基于LC-MS/MS 技術的水蛭配方顆粒中7 種堿基和核苷成分分析方法的建立

姜 俊 程春雷 楊 昊

（山東省食品藥品檢驗研究院（國家藥品監督管理局仿制藥研究與評價重點實驗室），濟南，250000）

水蛭為水蛭科動物螞蝗（WhitmaniapigraWhitman）、水蛭（HirudonipponicaWhitman）或柳葉螞蝗（WhitmaniaAcranulataWhitman）的干燥全體，具有破血通經、逐瘀消癥等功效，臨床上具有很高的藥用價值[1].針對水蛭藥材，采用液相色譜法對其進行黃嘌呤、尿苷、尿嘧啶、次黃嘌呤中1—4 種堿基及核苷成分的含量測定已有相關文獻報道[2?4].堿基是嘌呤和嘧啶的衍生物，是合成核苷、核苷酸和核酸的基本組成單位.核苷是是核酸合成的前體，具有保護神經、抗病毒和抗菌等生物活性.李桃運用多種色譜分離手段從水蛭中提取并分離鑒定出38 個化合物[5]，荊文光等從水蛭甲醇提取物中分離鑒定了18 個化合物[6]，除上述4 種成分外，還包含其他幾種成分，如腺苷、腺嘌呤、次黃嘌呤苷（肌苷），但未均建立此類成分的含量測定方法.

水蛭配方顆粒是由水蛭飲片經水加熱提取、濃縮、干燥、制粒而成的一種顆粒.目前，水蛭配方顆粒暫未出臺相應的國家藥品標準，廣東、山東、湖南等地公布了水蛭配方顆粒的省級質量標準，這些標準中含量測定項主要涉及抗凝血活性、水蛭胺C、次黃嘌呤的測定.除此之外，未見水蛭配方顆粒中多種堿基和核苷成分同時測定的相關報道.堿基和核苷化合物絕大部分是強極性的小分子，僅依靠傳統的疏水作用機制難以進行較好的色譜保留，該類化合物也一直是分析技術的難點.本試驗通過多重保留機制的液相色譜-質譜聯用技術，建立同時快速測定水蛭配方顆粒中7 種堿基和核苷類成分的含量方法，該方法具有分析快速、準確、靈敏度高的特點，可為水蛭配方顆粒甚至水蛭藥材的質量評價提供依據.

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

試劑：尿嘧啶、次黃嘌呤、腺苷、腺嘌呤、肌苷對照品（上海源葉生物科技有限公司），黃嘌呤對照品（中國食品藥品檢定研究院），尿苷對照品（上海安譜實驗科技有限公司），純度均大于98%.水蛭配方顆粒來源于廣東一方制藥有限公司，每袋1.5 g，每1 g 配方顆粒相當于2 g 藥材.

儀器：超高效液相色譜儀Nexera X2 與三重四極桿質譜LCMS-8050 聯用系統（島津，日本）.

1.2 樣品的制備

混合標準溶液的制備：精密稱取7 種堿基和核苷對照品各適量，除黃嘌呤用20 mmol·L?1氫氧化鈉溶解外，其余均采用10%甲醇溶液溶解，最終用10%甲醇溶液配制成系列濃度的混合標準溶液，待上機分析.

樣品前處理：取水蛭配方顆粒5 袋，研細，稱取約0.1g（精確到0.0001g），加入10%的甲醇溶液100 mL，渦旋混勻1 min，50 ℃超聲30 min，4000 r·min?1離心10 min，上清液用0.22 μm 的尼龍濾膜濾過，取續濾液即得.樣品的稀釋：精密量取制備好的樣品續濾液1 mL，用10%甲醇溶液定量稀釋至10 mL.

1.3 實驗條件

液相色譜條件：色譜柱為Discovery?HS F5-3（150 mm×2.1 mm,3 μm），流動相：A 為0.15%甲酸水溶液，B 為甲醇；流速0.35 mL·min?1，梯度洗脫，0—1min，2%—5%B，1—5 min，5%B—50%B，5—5.5 min，50%B—90%B，5.5—7 min，90%B，7.01—10 min，2%B；柱溫40 ℃，進樣體積：1 μL.

質譜條件：ESI 正負離子模式同時監測；接口電壓：+0.5 kV（正離子），?0.5 KV（負離子）；霧化氣流速：氮氣3.0 L·min?1；加熱氣流速：空氣15 L·min?1；干燥氣流速：氮氣5 L·min?1；脫溶劑管溫度：150 °C；加熱模塊溫度：300 °C；離子源接口溫度：350 °C；掃描模式：多反應監測（MRM）；駐留時間：25 ms；MRM 參數見表1.

表1 7 種堿基和核苷的MRM 參數列表Table 1 MRM parameters for 7 nucleobases and nucleosides

2 結果與討論

2.1 樣品前處理條件的選擇

依據待測化合物的溶解性及參考相關文獻[4，7]，本實驗嘗試了使用水、10%甲醇、70%甲醇、0.1%甲酸及10 mmol·L?1氫氧化鈉在50 ℃下進行超聲提取30 min，考察不同溶劑的提取效率.結果顯示：70%甲醇、0.1%甲酸及10 mmol·L?1氫氧化鈉提取條件下，肌苷的峰面積偏低，且70%甲醇提取條件下色譜峰會展寬.水和10%甲醇對大部分化合物的提取效率相當，但10%甲醇對腺苷的提取效率要優于水.綜合考慮，確定樣品溶液的制備方式為10%甲醇50 ℃條件下超聲30 min.

2.2 分析條件的優化

本實驗曾比較了不同流動相系統對色譜峰及質譜響應的影響，如乙腈－0.02%甲酸和1 mmol·L?1乙酸銨水溶液、乙腈－0.1%甲酸水溶液、甲醇－0.1%甲酸水溶液、甲醇－0.15%甲酸水溶液.最后確定采用甲醇－0.15%甲酸水溶液的流動相體系，該體系下各化合物色譜保留較好且質譜信號較強.

7 種待測堿基和核苷化合物的屬于極性較強的化合物，傳統反相色譜保留效果欠佳.董萌等嘗試用親水色譜對食品中的堿基、核苷和核苷酸類物質進行色譜保留[8].親水色譜對強極性化合物保留較好，但要得到較好的峰形和重復性，方法開發的難度往往比普通反相色譜的難度要大.本實驗對比了Discovery?HS F5-3、Shim-pack GIST C18 和ShimNex UP C18 色譜柱對分析測試的影響.結果顯示Discovery?HS F5-3 色譜柱對待測化合物的保留最好，且質譜響應信號相對更高.Discovery?HS F5-3 是一款在硅膠基質上鍵合了五氟苯基的色譜柱，提供了疏水作用、氫鍵作用、離子作用等多重保留機制，對強極性化合物的保留和異構體的分離優于常規C18 柱.

2.3 精密度試驗

將10 ng·mL?1的混合對照品溶液連續進樣6次，尿苷、肌苷、腺苷、次黃嘌呤、腺嘌呤、尿嘧啶和黃嘌呤7 種化合物測得峰面積的RSD 分別為4.50%、5.83%、1.84%、3.35%、4.27%、2.08%、3.54%，表明精密度良好.

2.4 線性范圍和靈敏度

取系列濃度的混合標準溶液上機測定，以對照品濃度為橫坐標（X）、峰面積為縱坐標（Y）繪制校準曲線，得到7 種堿基和核苷的線性方程、判定系數.以各化合物信噪比（S/N）約為3時計算對應的濃度為檢出限（LOD），各對照品信噪比（S/N）約為10 時對應的濃度為定量限（LOQ），結果如表2 所示.由表2 可知，7 種堿基和核苷在相應的濃度范圍內具有良好的線性關系，判定系數（R2）≥0.996，檢出限在0.13—1.18 μg·g?1范圍內，定量限在0.43—3.94 μg·g?1范圍內，該方法靈敏度較高.

表2 7種堿基和核苷的線性范圍及靈敏度Table 2 Linear range and sensitivity of 7 nucleobases and nucleosides

2.5 加樣回收率試驗

取“1.3”項下樣品溶液上機測定，以外標法計算7 種堿基和核苷的含量.尿苷、肌苷、腺苷、次黃嘌呤、腺嘌呤、尿嘧啶和黃嘌呤的含量分別為41.42、7.11、1.24、314.87、4.89、55.83、53.95 μg·g?1.本品中尿苷、次黃嘌呤、尿嘧啶和黃嘌呤的含量相對較高，肌苷、腺苷和腺嘌呤有檢出，但含量較低.另精密稱取已測知含量的水蛭配方顆粒約0.1g，精密加入適量的對照品儲備液，按“1.3”項方法制成加樣回收樣品溶液，平行制備6 份.進行次黃嘌呤回收率測試時，將以上加樣回收樣品溶液稀釋10 倍上機進行測定，外標法計算平均回收率，結果見表3.7 種堿基和核苷的平均回收率在87.09%—105.81%之間，RSD%在1.35%—4.70%之間，表明方法的準確性高.

表3 7種堿基和核苷的加樣回收率（n=6）Table 3 The recovery data of 7 nucleobases and nucleosides

續表3

2.6 殘留實驗

高濃度混合標準溶液（1000 ng·mL?1）分析完成后，進樣10%甲醇試劑空白，考察殘留情況.結果表明，7 種堿基和核苷化合物檢測通道中均無明顯目標化合物干擾.

3 結論

本文建立了一種使用島津超高效液相色譜儀Nexera X2 和三重四極桿質譜儀LCMS-8050 聯用測定水蛭配方顆粒中7 種堿基和核苷成分的分析方法.該方法分析速度快，重復性好，靈敏度和準確度較高，適合水蛭配方顆粒中堿基和核苷類化合物的快速定量檢測，可為水蛭配方顆粒的質量評價提供參考.