根際化學與生物多樣性的表征方法：組學技術的機遇與挑戰＊

黃紅林 呂麗麗,2 呂繼濤 饒子漁 耿方蘭 曹 冬 康躍惠 溫 蓓,2

（1.中國科學院生態環境研究中心，環境化學與生態毒理學國家重點實驗室，北京，100085；2.中國科學院大學，北京，100049）

根際（rhizosphere）是連接植物、土壤和微生物的核心，是土壤形成、碳循環和地球陸地生態系統最終生產力的基礎，同時也是微生物在土壤中活動的關鍵場所[1?4].根際的概念是1904年德國科學家Hilter 首次提出.由此，根際化學與生物學過程的相關研究已經經歷了一百多年[5].可以確定，根際是植物、土壤和微生物與環境交互作用的中心，是生物化學過程耦合最活躍的區域[6].

植物根系通過根系分泌、呼吸作用、養分吸收等各種形式和途徑將有機或者無機化合物釋放到周圍土壤，進行著植物與土壤間物質交換的重要的界面過程，創造了根際區獨特的化學環境.并且，這些物質在化學上具有多樣性，從簡單的低分子量的有機酸、糖、氨基酸，到復雜的維生素和植物激素；還有大分子的多種碳水化合物、肽和蛋白質，以及根組織的脫落物等[7]（表1）.

表1 根際主要化合物的來源、種類及組成Table 1 Source，category and composition of the main compounds in the rhizosphere

隨著植物種屬、發育進程、營養、土壤類型、環境特征及其他因素的改變，根系分泌物的組成也隨之而變化[8]，即根系分泌不是均勻或靜態的.植物通過根系分泌物這個重要的媒介與外界進行物質交流，根系分泌組成從根本上決定了根際的化學多樣性.其次，根際微生物涵蓋細菌、真菌、藻類、原生動物等[9]，其在數量上為根際外土壤的幾至幾十倍，存在著顯著的多樣性和復雜性.大量微生物聚集于根系周圍，將有機物分解轉化為植物可以吸收的養分；同時，植物生長過程中的根系分泌物、死根、根脫落物能夠給予微生物必需的營養和能量[10].而且，根際微生物群即使在同一植物的不同品種也可表現出其高度的特異性[11].經過長達數億年的共同進化，根際微域中植物與地下生物，尤其是微生物之間產生了繁雜的動態互作關系，即為根際效應[1，12?13].已證明根系分泌物會調控土壤微生物群落的組成、結構和功能[14].這表明，植物根系在不同時空分泌的物質特異性、種類和數量都可能介導了微生物群落的組裝模式[15].但是，根系分泌物的化學性質和微生物底物的偏好性如何驅動根際微生物群落的構成與演替及其機制還需要深入的探討[8].目前，受研究方法的局限，人們對根際中植物與微生物復雜的相互作用的認識還非常欠缺.本文綜述了根際化學與生物學方法的最新進展，重點闡述了組學技術在根際科學研究中的機遇與挑戰，強調了其在相關尺度上揭示根際過程與機制的必要性.

1 傳統的根際化學與生物研究方法（Traditional analytical methods of chemicals and microorganisms in the rhizosphere）

1.1 根際化學組分的經典的研究方法

精確表征和準確定量根際土壤中的化合物類型是更好明晰根際化學過程的先決條件.但是，鑒于根際化學組分的龐雜性以及分離和提取根際土壤與土壤溶液的困難性，使得根-土界面化學組分的分析具有挑戰性.一直以來，根際化學組分的測定主要聚焦于根系分泌物中的小分子如：低分子量有機酸的定性和定量測定[9?11]，卻對一些大分子化合物尤其是蛋白質、多糖和脂質的分析有所忽略，造成對根際化學多樣性認識的偏差[16].檢測根際化學組分的方法從最初的化學分析，逐漸發展到后來的光譜分析、色譜分析、質譜分析和色質聯用技術等.

經典的根際化學分析方法包括滴定法和比色法，主要針對根際中的小分子化合物，如采用Folin-Ciocalteu 試劑比色法測定根際中酚酸類物質[9?10]、鉬藍法測定糖類物質[17].由于樣品前處理簡單、分析快捷、反映信息量大等特點，光譜法曾成為根際化學組分表征中應用最廣泛的手段之一.光譜分析技術包括紫外、紅外、熒光光譜和核磁共振譜（NMR）等，用于識別根際中化學組分的芳香性、官能團、疏水性和物質構成.比如，利用紫外光譜測定根際組分的特征參數A253/A203，這個參數的值大就說明芳香環上取代基類型以羧基、酯類、羰基、羥基等極性官能團為多，值小則表明主要為非極性的脂肪鏈官能團組成[18?19]；根際組分的芳香性可以通過紅外光譜的芳香性特征峰來判定[20]；根際化學組分中類蛋白物質、類腐殖酸物質和類富里酸物質等可采用三維熒光光譜的不同激發波長、發射波長下的特征熒光峰進行指示[21]；核磁共振譜能利用化合物在碳譜、氫譜上的化學位移等參數獲得根際化合物的碳組分、氫組分信息[22?23].

色譜及色譜與質譜聯用技術也是根際化學組分識別和鑒定的常用方法[24].利用得到的色譜和質譜信息，與相應的數據庫匹配就可獲取有關物質組成和結構的大量信息.色質聯用技術包括氣相色譜-質譜聯用（GC-MS）和液相色譜-質譜聯用（LC-MS）.GC-MS 用于分離分析根際中揮發性和半揮發性的有機物，通過酯化、甲硅烷化、乙?；屯榛妊苌磻笠部捎脕頊y定非揮發性和極性有機化合物[25?28].目前，GC-MS 已被廣泛用于根系分泌物中低分子量有機酸的鑒定和定量研究[29]，也有將其用于作物，如玉米、羽扇豆和小麥根系黏液中的脂肪酸、脂肪酸甲酯和脂肪酸酰胺的檢測[30?33].然而，這些分析方法大多只是對根系分泌物進行了定性研究，并沒有提供基于濃度的數據.HPLC 是檢測分離非揮發性和極性根系分泌物最常用的方法[34]，但靈敏度和選擇性比GC-MS 低.作為替代技術，采用液相色譜-電噴霧電離質譜法（LC-ESI-MS），在正、負電離模式下對各種極性和中等極性化合物進行軟電離，并提供高質量的選擇性和靈敏度，從而使LC-ESI-MS 成為根際科學研究中一種有吸引力的技術[35?37].然而，ESI 與HPLC 流動相的兼容性方面存在一些缺陷，結合電化學抑制器的發展為LCMS 給根際研究的應用帶來了更大的靈活性[38].總而言之，色譜及色譜串聯低分辨質譜法適用于有標準品的目標物的測定，能夠檢測的化合物非常受限.因此，根系分泌物的相關分析在過去幾十年僅實現了對諸如低分子量有機酸、部分糖、脂肪酸和氨基酸等少量化合物的識別.根際化學組成異常復雜，借助光譜手段、色譜分離技術及傳統的低分辨質譜方法遠不能解析根際化學分子的多樣性.

1.2 根際微生物的傳統研究方法

根際微生物通常采用培養和分離技術進行研究.微生物平板培養技術是一種傳統的根際微生物研究方法[39].該法能大概估計土壤微生物的種類、數量和分布，但是，不能夠對優勢物種做進一步的鑒定，難以開展系統發育的分析.此外，培養基和培養條件的改變會對微生物形成選擇性，且約99%以上的根際微生物不可培養[40].Biolog 氧化還原技術是以群落水平的碳源利用類型為基礎，為研究根際土壤微生物功能多樣性提供了一種簡單而快速的方法[41?42].然而，源于不同微生物對同一碳源的利用不同，碳源的代謝指紋差異不能單純地歸因微生物群落數量和結構的差異，即代謝多樣性不一定真實地反映整個根際微生物群落功能的多樣性[43].而將微生物群落結構與其環境活性相關聯的磷脂脂肪酸-穩定同位素探測（PLFA-SIP）的方法，可以獲取根際微生物多樣性更全面的信息[44?46].雖然這些方法克服了微生物培養技術的一些局限性，但是它們實現不了對根際微生物多樣性更為精細的解析.

隨后，分子生物學技術在根際微生物研究中得到越來越廣泛的應用.1979年，Fischer 和Lerman 最先提出了變性梯度凝膠電泳（DGGE）技術，用于測定DNA 突變[47]，并于1993年用于首次研究微生物群落結構[48].與DGGE 具有相似原理的溫度梯度凝膠電泳（TGGE），利用溫度梯度替代化學變性劑，也在微生物領域逐漸被應用.DGGE/TGGE 技術的優點是可重現性高、操作簡單等，但對無熒光標記的DNA 不敏感，且只能分析微生物群落中數量超過1%的優勢種群.末端限制性片段長度多態性（TRFLP）方法用來確定所選DNA 片段的長度多態性，并分析微生物群落結構和功能[49]，在根際微生態研究方面的應用越來越普遍.但是，T-RFLP 法也存在很多潛在的缺陷，例如：單個峰包羅多個物種、單個物種分布在多個峰、物種和峰的隨機錯誤匹配等等.DAN 測序Sanger 技術，具有讀長長和準確性高等特點，也曾是根際微生物較為有效的鑒定方法[50].盡管根際中觀察到的微生物差異和數量是巨大的，但尚缺乏有關其結構與功能多樣性的詳細信息.傳統的聚合酶鏈反應方法逐漸被高速發展的高通量測序技術取代.

2 根際科學研究中組學方法的機遇與挑戰（Opportunities and challenges of omics technology in rhizosphere science）

鑒于根際的異質性和復雜性，根際化學與生物多樣性及其耦合關聯性的研究要求采用先進的技術.新興的技術需要同時滿足靈敏度高、特異性強、重復性好，高時空分辨率、大動態范圍和高通量等要求[51].最近，代謝組學、宏基因組學、轉錄組學和蛋白組學以及幾者整合的多組學技術的發展拓展了根際科學研究的新方向，全方位、多層次提供植物根系分泌的動態變化特征和根際微生物群落結構與功能的詳細信息，能夠深入研究復雜的根際化學和微生物多樣性，有助于深層次挖掘根-微生物-土壤界面的大量尚未揭示的關鍵過程與機制[52?55].根際科學中組學的研究方法、主要技術與平臺、研究內容等匯總見表2.

表2 組學方法在根際科學研究中的匯總Table 2 Summary of the omics analysis in the study of rhizosphere science

2.1 根際科學中代謝組學研究

代謝組學研究策略中最實用的方法之一是代謝全譜的分析.它以組學的視角無偏向性地大規模檢測分析所有的小分子代謝物，并采用生物信息學手段旨在發現整體代謝網絡特征和涉及的代謝物變化特征，提升對基因、蛋白質和植物代謝之間聯系的認識[56?57].代謝組學分析往往需要多個生物學重復，代謝物的提取、富集和去除雜質等樣品前處理是關鍵.樣本的前處理方法包括液-液萃取、固相萃取、加速溶劑萃取、超臨界流體萃取、微波輔助萃取等[29].根和根際群落成員之間的相互作用主要是通過化學通訊來實現的，根際代謝組學有助于更好地理解這種化學對話[58].根際代謝組學聚焦于分析根-土壤界面的整個代謝組[24]，即側重于研究參與化學信號傳遞的初級代謝產物和植物天然產物以及與根系相關的微生物類群的分泌物.

GC-MS、LC-MS 以及NMR 是分析根際代謝組最為常用的技術，且GC-MS 和LC-MS 比NMR 更為靈敏[59?61].當前代謝組學研究對象面向微量化、復雜化及規?；?，因此亟待發展更為高端的分析技術.相比于低分辨質譜，高分辨質譜因具有高靈敏度、高分辨率和精度、寬動態范圍等優勢逐漸成為組學研究不可或缺的工具[24].高分辨質譜提供化合物精確的質量數，能夠區分復雜背景中的雜質及共流出物，降低了對樣品前處理的要求.此外，根據精確質量數可以推測未知化合物的元素組成，為高通量篩選提供了線索.通過氣相/液相色譜與高分辨質譜的聯用的技術平臺靶向和非靶向可以鑒定根際盡可能多的代謝物[62].氣相色譜-飛行時間質譜（GC-TOF-MS）可用于快速，高靈敏度地檢測植物根系大量代謝物小分子[63?64].應用GC-TOF-MS，Luo 等[56]分析了生態型東南景天根系分泌物的代謝譜，共檢測出15 種潛在的生物標志物，具體包括有機酸、氨基酸、醇類、脂肪酸、酚類等組分.Zhao 等[65]通過氫核磁共振譜1H-NMR 結合GC-MS 的非靶向代謝組學分析，研究了水培體系中黃瓜幼苗植株對納米銅的響應，發現納米銅引發了黃瓜葉片和根系分泌物的代謝變化，成功地識別了納米粒子誘導的生理反應.植物提取物中大部分代謝物都難揮發[66]，不能采用GC 進行直接分析，而是需要將其轉變為極性較小，揮發性更高的衍生物[62].而LC/MS 無需衍生，可以直接對代謝物進行代謝譜檢測，是分析代謝物變異和生物代謝途徑的理想平臺[67].為了探索模式植物擬南芥根系分泌物的化學組分，Strehmel 等[68]開發了一種根系分泌代謝物的非靶向分析流程，以UPLC-ESI-QTOF/MS 為分析手段，共檢測到100 多種代謝物，分類表征了90 種化合物的結構，其中42 種通過了已知化合物標準品的印證.Marti 等[69]基于UPLC-TOF-MS 的代謝組學方法評估了斜紋夜蛾侵染的玉米幼苗葉片、汁液、根系和根系分泌物的變化，鑒定出32 種差異代謝物，并通過微流核磁共振（CapNMR）對其進行結構表征，通過高通量直接納米注入串聯質譜（MS/MS）方法對9 種化合物進行了量化，研究表明食草動物的攻擊會導致植物代謝物的誘導，這些代謝物對葉和根中的食草動物抗性具有不同的影響.采用HPLC、離子色譜結合GCTOF-MS，Carvalhais 等[70]分析了玉米根系分泌物中的氨基酸、有機酸和糖類，發現缺乏某些養分時根際代謝物的形態發生了定性和定量的變化，并且代謝物的分泌模式與土壤中養分的擴散特性存在聯系.類似地，當植物葉片暴露于納米二氧化硅（SiO2NPs）時，Tian 等[71]觀察到根際代謝產物譜發生了顯著變化，幾種代謝物糖和糖醇、脂肪酸、少量有機酸包括的相對豐度顯著增加；且氨基酸水平顯著下降，表明根際碳氮庫發生了變化.結合其他學者的多個研究[72?75]證實根際代謝組可以深入揭示生物體中污染物解毒的分子響應機制.

傅里葉變換離子回旋共振質譜（FT-ICR-MS）擁有超高的準確度、分辨率和超低的樣品處理要求[76].能夠進行非靶標代謝分析.FT-ICR-MS 可以同時檢測數以千計的單個化學組分，通過內部校準來達成相對定量，它還可以根據精確的質量數確定根際代謝物所屬的類別，是鑒定根際化學分子組成最有前途的分析技術之一[77].結合正、負離子模式，Miao 等[16]首次利用FT-ICR-MS 表征了植物根系分泌物的分子組成，共檢測出8000 余種分子，研究發現與土壤DOM 相比，根系分泌物含有更多的蛋白質類、脂肪類和碳水類化合物，而木質素類化合物含量較少.Kaplan 等人[78]采用FT-ICR-MS 比較了濕地中植物根際土壤和本體土壤可溶性有機質組成，發現根際含有一些在非根際土壤中未鑒定的有機分子，且根際有機質分子通常具有更大的分子量，更少的芳香性，更多的羧酸鹽和含氮COO 官能團以及更大的親水性，表明不僅根際有機質的數量，而且其分子特征可能在一定程度上導致濕地中污染物的固定化增強，為污染濕地長期管理提供了啟示.目前，FT-ICR-MS 易實現幾十萬甚至上百萬的分辨率，以及亞ppm 級的質量準確度[79]，提供可靠的元素組成和分子式信息，已成為研究根際中復雜化學組分的優選方法[80].然而，沒有任何單一的分析方法或儀器組合能夠覆蓋給定樣本的整個代謝組組成[60].在未來，擴展代謝組覆蓋范圍的新分析技術將非常重要.最近，靜電場軌道阱（Orbitrap）質譜技術與LC 或GC 相結合，為植物分泌物和微生物的非靶向代謝組學提供了當前最佳選擇.然而，在不久的將來，離子遷移光譜質譜法（IMS-MS）可能會成為非靶標代謝組學分析的拐點.其允許在一次運行中檢測和表征數百種代謝物[81?82].因此，IMS-MS 代謝組學將在以前從未實現的時間范圍內，從非常復雜的根際中快速準確地獲得代謝組學圖譜.此外，不同技術如：高分辨LC-MS 與GC-MS 和/或超高分辨FT-ICRMS 耦合起來，將有助于從復雜混合物中發現濃度極低的新化合物，獲取廣泛的代謝組學指紋.由此，基于高分辨質譜技術的高通量的組學技術有助于更加全面地分析根際化學分子多樣性分布特征，逐漸成為根際科學的研究趨勢.

盡管如此，根際代謝組學目前仍然是一個新興領域，在理解根際復雜系統方面仍有很大的發展空間.一方面，由于根系分泌物取樣的限制、組學分析平臺的靈敏性以及相關尺度上實時追蹤分泌物的時空動態的困難性[58]，導致根際的代表性顯示出明顯不足.另一方面，為了準確理解代謝過程中植物和微生物兩者復雜的相互作用，必須從微生物和植物以及它們相互作用的最終產物中獲得單獨的數據.研究者們通過不同的方法對植物滲出液收集進行了多次嘗試[83]，但根際代謝組學面臨的最大挑戰是區分微生物和植物各自的代謝產物，以及它們相互作用的最終產物.因此，有必要對根際不同部分進行精確取樣和優化分析方案，以便更為精準表征根際和陸生生態系統中植物和微生物代謝過程的綜合性質.

2.2 根際科學中宏基因組和轉錄組學研究

大多數棲息在根際區域的微生物是無法培養的，無從對其進行定性和定量分析.宏基因組、轉錄組等組學技術因突破了有些微生物不可培養的瓶頸而顯示其優勢.它們能夠快速高效地獲取植物根際專屬微生物群落的詳細信息[84?85].隨著新一代高通量測序技術的創新與發展[86]，宏基因組和轉錄組逐漸應用于研究根際微生物群落結構[87]；推斷根際核心微生物群落[88]及其代謝潛力[89]；闡釋植物-微生物相互作用[90]；探討外源有毒污染物處理下的根際微生物群落表達[91].利用宏基因組學和轉錄組平臺對根際的研究主要集中于模式植物擬南芥[87?88]、豆類和谷物[89?91].這些研究提供了大量關于擾動響應以及根際群落的豐度、結構、多樣性、空間分布和核心成員的信息，也為破譯環境中有機和無機污染物解毒、積累、轉運和降解的分子機制提供新的機遇[92].

宏基因組也稱微生物環境基因組或元基因組，其以某一特定環境中微生物的基因組為研究對象，采用生物信息學的分析方法，研究微生物的多樣性、微生物的群落結構，探索微生物的潛在功能以及與環境之間的互作關系.利用16SrDNA 測序的宏基因組學領域的第一項重大研究表明本體土壤和根際土壤的微生物群落顯著不同，根際存在著多種特異的微生物種群[88].通過特定基因的擴增子靶向或鳥槍測序對植物根際、葉際或內生圈進行宏基因組分析，研究者們總結出寄主-微生物和微生物-微生物聯合作用共同推動了根-土壤界面微生物的分化[87].Alzubaidy 等[93]運用宏基因組學方法研究了紅海中紅樹林微生物群，結合454 焦磷酸測序技術探討了與白骨壤相關的根際微生物群.這項研究首次深入了解了灰紅樹林根際土壤微生物的功能范圍和多樣性.Bhattacharyya 等[94]在他們的研究中描述了低地水稻的全基因組宏基因組測序分析，該結果篩選出優勢細菌群落為扁平菌、變形菌和厚壁菌.Pascual 等[95]同時利用可培養和不可培養的策略來探索生長在西班牙內華達山脈國家公園的百里香根際的細菌群落，宏基因組學研究證明了居住在根際的一個小型“核心”微生物群落以及叢枝菌根真菌和其他有益微生物可以用作生物接種劑.下一代測序技術和相關生物信息學方法的發展使科學家能夠設計策略和操作流程，以更好地了解亞基因組.Bell 等[86]進行了一項針對擴增子測序的研究發現，重金屬對植物的脅迫決定微生物修復的強度，根際叢枝菌根真菌數量取決于重金屬濃度水平[85].事實上，宏基因組學既可以通過靶向保守區域來確定群落結構，也可以使用重組DNA 的經典技術來確定任何環境中功能基因的可用性[92].因此，它有助于量化微生物群落內的轉化效率.在植物修復過程中，一些功能未知的微生物菌株可能棲息在根際，并可能獲取新污染物降解途徑，為根際土壤中污染物去除的植物-微生物相互作用提供了見解.

轉錄組學關注整個微生物群落中的基因表達，并解釋特定環境中微生物種群的動態功能，是研究復雜的微生物生理學、功能分析和未知的微生物群落結構的一種有力的技術.轉錄組還可以表征環境樣本的實時mRNA 表達[96]，通過闡明特定轉錄基因并對植物相關微生物群落進行功能分析，支持宏基因組學獲得的數據.利用轉錄組學方法，研究人員比較了3 種不同作物:燕麥、豌豆和小麥的根際微生物群，發現豌豆根際比非根際中含有更多的微生物，并且微生物組表現出顯著不同的根際特異性[5].此外，轉錄組法能夠精確地表示復雜微生物群落中活躍表達的基因，從而剖析微生物組在特定污染環境下功能的改變，為土壤污染物轉化或降解機制提供新見解.例如：de Menezes 等[97]研究暴露于菲的土壤微生物轉錄組，觀測到雙加氧酶及與解毒和應激反應相關的基因豐度增加.對田間生長的柳樹根際和根的轉錄組進行測序時，Yergeau 等[98]發現與降解關聯的轉錄物在污染土壤和柳樹根際中明顯富集，隨后其消減與放線菌目、紅螺旋菌目、伯克霍爾德菌目等相關[99].研究施加農藥后玉米和大豆轉錄組時，發現草甘膦會影響作物細胞氨基酸代謝和碳水化合物的含量[91]，mRNA 豐度與阿特拉津降解活性之間存在著密切的聯系[100].轉錄組學分析結果表明，許多參與碳氫化合物生物降解的基因在種植園污染土壤中表達最為豐富，說明物種間的相互作用在污染物修復中具有越來越重要的意義.宏基因組學分析代表根際中微小數量的真核生物，而轉錄組學分析顯示超過25%的真核生物能夠被讀取，這可能對受污染土壤根際的微生物功能起到重要指導作用[90].由此，宏基因組-轉錄組學方法的結合可能會解釋根際微生物群在污染場地根際修復中的相對有效性.

2.3 根際科學中蛋白組學研究

蛋白組學對給定時間直接從環境樣本中回收的所有蛋白質進行分析[101]，在土壤研究方面有一定的優勢.首先，由于mRNA 和蛋白質豐度之間的弱相關性，以及mRNA 轉錄后處理和修飾的復雜性，即使是基于核酸的方法也受到很大限制[102].其次，根際土壤中的生物過程也很復雜，不僅受到微生物的驅動，還受到生態系統中動植物的驅動，擴展土壤蛋白質鑒定對于理解土壤生態過程和影響根際土壤生態系統功能的環境因素至關重要[103].根際土壤蛋白質組學在蛋白水平上為土壤生態系統的生物過程提供了直接證據.因此，蛋白質組學可以作為研究根際土壤生物學的重要工具.

蛋白組學在根際中研究中的應用非常有限.Wang 等[104]建立了一種適用于不同土壤蛋白質的提取方法，利用雙向凝膠電泳（2-DE）鑒定出接近1000 個具有高重現性的單獨斑點，通過MALDI-TOF/TOFMS 成功識別了水稻土壤中122 種蛋白質的189 個斑點.對蛋白質組解析，發現根際大約三分之一的蛋白質點無法鑒定，且來自植物的保守蛋白構成了根際蛋白質組的特征分布；蛋白的功能揭示了土壤生物群落中涉及的各種代謝途徑和信號轉導，證實作物根際土壤中植物和微生物之間復雜的相互作用，為土壤生物學的宏蛋白質組學研究提供了一個范式.隨后，Wu 等[105]發展了根際土壤的比較元蛋白質組學，闡釋了糯稻連作障礙的潛在機制.根際土壤蛋白組學分析表明來源于植物和微生物的蛋白質在根際土壤生態系統的養分循環和能量流動中起著重要作用.進一步分析，發現根際土壤與非根際土壤中有33 個差異表達的蛋白質點.Hultman 等[106]在多年凍土中鑒定出7000 種蛋白質，無論是本體土壤還是根際土壤，其微生物多樣性都遠高于永久凍土；與低生長凍土相比，由于這些土壤類型中微生物的生長速率更高，散裝土壤和根際土壤中獨特蛋白質的數量可能比永久凍土多1 個數量級[107].迄今，蛋白質組學還被用于表征與凋落物分解相關的根際[108]、水稻根際/根組織中的甲烷諾菌[109]、作物根際[104，110]和黑塊菌[111].水稻葉際、植物地上部和根際宏蛋白質組學分析識別了約4600 種蛋白質，主要功能涉及產甲烷和甲烷氧化.

同樣，根際蛋白組學也是一種相對較新的方法，它面臨著許多需要解決的經驗、技術、計算和實驗設計等挑戰.根際存在高度的生物多樣性、蛋白質冗余以及蛋白提取困難等普遍問題[112].由于生物體含有與其他許多蛋白質相似的冗余肽，通過將蛋白質消化成肽，其特異性喪失.這一挑戰將基于自下而上的蛋白組學方法簡化為一種主要用于評估相關生物群中蛋白質變化的技術.另一個值得注意的點是，自下而上蛋白質組學方法傾向于檢測來自高度翻譯蛋白質的肽，如核糖體蛋白、伴侶蛋白和其他參與細胞維持的蛋白.該方法測量完整的蛋白質，可以緩解冗余問題.因此，自上而下的蛋白組學為根際研究提供了另一個直接的機遇.即可以通過更佳的蛋白質組提取方法和分餾，降低肽的復雜性，提高蛋白質組的覆蓋率.聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）與下游代謝組學分析不兼容.一種從根際土壤中同時提取代謝物、蛋白質和脂質的新方法提供了改進的可能[113].進一步，在線2D 分離，包括直接電噴霧到質譜儀中的強陽離子交換，或高/低pH 反相的二維分離，也可以提高蛋白覆蓋率[114?115].這些附加的分離技術降低了質量分析儀的復雜性，允許對單個蛋白質的覆蓋范圍進行更多檢測.使用同位素標記相對和絕對定量（iTRAQ）以及串聯質量標簽（TMT）等標準肽標記方法不可能實現在一次分析中運行多個樣本[116?117].此外，根際土壤樣品的基質中含有豐富的腐殖酸，這阻礙了有效標記.而無標記樣本無法多路復用，復接超蛋白質組學樣品的首選方法是向微生物群落提供同位素標記的底物（例如13C、15N、18O 和2H），直接為根際和/或土壤樣品中的定量蛋白質組學標記蛋白質[118].

2.4 多組學整合在根際科學中的研究

單一組學分析產生的數據僅僅提供了單一層次的理解，而生物數據集是異構的，因此需要多層網絡關聯來理解交互式作用，以概述生物學機制.多組學的整合使用整體而不是簡化的生物學研究方法，在單個生物體和多生物體群落中，利用來自基因組、轉錄組、蛋白組和代謝組等，集成多個組學數據集信息[119].目前，根際復雜的相互作用的研究局限于嘗試通過單一組學的方法來闡釋[120]，對根際科學中多組學方法的潛力僅僅進行了初步探討.例如：聯合DNA、mRNA 和蛋白組的多組學方法，Hultman 等[106]全面探索了永久凍土的微生物組，該研究是通過單獨處理每個組，然后整合使用比率、基因組可視化和雙標圖來揭示所有組學的多重益處.多組學研究往往使用各種儀器直接收集和測量數據，至少分子生物學的“中心法則”：即遺傳信息從DNA 到RNA 到蛋白質的流動仍適用，同時需要考慮多變量統計數據進行測量、分析和整合各組學.Larsen 等[121]的研究從基因組、蛋白質-蛋白質相互作用、DNA 結合基序和蛋白質組的先驗知識與基于實驗室的共培養和轉錄組學結合，以獲得多組學關聯結果，為植物-菌根相互作用提供了一個極好的框架，用于以綜合的整體方法對各種組學進行建模.同時，基于網絡分析和基于聚類方法是整合多個組學研究結果最流行的方法.Bersanelli 等[122]和de Keersmaecker 等[123]分別從數學和單一微生物基因組的角度對此進行了綜述.此外，多組學將所獲得的不同組學的信息關聯，從整體研究生物系統對基因或環境變化的響應網絡，有助于對機理的全面揭示.Haas 等[124]推薦了多組學方法，詳細闡述了基因組學、宏轉錄組學和宏基因組學作為戰略構建技術，以了解和豐富植物的根際，利用植物細菌相互作用來改善多環芳烴（PAHs）降解，在機理闡釋的基礎上作者提出并描述了使用組學方法對PAHs 降解的根際微生物組進行工程改造的前景.

雖然，多組學技術在根際科學中應用前景廣闊，但新技術也面臨一些困難和需要挑戰的方面.首先，根際存在的大量微生物組，它們相互連接形成的微生物網絡不僅與植物直接相互作用，也受根系分泌組分的驅動[125].由此，根際組學的數據體量大，數據整合異常復雜.其次，組學數據分布不規則,具有稀疏性，為確保統計學的有效性和可靠性，分析根際組學需要每個樣本有更多的重復[126]，這給根際組學的數據質量和數據管理帶來新挑戰.再者，組學中軟件的大批數據是可用的，但不能充分分析和挖掘，即軟件本身存在系統性問題，阻止了數據的有效利用.并且，傳統的信息數據處理算法已不能滿足大數據的處理要求.因此，多組學的大數據整合分析需要不斷地更新軟件、開發新算法和優化新方法[120，127].總之，多組學方法還存在著前期的實驗設計和樣品采集與制備，中期的數據文庫系統的完善，后期生物學意義的闡釋等多方面的挑戰[128].

3 總結和展望（Research Outlook）

根土界面的化學反應與生物過程復雜.根際滲出物的化學表征和量化在很大程度上是一個分析挑戰.根際科學正在迅速向跨學科方法過渡，需要多學科領域的交叉合作，包括化學、生物學、生物信息學、土壤學、數學、統計學和計算機科學等.針對土壤“黑箱”，傳統的研究方法大大低估了根際化學和生物的多樣性及其關聯.近年，組學技術的出現將會推進根際科學的快速進展.本文綜述了根際傳統的化學與微生物分析方法，并重點討論了新型組學技術在根際科學中應用進展與挑戰.針對目前國內外研究的現狀以及存在的問題，對本文作出如下總結和展望：

（1）全面了解根際化學多樣性才能更好地理解根際界面過程.依靠光譜技術、色譜的分離手段以及傳統的低分辨質譜分析方法，過去關于根系分泌物的檢測只實現了對有限化合物的識別與鑒定.傳統的研究方法遠遠無法解析根際分子組成的多樣性.亟需開發和應用先進的采樣程序，結合高選擇性和高靈敏度的分析技術，準確量化根釋放的多種化合物，開發研究自然條件下根際生態的新方法，完整理解根際動態過程.

（2）由于微生物的數量多樣性，根際土壤代表了一個異常復雜的生態系統.傳統的根際微生物培養法尚不能提供有關微生物種群結構和功能多樣性的詳細信息.典型的聚合酶鏈反應方法，逐漸被高速發展的高通量測序技術所替代.

（3）組學技術為根際科學的研究提供了良好的契機.基于高分辨質譜技術的組學方法已成為代謝物鑒定的重要手段，有助于深入揭示根際化學多樣性過程.而基于宏基因組學、轉錄組學和蛋白組學等組學手段是研究根際微生物多樣性的有力手段.它們能夠識別基因、轉錄物和蛋白質，提供根際微生物組成及微生物組基因和蛋白的表達、功能特性等更詳細的信息，全面揭示根際微生物的多樣性.

（4）盡管單一組學技術可以表征根際化學和生物多樣性豐富的信息，但是多組學的整合更是一種強有力的工具.多組學技術能夠將根際微域群落結構的不同數據集與微生物功能、表達、翻譯及最終的代謝物關聯起來，有助于深層次挖掘根-微生物-土壤界面的大量尚未揭示的關鍵過程與機制.

（5）目前多組學技術在根際科學中的研究面臨數據規模龐大、平行樣品和大數據管理復雜、軟件開發、模型構建、算法更新等直接的挑戰.但總得說來，根際科學為多組學方法的應用提供了巨大的潛力.因此，應該強調的是，未來需要開發和應用先進的取樣程序，發展更多的模型、框架和計算基礎來實現根際多組學的全面整合.