生物鐘核心基因多態性與缺血性腦卒中疾病的關聯性

施海媛， 譚沙一君， 李路明， 劉如， 劉遜， 何明利

急性缺血性卒中發病時間具有一定的晝夜節律特點，如常見卒中發病形式有醒后卒中，急性缺血性卒中發病高峰時間為上午的6∶00―12∶00，占24 h全部時段的79%［1］。隨著對晝夜節律現象的深入研究，我們了解到地球上生物體表現的晝夜節律特性，其內在機制為生物鐘及維持生物鐘運行的生物鐘基因［2，3］，那么，是否可以從生物鐘基因的角度來揭示缺血性腦卒中的發病規律呢？另一方面，生物鐘基因及其單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）與腦卒中的諸多危險因素如高血壓、糖尿病、血脂異常等密切相關［4-7］，既然生物鐘基因及其SNPs與缺血性卒中的多項致病危險因素相關，且急性缺血性腦卒中發病本身具有一定的節律特性，那么，生物鐘基因與缺血性腦卒中本身是否有直接的聯系呢？課題組前期研究確定了與缺血性卒中密切相關的生物鐘基因位點為ARNTLrs6486122、PER1rs2253820，本文旨在進一步探索ARNTLrs6486122、PER1rs2253820與缺血性卒中發病是否具有關聯性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 研究對象資料 收集2021年9月―2022年9月就診于江蘇省連云港市第一人民醫院的確診為缺血性卒中，且排除出血性卒中及嚴重肝腎功能損害的1 012例患者作為缺血性卒中組。將同期我院住院患者未患有缺血性卒中的人群及體檢中心接受檢查的共958例患者作為對照組，通過病史采集及實驗室檢查收集所有研究對象人口學資料（年齡和性別）、缺血性卒中常見危險因素（高血壓、糖尿病、血脂異常），入院時檢測指標（身高、體重、血壓、實驗室檢查）等。

1.1.2 SNPs位點信息ARNTLrs6486122、PER1rs2253820SNP位點信息（見表1）。

表1 SNPs位點基本信息

1.2 SNPs基因型檢測

采集研究對象的外周靜脈血1 ml于EDTA-K2抗凝管，保存于-80 ℃冰箱，待樣本全部收集齊后統一檢測。使用DNA試劑盒提取DNA。使用SNaP-shot技術進行基因型檢測，首先進行引物設計合成，預擴增包含SNP位點的片段后，去除多余的預擴增引物及dNTP，隨后進行延伸反應，延伸引物對純化后的預擴增產物模板，進行單堿基延續。反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環；最后72 ℃延伸7 min，最終上機檢測并進行數據分析（見表2）。

表2 預擴增引物

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 研究對象納入情況及基本特征

采用病例對照研究設計納入缺血性卒中組1 012例，對照人群組958例，在兩組比較中，卒中組的年齡、性別、是否患有高血壓、糖尿病、血脂異常以及入院后測量的相關指標（收縮壓、舒張壓、空腹血糖、甘油三酯、總膽固醇）均較對照組有顯著性差異（P< 0.001）（見表3）。

表3 研究對象的基本特征

2.2 SNPs基因型分布情況

2.2.1 SNPs基因型譜檢測圖 使用SNaPshot技術進行基因型檢測，我們發現PER1rs2253820、ARNTLrs6486122 SNPs位點的具體基因型，rs2253820（T>C）分別有TT、CT、CC 3種基因型，rs6486122（C>T）分別有CC、CT、TT 3種基因型（見圖1）。

圖1 基因型譜檢測展示圖

2.2.2 研究對象SNPs的基因型分布及遺傳平衡檢驗 本研究中ARNTL-rs 6486122、PER1-rs 2253820兩個位點檢出率為100%，對于ARNTL-rs 6486122位點，檢出CC、CT、TT 3種基因型，分別在卒中組有387例，520例，105例，在兩組間分布具有統計學差異（P=0.036）；PER1-rs 2253820位點檢測出TT、CT、CC 3種基因型，分別在卒中組分布349例，543例，120例，在對照組和卒中組間分布具有顯著性差異（P<0.001）。對于對照組進行哈迪溫伯格平衡（Hardy-Weinberg Equilibrium，HWE）檢驗，兩個位點檢出基因型均符合哈迪溫伯格平衡（見表4）。

表4 研究對象基因型分布及HWE檢驗

2.2.3 基于不同危險因素SNPs的基因型分布 基于卒中人群不同危險因素，我們進一步統計了ARNTL-rs 6486122，PER1-rs 2253820的3種不同基因型的分布情況（見表5、表6），對于ARNTL基因的rs 6486122位點，不同危險因素下，3種基因型分布均無統計學差異（均為P> 0.05）。對于PER1基因rs 2253820位點，年齡、高血壓病史以及SBP值在3種基因型分布中具有統計學差異（P< 0.05）。

表5 基于不同危險因素下的rs 6486122基因型分布情況

2.3 SNPs與缺血性卒中的關聯性

在對照組和卒中組危險因素比較中，經多因素回歸分析后，年齡作為缺血性腦卒中的危險因素，較對照組比較具有顯著統計學差異，隨著年齡增長腦卒中的患病風險顯著增加（P<0.001，OR=6.704，95%CI5.188~8.644）；高血壓患者較非高血壓患者，患缺血性腦卒中的風險增加2.565倍（P<0.001，OR=2.565，95%CI1.971~3.338）；血脂異?；颊咻^血脂正常人群，患缺血性腦卒中的風險增加1.700倍（P=0.001，OR=1.700，95%CI1.230~2.348）；收縮壓及舒張壓增高，同樣也會增加卒中的患病風險。對于PER1基因的rs2253820位點，以野生純合子TT基因型為參比組，CT基因型，CC基因型以及顯性遺傳模型在增加腦卒中的發病風險方面均具有統計學差異（CT vs TT：P=0.001，OR=1.552，95%CI1.194~2.018；CC vs TT：P=0.024，OR=1.295，95%CI1.035~1.621；顯性模型：P=0.001，OR=1.563， 95%CI1.215~2.012）。對于ARNTL基因的rs6486122位點，經校正后，各基因型與遺傳模型與缺血性腦卒中發病關聯性無統計學意義（P>0.05）（見表7）。

表7 多因素Logistic回歸分析

3 討論

缺血性腦卒中是常見的腦血管疾病，多表現有不同程度的神經功能缺損癥狀，目前對于缺血性腦卒中的研究多從控制危險因素入手，達到減少卒中發生的可能性。隨著預防卒中的防治任務日益加重，我們對于卒中的研究不僅僅局限于外因，越來越多從內在基因遺傳的角度尋找預防、診治缺血性腦卒中的新靶點。

地球上的生命體多表現出一定的晝夜節律，這與外部環境變化與機體內部生物鐘基因的調節密不可分。越來越多研究證明，當人體外部環境發生變化或其他原因造成生物鐘基因的改變，生物節律發生紊亂，則會大大增加人類罹患心腦血管疾病的風險［5］。多項研究證明，生物鐘基因SNPs與高血壓［8］、血脂異常［9］、糖尿?。?0］等的發病風險有關。而生物鐘基因SNPs與缺血性腦卒中的疾病直接關聯性卻少有研究。

本研究發現，PER1rs2253820位點突變可能與缺血性卒中的發病有關，而ARNTLrs 6486122位點基因型及遺傳模型比較在經多因素校正后，與缺血性腦卒中發病無明顯統計學意義。既往研究表明，PER1基因是生物鐘基因的核心基因［11］，本課題組前期研究通過對短暫性大腦中動脈閉塞的自發性高血壓大鼠的PER1rs2253820位點監測，rs2253820通過CK1加速PER1磷酸化，在敲除rs2253820位點后，減弱了晝夜節律的干擾，從而抑制生物鐘基因BMAL1和CLOCK的轉錄，最終加重的自發性高血壓大鼠的血壓變異，這說明rs2253820位點突變與卒中后血壓變異有一定的關聯性［12］。一項針對漢族人群的病例對照研究顯示，PER1rs2253820 的遺傳多態性和晝夜節律紊亂可能增加另一種神經退行性疾病——帕金森病的發病風險（P=5.30×10-6，OR=1.31）［13］。另外，在一項對自閉癥致病因素的研究中，Nicholas等在11個生物鐘基因的多個SNPs中發現PER1rs2253820與自閉癥存在顯著關聯性（P<0.05）［14］。由此可見，PER1rs2253820位點突變導致晝夜節律紊亂與多種疾病相關聯，本文進一步探索其與缺血性腦卒中的關聯性。

一項關于基因多態性與缺血性腦卒中的病例對照研究發現MMP2rs243849位點與缺血性卒中發病風險顯著相關（P=0.005）［15］。本文同樣采用病例對照的研究方式，經過多因素Logistic回歸分析后發現，以PER1rs2253820的野生純合子TT基因型為參照，CT基因型、CC基因型以及顯性遺傳模型均具有統計學差異，突變的C等位基因可能增加腦卒中的發病風險（見表7）。同時，經多因素校正后，年齡、高血壓、血糖升高等指標依舊是缺血性腦卒中的獨立危險因素，這也與既往多項研究結果一致［4，16］。本研究一方面證實了既往被大家所熟知的危險因素依舊是缺血性腦卒中的發病危險因素；另一方面新發現了生物鐘基因多態性PER1rs2253820與缺血性腦卒中的發病密切相關，這為進一步研究缺血性卒中的發病、診斷及早期預防，攻克缺血性腦卒中這一難題提供了新的解題思路。

本研究存在一些不足，比如研究對象局限為中國漢族地方人群，考慮到遺傳背景及環境變異等情況，研究結論需進一步大樣本量和多地區人類種族進行驗證。另外，缺血性卒中的發病及其影響因素多樣且復雜，盡管進行了多重因素校正，盡可能排除了干預因素影響，然其研究結論仍需更嚴謹的實驗加以論證。

倫理學聲明：本研究方案經由連云港市第一人民醫院倫理委員會審批（批號：KY-20210903001-01），在中國臨床試驗注冊中心注冊（注冊號：ChiCTR2200064854），患者均簽署知情同意書。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：施海媛負責設計論文框架，起草論文；施海媛、譚沙一君負責實驗操作，研究過程的實施；施海媛、李路明、劉如，劉遜負責數據收集，統計學分析、繪制圖表；施海媛負責論文修改；何明利負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。