴隨細胞質分裂偶然地隨機不等地分配到子細胞中的[18],如果母細胞中存在異質性變異,即使是突變水平低至0.15%的異質性變異,在人類中也是具有遺傳性的。通過隨機遺傳漂變,子細胞獲得的突變基因比例是不同的,因而可呈現出不同的異質性水平,這種隨機分配導致的線粒體DNA異質性變化的過程稱為復制分離[19]。隨后,子細胞作為新的母細胞進行分裂,從而擴大這種異質性水平范圍[20]。異質性水平可以在同一家族不同個體、同一個體不同器官甚至同一器官或組織不同細胞之間有所不同,也就是說具有相同核DNA的細胞或者個體,如一卵雙生,其細胞質基因型可以不同,從而表型也有所差異[21]。在人類中,線粒體DNA通常僅通過母系傳遞給后代,具有低水平有害異質性線粒體DNA突變的臨床無癥狀女性可能將其致病突變傳遞給所有后代,導致線粒體DNA功能障礙和疾病[15,22]。受影響后代臨床癥狀的嚴重程度通常與線粒體DNA異質性水平(即有害突變的百分比)有關[15]。

目前認為,來自同一個母本的不同后代之間基因異質性水平的差異發生在初級卵母細胞形成之前,在卵母細胞發育早期,每個細胞的線粒體DNA拷貝數下降到相對較低的值,成為線粒體DNA遺傳的瓶頸,這種對線粒體基因拷貝數量的限制導致了快速遺傳漂變,使得等位基因的頻率發生劇烈變化,從而造成母體與子代之間異質性水平不同[23]。對已知致病性線粒體DNA突變家族的研究表明,突變水平在母親和后代之間可能有很大的變化[16,21]。遺傳漂變理論預測,隨著母體突變水平的降低,后代突變水平可能會下降,這種非常低水平異質突變變異的減少可能使它們在幾代間更穩定[16]。遺傳瓶頸應該作為限制具有非常低突變水平的線粒體DNA突變遺傳的障礙,因為這些低水平突變通過瓶頸到達后代的概率應該很低。線粒體DNA突變是否在母親和孩子之間的線粒體瓶頸中存活下來,這是理解線粒體DNA變異,包括致病變異,如何在家族中建立的重要關鍵。原則上,線粒體DNA從母體遺傳到后代的瓶頸可以有效地過濾掉低水平突變[16],也就是說對于一個有害的異質體,嚴重的遺傳瓶頸可能會在子代突然轉化為良性(低頻率)的致病水平[18]。但是除遺傳漂變外,有些低水平的線粒體DNA突變能夠通過“主動選擇”傳遞給子代,這種機制不僅能使突變的線粒體DNA有效通過遺傳瓶頸,還能使致病的線粒體DNA突變逃避自身修復機制[20]。即使是低水平線粒體DNA的異質性也是至關重要的,因為每一個從頭開始的線粒體DNA突變都必須從非常低的水平開始。由于從母親傳遞到后代的線粒體DNA分子數量較少,遺傳非常低水平的線粒體DNA突變的能力似乎確實相當有限。有證據表明,非常低水平的線粒體DNA突變的母體遺傳,下降到0.15%的突變水平,確實發生在普通人群中。有可能有很多低水平的線粒體DNA突變,以至于即使有很深的瓶頸,一些變異仍然由后代遺傳[16]。另外,有研究表明,母親受孕年齡和自身異質性水平會對子代線粒體DNA異質性水平有一定影響,導致突變頻率在母親和孩子之間發生顯著變化并致病[18]。

突變本身不足以產生臨床表型,包括核背景、環境因素和線粒體單倍型在內的其他修飾因素對突變的表型表現也是必要的[1,7],因而線粒體DNA突變導致的疾病在個體家系和不同家系中會有所不同[1]。本研究家系家庭成員少導致樣本量小,故存在一定的局限性,我們將擴大樣本量,對耳聾基因線粒體DNA的遺傳與致病機制進一步研究。