飲用水中高分子量消毒副產物的檢測識別方法＊

韓亮亮 趙佳焱 李夢媛 董慧峪 楚文海 周 慶 施 鵬 潘 旸**

（1.污染控制與資源化研究國家重點實驗室，南京大學環境學院，南京，210023；2.中國科學院飲用水科學與技術重點實驗室，中國科學院生態環境研究中心，北京，100085；3.污染控制與資源化研究國家重點實驗室，同濟大學環境科學與工程學院，上海，200092）

飲用水消毒始于20 世紀初[1]，它能有效殺滅水中的微生物病原體,大大降低了人們因飲水而感染痢疾、霍亂等水傳播疾病而致死的幾率,是人類公共衛生領域的一次重大突破.然而，在飲用水消毒工藝中，氯、氯胺等化學消毒劑可與水源水中的天然有機物（NOM）反應生成消毒副產物（DBPs）[2?4].毒理學和流行病學研究已經證明，飲用水DBPs 具有細胞毒性和遺傳毒性，并且與癌癥、流產和出生缺陷等風險呈正相關[5?8].盡管研究人員已在飲用水中發現700 多種DBPs[9]，但已知DBPs 均為分子量小于800 Da 的低分子量DBPs，仍有超過50%的DBPs 處于未知狀態[10?11].Kopfler 等[12]通過超濾實驗證明了高分子量DBPs 的存在，且沙門氏菌突變試驗表明DBPs 中高分子量組分有顯著的致突變作用，從而證實了高分子量DBPs 的生物毒性.Zhang 等[13?14]研究發現，高分子量氯代DBPs 的平均分子量約為2000 Da 且分子量分布高度分散.由此可見，高分子量DBPs 是DBPs 的重要組成部分，亟需對其進行進一步探索.

目前對飲用水DBPs 的檢測識別主要集中于小分子DBPs，而對單個高分子量DBPs 的檢測與識別還非常缺乏.氣相色譜/質譜法（GC/MS）是目前對于DBPs 常用的檢測方法，但是GC/MS 不適合鑒定極性/親水/非揮發性衍生物，尤其不適合鑒定高分子量化合物[15].而液相色譜/質譜法（LC/MS）對無機鹽耐受程度低[16]，并且電噴霧電離等電離方式會產生多電荷離子[17]，這又會給未知DBPs 的識別帶來很大挑戰.因此，研究高分子量DBPs 的關鍵是選擇合適的檢測方法.基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（MALDI-TOF MS）是測定高分子量物質的摩爾質量和摩爾質量分布的最有用的分析技術之一[18?20]，并因其速度快，使用方便，靈敏度高，雜質耐受度較高，已被廣泛應用在微生物、蛋白質、聚合物等大分子物質的檢測領域[21?25].MALDI 是一種比電噴霧電離（ESI）更溫和的電離技術，幾乎只產生單電荷分子離子，能電離極性分子和非極性分子.MALDI-TOF MS 在分析中能夠保持高分子量化合物的完整[26]，同時具有高分辨率質譜的優勢，具有較高的質量精度和分辨率[24].因此MALDI-TOF MS 對高分子量DBPs 樣品的識別具有巨大潛力.

MALDI-TOF MS 的檢測條件（如基質、陽離子化試劑、沉積方法、激光能量、檢測模式等）應根據目標樣品進行選擇[27?28].盡管目前文獻中已有一些樣品制備和檢測方法，但是由于高分子量DBPs 的結構未知，且分子量分散、結構復雜，如何針對其性質找到最佳的樣品制備方案和儀器條件仍然是一個挑戰.因此，篩選合適的基質、陽離子化試劑、儀器參數和點靶方法等，是基于MALDI-TOF MS 的高分子量DBPs 檢測方法的關鍵.在沒有大量精確數據的情況下，識別未知物質是一項非常具有挑戰性的工作.僅使用低分辨率質譜，未知DBPs 可能有許多分子式（分子量在800 Da 以上的化合物則會有更多可能的分子式），且每個分子式都有多種可能結構.高分辨率質譜可以提供精確的質荷比（通常是小數點后3 位或4 位），這大大縮小了分子式的選擇范圍[29].MALDI-TOF MS 作為一種高分辨率質譜（HRMS），憑借超高分辨率可以明確地分配每種物質的元素組成.MALDI-TOF MS 還可以提供TOF/TOF 串聯質譜，分析碎片離子的組成，從而得到分子的結構信息.因此MALDI-TOF MS 為高分子量DBPs 分子式和結構式的識別提供了可能.

本研究率先在高分子量DBPs 的檢測中引入了MALDI-TOF MS，建立了未知高分子量DBPs 的檢測方法，從檢測模式、基質、激光強度、陽離子化試劑、點靶方法等進行優化，提高了未知高分子量DBPs 的響應信噪比（S/N），改善了樣品間測量的重現性；在檢測基礎上，通過高分辨質譜數據、同位素模式分析、TOF/TOF 串聯質譜提供的結構信息以及SciFinder 數據庫，建立了高分子量DBPs 的分子式/結構式識別方法.

1 材料與方法（Materials and methods）

1.1 實驗儀器與試劑

實驗儀器：美國Bruker Daltonics 公司UltrafleXtreme 基質輔助激光解析飛行時間質譜儀；美國FEI 公司Quanta FEG 250 Environmental 掃描電子顯微鏡;美國Labacoco 公司CentriVap 離心真空濃縮機；美國Thermo Fisher Scientific 公司Barnstead Micropure 超純水機.

實驗所用試劑純度均為質譜純、色譜純或優級純.超級2,5-二羥基苯甲酸（Super-DHB，2,5-二羥基苯甲酸和 2-羥基-5-甲氧基苯甲酸的9:1 混合物）、α-氰基-4-羥基肉桂酸（CHCA）、地蒽酚（DIT）、2,4,6-三羥基苯乙酮（THAP）、芥子酸（SA）、2-（4-羥基苯基偶氮）-苯甲酸（HABA）、3-吲哚丙烯酸（IAA）、可溶性淀粉購自Sigma-aldrich 公司.反-2-[3-（4-叔丁基苯基）-2-甲基-2-亞丙烯基]丙二腈（DCTB）、三氟乙酸鈉（NaTFA）、氯化鉀（KCl）購自Tokyo Chemical Industry 公司.三氟乙酸銀（AgTFA）購自J&K Scientific 公司.次氯酸鈉（NaClO）儲備溶液購自Sigma-aldrich 公司，并通過DPD 亞鐵滴定法進行標準化[30].本研究中使用的其他所有化學品均從Sigma-Aldrich 公司購買.

1.2 氯化消毒

為簡化實驗過程，本研究選擇淀粉作為模型天然高分子量有機物，在實驗室條件下進行消毒.淀粉是分子結構為（C6H10O5）n?H2O 的聚合碳水化合物.淀粉分子式為（C6H10O5）n?H2O，廣泛存在于藻類細胞、細胞外有機物中，是自然界中廣泛存在的一種天然有機物[31?33].淀粉作為常用消毒場景下的模型化合物[31,34?35]，其組成簡單，結構已知，已被廣泛應用在MALDI-TOF MS 檢測中，因此是理想的高分子量DBPs 的前體物.

為驗證消毒樣品中高分子量DBPs 的產生，本研究中配制了以下模擬飲用水水源水水樣：向1 L 超純水中加入可溶性淀粉（5 mg·L?1以C 計）、NaHCO3（90 mg·L?1以CaCO3計）制備模擬原水樣品.然后，向模擬原水樣品加入2.0 mg·L?1NaClO（以Cl2計）進行氯化，并在20 ℃避光條件下無頂空接觸24 h.通過 DPD 亞鐵滴定法測量每個模擬飲用水樣品中的氯殘留量，并立即用硫代硫酸鈉終止反應.將未消毒的模擬水樣作為對照組，超純水作為空白組.3 個實驗組分別設置3 個平行樣品.

1.3 水樣預處理

樣品預處理對于解決污染問題以及使用MALDI-TOF MS 來分析復雜的樣品混合物很有幫助[36?37].首先利用離心真空濃縮機將1 L 水樣濃縮10 mL，隨后將水樣放入經過預處理的透析袋（美國MYM 公司透析袋；截留分子量為500 Da）中脫鹽.水樣脫鹽程序基于先前的研究[38].脫鹽完成后，使用離心真空濃縮機對水樣進行再次濃縮至0.5 mL，得到濃縮水樣.

1.4 MALDI-TOF MS 分析

所有質譜均使用配備355 nm Nd:YAG 的Bruker Daltonics 公司UltrafleXtreme MALDI-TOF MS 質譜儀獲得.分子量檢測范圍設置為500—5000 Da，以排除由低質量離子產生的高強度信號，并覆蓋模型化合物整個質量分布范圍，研究質量范圍為 800—5000 Da.每個質譜是通過在樣品的均勻區域上隨機獲得的，每個質譜總共有2000 次激光射擊.使用flexAnalysis Version 3.4 質譜軟件處理質譜數據.

1.4.1 基質配制與檢測器參數比選的樣品制備

將DHB、THAP、CHCA、DIT、SA、DCTB、HABA 和IAA 分別稱重并溶解在TA30（H2O:乙腈=70:30，V/V，含0.1% TFA）中，制成20 mg·mL?1溶液.將陽離子化試劑稱重并溶解在TA30 中以制備5 mg·mL?1溶液.以濃縮水樣/基質/陽離子化劑為5/10/1（V/V/V）的混合比制備每一個質譜樣品.然后將3 μL 樣品沉積在MALDI 靶板上，并在環境條件下干燥，分別進行反射-正離子、反射-負離子、線性-正離子、線性-負離子4 種檢測模式的不同激光強度下的檢測.確定基質種類、檢測模式以及激光強度后，則進一步對基質濃度進行優化.將不同濃度的基質溶液（濃度設置為0、5、10、20、30、40、50 mg·mL?1），與濃縮樣品、5 mg·mL?1陽離子化試劑混合（負離子模式下不添加陽離子化試劑）.進行上述實驗時，使用干點法[39]點靶，陽離子化試劑為5 mg·mL?1NaTFA，檢測器m/z 范圍設置為500—5000 Da.

1.4.2 陽離子化試劑比選的樣品制備

陽離子化試劑的作用則是通過陽離子加合物提高分析物的靈敏度和響應強度[18].根據1.4.1 節確定的基質、激光能量和檢測模式，使用干點法將濃縮樣品/基質/陽離子化劑按照5/10/1（V/V/V）分別與NaTFA、KCl 和AgTFA 混合.確定最佳陽離子化試劑種類后，將最佳陽離子化試劑配制為不同濃度的溶液（濃度設置為0、0.5、1、2、5、10、20、50 mg·mL?1），與濃縮樣品、20 mg·mL?1基質溶液混合，干點法制備質譜樣品.

1.4.3 不同點靶方法比選的樣品制備

確定基質、激光能量、檢測模式和陽離子化試劑后，本研究使用4 種不同的沉積方法，同時確保等量的分析物和基質進行MALDI-TOF MS 分析：（1）干點法（混合法），將濃縮水樣和基質首先以體積比1:2 混合，然后將3 μL 所得樣品點樣到靶板上，自然風干；（2）薄層法（底層法），將2 μL 基質施加到靶板上，干燥后將1 μL 濃縮水樣滴加在基質上并使其干燥；（3）種子層法，將1 μL 基質施加到靶板上，自然風干后，將濃縮水樣和基質等體積混合的2 μL 樣品點樣到靶板上并讓樣品干燥；（4）三明治法（夾層法），將1 μL 基質點樣到靶板上，干燥后，將1 μL 濃縮水樣滴加到基質層上并使其干燥，最后將1 μL 基質點樣到樣品上.

1.5 掃描電子顯微鏡（SEM）

Quanta FEG 250 Environmental SEM 用于評估不同點靶方式干燥后樣品的表面分布.SEM 圖像是在高真空（130 Pa）下以200 倍放大倍數獲得的，電子束以10 kV 電壓和238 μA 電流運行.

1.6 高分子量DBPs 的識別

只在消毒水樣（n=3）中重復出現、未消毒和空白水樣中不存在的質譜出峰視為DBPs.因此，僅根據存在和不存在而不是出峰的高度差異，來確定形成的DBPs.根據高分子量DBPs 的同位素模式，判斷結構中是否存在鹵素（即Cl），從而對其進行進一步識別.對于質譜數據的處理，使用美國Bruker Daltonics 公司開發的質譜分析軟件flexAnalysis Version 3.4 將特定的分子式分配給質譜中高分子量DBPs 的分子離子.分子式計算需要滿足“氮原則”，元素個數約束需要根據分子量來確定，質量誤差設為±10×10?6.同時需要舍棄不切實際的C、H、O 比例的分子式，只考慮C、H、O＞0、0≤O/C≤1、0≤H/C≤2.5、雙鍵當量（DBE）≥0 的分子式[40].軟件計算進行分子式賦值后，隨后根據文獻報道的可能反應產物以及SciFinder 數據庫進行合理性驗證.

2 結果與討論（Results and discussion）

2.1 基于MALDI-TOF MS 的高分子量DBPs 檢測方法建立

建立高質量和可靠的MALDI-TOF MS 檢測方法需要考慮許多因素，其中主要影響因素有基質（種類和濃度）、陽離子化試劑（種類和濃度）、激光能量、檢測模式（線性/反射模式，正離子/負離子模式）以及點靶方式等[41].本研究比較了兩個參數來評估高分子量DBPs 的出峰效果：信噪比和變異系數（CV）[42].信噪比反映了質譜出峰信號的強弱，CV 值則反映了結果的重現性的好壞.兩個參數都是根據消毒水樣中出現的新峰信噪比之和計算的.

2.1.1 基質、檢測模式和激光強度的確定

基質在MALDI 分析中非常重要，因為它既是激光能量吸收劑，也是能量傳輸的工具.此外，理想的基質應具有以下特性：在所用波長處具有高電子吸收、良好的真空穩定性、低蒸氣壓以及與分析物的良好互溶性，從而導致均勻的共結晶[18].CHCA、DHB 和THAP 基質已被用于模型化合物淀粉的分析[43?45].SA、DCTB、DIT、HABA 和 IAA 作為常用基質也被納入基質篩選的范疇.NaTFA 被用作基質比選階段的陽離子化試劑.表1 顯示了8 種基質的檢測新的DBPs 的結果.通過對消毒前后水樣的逐一比對發現，以SA、DCTB、DIT、HABA 和 IAA 為基質未檢測到新峰，表明這些基質不適合淀粉的高分子量DBPs 分析，而DHB、CHCA 和THAP 均在反射-正離子模式下檢測到了高分子量DBPs.以DHB 為基質，檢測模式為反射-正離子模式時，高分子量DBPs 出峰信噪比遠高于THAP 和CHCA，并且CV 值更小，結果重現性更好，因此以DHB 為基質，檢測模式為反射-正離子模式時，高分子量DBPs 出峰效果最好.圖1 為以DHB 為基質，檢測模式為反射-正離子模式，激光強度設置為90%時，模擬水樣消毒前后的全局對比圖.圖2 為m/z 889.2478、1051.3018、1213.3578、1375.4115 和1537.4675 的5 種高分子量DBPs 出峰情況.

圖1 模擬水樣消毒前后在m/z 500—5000 的質譜出峰全局對比Fig.1 Global comparison of mass spectrometry peaks at m/z 500—5000 before and after disinfection of simulated water samples

圖2 （a）m/z 889.2478;（b）m/z 1051.3018;（c）m/z 1213.3578;（d）m/z 1375.4115;（e）m/z 1537.4675 處的5 種高分子量DBPs 出峰情況Fig.2 Peaks of 5 high molecular weight DBPs at（a）m/z 889.2478;（b）m/z 1051.3018;（c）m/z 1213.3578;（d）m/z 1375.4115;（e）m/z 1537.4675

高分子量DBPs 在負離子模式下無法出峰可能是由于高分子量DBPs 去質子化（[M-H]-）的能力較弱.此外，DHB 作為基質時，高分子量DBPs 信噪比遠高于其他基質.此外，通過將信噪比的標準偏差除以平均信噪比來計算它們的CV 值，且使用DHB 基質時，DBPs 信噪比的CV 值更小說明共結晶的均勻性更好，結果重現性更好.然而這些峰的信噪比不高，信號重現性較差.因此針對高分子量DBPs 的MALDI-TOF MS 檢測方法亟待建立.

激光能量是決定解吸和陽離子化樣品數量的一個關鍵因素，激光能量較低時，響應信噪比會顯著降低或者無信號，過高的能量則可能會破壞樣品，從而降低信噪比，而激光能量對信噪比影響的差異可歸因于基質性質的差異[46?47].因此，本研究在各個檢測模式下都進行了激光能量優化，只有在反射-正離子模式下可以檢測到高分子量DBPs.各基質在反射-正離子檢測模式下，高分子量DBPs 在不同激光能量下的信噪比如圖3 所示.結果顯示DHB 作為基質，在各激光強度下，高分子量DBPs 的信噪比均高于其他基質.DHB 作為基質的情況下，在激光強度為90%時信噪比達到最高.其原因可能是在90%激光強度以下時，激光能量不足，隨著激光能量增加，電離水平提高，因而產生更高的信噪比峰[41]，超過90%后，激光能量過高，在離子飛行過程中分子離子被破壞，增強了背景峰，從而導致信噪比降低.

圖3 反射-正離子模式下各基質在不同激光強度時的高分子量DBPs 的信噪比Fig.3 Signal-to-noise ratios of high molecular weight DBPs in reflection-positive ion mode for each substrate at different laser intensities

基質濃度直接影響基質與樣品混合比例，因而可能會對分析物的響應產生影響[27,41,48].因此需要確定檢測高分子量DBPs 的DHB 基質的最佳濃度.檢測模式為反射-正離子模式，激光強度為90%，陽離子化試劑為5 mg·mL?1NaTFA，點靶方式為干點法.如圖4 所示，在DHB 濃度從0 增加到50 mg·mL?1，高分子量DBPs 的信噪比先升高，在DHB 濃度為20 mg·mL?1時，達到最高信噪比，然后下降.結果表明，DHB 基質的濃度對高分子量DBPs 響應信噪比有明顯的影響，因此，選擇20 mg·mL?1作為合適的DHB 濃度.

圖4 在不同DHB 濃度下的高分子量DBPs 的信噪比Fig.4 Signal-to-noise ratio of high molecular weight DBPs at different DHB concentrations

2.1.2 陽離子化試劑的比選

寡糖由于缺乏基本官能團及其高度親水性，寡糖在包括MALDI-TOF MS 在內的質譜分析中電離效率較低，在質譜分析中很難形成質子化離子，通常需要使用堿金屬離子來實現的寡糖的離子化，形成堿金屬締合離子[49?51].本研究測試了3 種陽離子化劑，包括NaTFA、KCl 和AgTFA，用于分析消毒水樣中產生的高分子量DBPs.如圖5（a）和（c）所示，當添加NaTFA 或AgTFA 時，高分子量DBPs 出現在m/z 889、1051、1213、1375 和1537 處.如圖5（b）所示，添加KCl 時，高分子量DBPs 新增了m/z 905、1067、1229、1391、1553 系列峰（圖中標“*”），在這種情況下，m/z 889、1051、1213、1375 和1537 系列峰也能在質譜中被明顯觀察到，并且兩個系列峰m/z 對應相差約16，這與K 和Na 相對原子質量之差相同.這表明m/z 889、1051、1213、1375 和1537 系列峰為加鈉峰，而m/z 905、1067、1229、1391、1553 系列峰為加鉀峰.添加NaTFA 或添加AgTFA 時，高分子量DBPs 均以[M+Na]+離子的形式出現，并且添加NaTFA 的樣品高分子量DBPs 響應信噪比更高，說明高分子量DBPs 與銀離子親和力很弱，而易與鈉離子結合.而添加KCl 時，高分子量DBPs 則以[M+Na]+和[M+K]+離子的形式出現，質譜峰更加復雜，不利于質譜分析.因此，NaTFA 是分析高分子量DBPs 的最佳陽離子化試劑.

圖5 （a）AgTFA，（b）KCl 和（c）NaTFA 作為陽離子化試劑的質譜出峰對比Fig.5 Comparison of mass spectrometry peaks of（a）AgTFA,（b）KCl and（c）NaTFA as cationization agents

隨后，在反射-正離子模式，激光強度為90%，基質為20 mg·mL?1DHB，點靶方式為干點法的條件下，確定了NaTFA 的最佳濃度.如圖6 所示，NaTFA 濃度在0 到2 mg·mL?1范圍內，響應信噪比迅速增加，然后在超過2 mg·mL?1后降低.因此，選用了2 mg·mL?1作為NaTFA 的最佳濃度.因為消毒水樣中鈉離子的存在，所以即使不添加添加劑，仍然有一定強度的加鈉峰.隨著鹽濃度增加，高分子量DBPs 信噪比先增高后降低.這是因為較低濃度下鈉離子對高分子量DBPs 離子化有促進作用，而高濃度的鈉離子又會使噪聲升高，造成信噪比降低.

圖6 在不同NaTFA 濃度下的高分子量DBPs 的信噪比Fig.6 Signal-to-noise ratio of high molecular weight DBPs at different NaTFA concentrations

2.1.3 點靶方法優化

在前面實驗確定的最佳實驗條件的基礎上，評估了干點法、薄層法、種子層法、三明治法等4 種沉積方法的響應信噪比和結果重現性.如圖7 所示，在200 倍的掃描電鏡下研究了4 種不同沉積方法下，基質與樣品的共結晶情況.在使用干點法的情況下，觀察到直徑超過200 μm 的晶體.其他3 種沉積方法的晶體均明顯更小，結晶更加均勻.在使用三明治法時，晶體的直徑＜50 μm，至少小了4 倍.使用三明治法的靶板上形成了更薄更均勻的樣品和DHB 的共結晶層.由于產生更小的晶體有利于提高信號信噪比和結果重現性，因此三明治法的共結晶效果最好.薄層法、種子層法更小晶體的形成可能是由于（1）薄層法、種子層法均有兩次點靶過程，這使得大晶體可以再溶解和再結晶，這有利于形成更小的結晶；（2）此外，第一層基質干燥后，可以充當第二層樣品分子的成核中心，增加了溶劑蒸發的速度，反過來阻止了大晶體的生長，并且這個過程使得樣品更好地與基質結合，形成了更均勻分布的晶體層.而三明治法經歷了兩次再溶解和再結晶過程，加強了上述兩種效果.

圖7 （a）干點法,（b）薄層法,（c）種子層法和（d）三明治法的樣品結晶在200 倍放大倍數下的SEM 圖像Fig.7 SEM images of sample crystals with（a）dried droplet method,（b）thin-layered method,（c）seed-layered method,and（d）sandwich method at 200 magnifications

在反射-正離子模式，激光強度為90%，基質為20 mg·mL?1DHB，陽離子化試劑為2 mg·mL?1NaTFA 條件下，計算了4 種沉積方法的信噪比和CV 值（n=10）.CV 值越小，數據越穩定.如圖8 所示，在對高分子量DBPs 的檢測中，觀察到4 種沉積方法獲得的響應信噪比為：三明治法＞種子層法＞薄層法＞干點法，這表明三明治法獲得了最好的信號響應，采用三明治法有助于提高檢測方法靈敏度和降低檢測限；而CV 值則為三明治法＜薄層法＜種子層法＜干點法，這說明使用三明治法的樣品，分析物和基質共結晶更好，形成最佳的共結晶層，獲得了最佳的結果重現性.因此，對于高分子量DBPs，使用三明治法5 種高分子量DBPs 信噪比之和達到了136.2，CV 值則為4.77%，優于其他點靶方法.

圖8 不同點靶方式的（a）高分子量DBPs 信噪比和（b）CV 值（n=10）Fig.8 （a）Signal-to-noise ratio and（b）CV values of high molecular weight DBPs for different p deposition methods（n=10）

2.2 基于MALDI-TOF MS 的高分子量DBPs 識別方法建立

MALDI-TOF MS 在消毒樣品中發現m/z 889.2478、1051.3018、1213.3578、1375.4115 和1537.4675共5 種新形成的高分子量DBPs.識別步驟如下，以m/z 1051 處出峰為例.

2.2.1 同位素模式評價

根據高分子量DBPs 出峰（圖9），其同位素峰與碳同位素出峰情況相符，不符合Cl 的同位素出峰情況.因此可判斷消毒過程中未發生鹵素取代反應，其分子式中不含Cl.因此分子式分配的元素范圍為12C: 0—100,1H: 1—200,16O: 0—100,23Na: 0—2.

圖9 高分子量DBPs 的同位素模式，以m/z 1051 處出峰為例Fig.9 Isotopic patterns of high molecular weight DBPs,taking the peak at 1051 as an example

2.2.2 MALDI TOF/TOF 串聯質譜的碎片離子分析

以m/z 1051.3018 峰為例，根據其碎片離子質譜圖（圖10），m/z 1051.3018 母離子產生了一系列寡糖碎片離子（以※標記的峰），其中m/z 833 碎片離子為五糖結構.因此m/z 1051 分子中存在五糖結構，由此可判斷高分子量DBPs 雙鍵當量DBE≥5.

圖10 m/z 1051 的碎片離子質譜圖，圖中“※”表示寡糖結構Fig.10 Fragment ion mass spectrum of m/z1051.3018,"※" in the figure indicates the oligosaccharide structure

2.2.3 高分子量DBPs 分子式分配

分子式計算中，設置質量誤差為± 10×10?6，設置雙鍵當量（DBE）≥ 5.若要在地球物理化學環境中存在，分子式的C、H、O 比例須滿足：C、H、O ＞ 0、0 ≤ O/C ≤ 1、0 ≤ H/C ≤ 2.5[40].根據MALDI-TOF MS 提供的精確質量1051.3018 以及上述篩選條件，得到分子式計算結果如表2 所示.

表2 m/z 1051.3018 的分子式計算結果Table 2 The calculation result of the molecular formula of m/z 1051.3018

2.2.4 高分子量DBPs 結構式確定

有文獻報道，淀粉與次氯酸反應過程中，葡萄糖殘基可被氧化為葡萄糖羧酸，高分子量DBPs 可能為寡糖羧酸或寡糖羧酸鈉[52].因此若消毒過程與文獻中報道的反應相同，則可認為C36H61O32Na 與C36H62O32（C36H61O32Na 的酸）是同種物質.過往文獻中報道的可能產物結構見圖11.

圖11 已報道的可能產物結構，R=COOH 或CH2OH[52]Fig.11 Possible product structures have been reported,R=COOH or CH2OH[52]

通過SciFinder 數據庫驗證.候選分子式C38H60O32、C40H61O29Na 均未檢索到對應物質，而C36H61O32Na（C36H62O32），得到了4 種對應物質，其結構式如圖12 所示.考慮到消毒前體物淀粉的結構，產物結構可排除圖12（c）和（d）結構.此外，圖12（a）、（b）結構與文獻中報道結構（圖11）吻合.因此可確定高分子量DBPs m/z 1051.3018 的結構即為圖12（a）或（b）結構.

圖12 C36H62O32 的四種結構式Fig.12 Four structural formulas of C36H62O32

同樣的識別方法可以得到，5 種高分子量DBPs 分子式分別為C30H51O27Na、C36H61O32Na、C42H71O37Na、C48H81O42Na、C54H91O47Na（表3），并且通過數據庫驗證與以往研究證明5 種新形成的高分子量DBPs 同為羧酸糖類物質，新產生的高分子量DBPs 的分子量相鄰物質質量差約為162.1 Da，與己糖殘基質量相同，因此可推測5 種高分子量DBPs 為相差若干個己糖殘基的同類型物質.

表3 高分子量DBPs 分子式識別結果Table 3 Molecular formula identification results of high molecular weight DBPs

在消毒過程中，淀粉中的還原端糖殘基本身被氧化并開環，消毒模型化合物被氧化為寡糖醛酸或者寡糖羧酸鈉.因此，高分子量DBPs 中未檢測到含氯分子峰，可能是由于淀粉中糖苷鍵和還原端糖殘基的存在，導致其消毒過程中更容易發生糖苷鍵斷鍵、還原端糖殘基開環和羥基-羧基轉化，而不易發生鹵素的取代反應.

3 結論（Conclusion）

（1）本研究引入MALDI-TOF MS，構建了針對高分子量DBPs 的檢測方法，并通過對消毒前后水樣的質譜出峰逐一比對，在模擬飲用水中發現了5 種新的高分子量DBPs.

（2）發現基質、檢測模式、激光強度、陽離子化試劑和點靶方式均能對高分子量DBPs 信噪比和信號重現性產生影響.以DHB 為基質，NaTFA 為陽離子化試劑，三明治法為點靶方法，MALDI-TOF MS 在反射-正離子模式、90%激光強度下，高分子量DBPs 信噪比和信號重現性達到最優，信噪比達到136.2，CV 值為4.77%.

（3）通過高分辨質譜提供的精確質量和同位素評價，TOF/TOF 串聯質譜提供的碎片離子特征以及SciFinder 數據庫驗證，建立了高分子量DBPs 的識別方法.最終確定5 種高分子量DBPs 為相差若干己糖殘基的寡糖羧酸鈉類物質.

本研究基于MALDI-TOF MS 的高分子量DBPs 檢測識別方法可為實際飲用水中復雜DBPs 混合物的檢測與鑒定提供新的技術支持.