壬二酸和水楊酸對痤瘡丙酸桿菌誘導的細胞炎癥因子及TLR4 蛋白表達的影響

宋莎莎，王永芳，陳毅，李新宇

中國醫學科學院 北京協和醫學院 皮膚病研究所，江蘇 南京 210042

痤瘡是皮膚科常見的一種慢性炎癥性疾病，主要發生于顏面和胸背多脂區，臨床主要表現為粉刺、丘疹、膿皰和結節等多形性皮損，好發于青春期，對青少年的心理和社交影響很大[1]。痤瘡的發病機制主要包括皮脂腺大量分泌，毛囊皮脂腺導管上皮過度角化，微生物尤其是痤瘡丙酸桿菌Propionibacterium acnes的定殖及炎癥和免疫反應。機體免疫細胞如角質形成細胞、單核細胞等在抵抗P.acnes等入侵過程中釋放白細胞介素（IL）-1、IL-8 和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等炎癥因子，這些炎癥因子將炎癥細胞趨化至毛囊周圍，引起炎性損傷[2]。

壬二酸又名杜鵑花酸，是一種來自杜鵑花的天然含有9 個碳原子的飽和直鏈二羧酸。壬二酸的抗炎和抗氧化特性已被證實，其外用可以治療酒糟鼻、尋常痤瘡、黃褐斑和炎癥后色素沉著等疾病[3]?！吨袊畀徶委熤改希?019 修訂版）》推薦壬二酸是輕中度痤瘡的二線外用藥[4]。水楊酸最早是從柳樹皮中提取出的天然活性成分，屬于β-羥基酸，因其具有較好的脂溶性，更易深入毛囊皮脂腺深部而溶解粉刺，被廣泛用于治療痤瘡和脂溢性皮炎等疾病[5]。本研究體外觀察壬二酸和水楊酸對P.acnes的胞壁成分肽聚糖（PGN）和脂磷壁酸（LTA）、熱滅活P.acnes以及佛波醇酯（PMA）和細菌脂多糖（LPS）分別誘導的人角質形成細胞HaCaT 和人單核細胞THP-1 產生炎癥因子的影響，通過分子對接技術分析2 種藥與Toll樣受體4（TLR4）蛋白間的相互作用模式以及實驗驗證對HaCaT 細胞表面TLR4 蛋白表達的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料

壬二酸（質量分數99.15%，上海易恩化學技術有限公司，批號RH244687）；水楊酸（質量分數99.7%，山東新華制藥股份有限公司提供，批號21036）；人角質形成細胞永生化細胞株HaCaT、人單核細胞株THP-1（本室維持保存）；P.acnes（ATCC6919，本室維持保存）；PGN、LTA、PMA、LPS（美國Sigma 公司，貨號分別是69554、L3265、P1585、L4130）；DMEM、RPMI 1640 培養基、胎牛血清、2-巰基乙醇（美國Gibco 公司）；腦心浸出液肉湯（BHI，青島高科園海博生物技術有限公司）；人IL-8、IL-1β 和TNF-α ELISA 試劑盒（北京四正柏生物科技有限公司）；4%多聚甲醛（南京森貝伽生物科技有限公司）；TLR4 抗體（美國Santa cruz 公司）；Cell Counting Kit-8、Triton X-100、山羊血清、Alexa Fluor 488 標記山羊抗小鼠IgG（H＋L）、辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG（H＋L）、DAPI 染色液、BCA 蛋白定量試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；ECL 顯色液（美國Thermo Fisher Scientific公司）；厭氧產氣袋和密封培養罐（日本三菱MGC）。酶標儀（瑞士Tecan 公司）；激光掃描共聚焦顯微鏡（日本Olympus 公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 HaCaT細胞用含10%胎牛血清的DMEM 培養基培養，THP-1 細胞用含10%胎牛血清、0.05 mmol/L 2-巰基乙醇的RPMI 1640 培養基培養，培養條件為37 ℃、5% CO2，并以1∶3 每隔2～3 d 傳代1 次，取處于對數生長期的細胞用于后續實驗。

1.2.2 滅活P.acnes的制備 挑取在厭氧條件下血瓊脂平皿中維持培養的P.acnes菌落接種于BHI 培養基，37 ℃厭氧環境下培養24 h，收集菌落，用無菌PBS 洗3 次，4 ℃下以4 000 r/min 離心15 min，調整菌液濃度至4.5×107CFU/μL，置于80 ℃水浴中滅活30 min。

1.2.3 細胞增殖活力 HaCaT細胞以2×105個/mL接種于96 孔培養板，0.1 mL/孔，培養過夜后棄去孔內培養基，加入各濃度藥液0.2 mL；THP-1 細胞以3×105個/mL 接種于96 孔培養板，0.1 mL/孔，培養過夜后每孔加入各濃度藥液0.1 mL。每組設4 個復孔，培養48 h 后加入10 μL CCK-8 溶液，于培養箱中孵育4 h，用酶標儀在450 nm 波長處檢測吸光度（A）值。

細胞存活率＝A給藥/A對照

1.2.4 HaCaT 細胞培養上清液中IL-8 含量 PGN＋LTA 誘導實驗設置為對照組（僅加培養基）、模型組（加培養基和刺激劑）、溶媒組（加含溶媒培養基和刺激劑）、壬二酸（62.50、31.25、15.63、7.81、3.91 μg/mL）組和水楊酸（31.25、15.63、7.81、3.91、1.95 μg/mL）組；P.acnes誘導實驗設置為對照組、模型組、溶媒組、壬二酸（62.50、31.25、15.63、7.81 μg/mL）組和水楊酸（31.25、15.63、7.81、3.91 μg/mL）組。細胞以3×105個/mL 接種于96 孔細胞培養板，0.1 mL/孔，培養6 h 后更換無血清培養基進行饑餓培養，次日棄去孔內培養基，加入不同質量濃度的藥液0.1 mL/孔，孵育16 h 或6 h 后，棄去孔內溶液，加入PGN＋LTA（終質量濃度 12.5 μg/mL＋12.5 μg/mL）和不同質量濃度藥液共同作用24 h，或P.acnes（終濃度2.25×109CFU/mL）和不同質量濃度藥液共同作用48 h，收集細胞上清液，按ELISA 試劑盒說明檢測細胞培養上清液中IL-8 含量。

1.2.5 THP-1 細胞培養上清中IL-1β 和TNF-α 含量 PMA＋LPS 誘導實驗設置為對照組、模型組、溶媒組、壬二酸（1 000.00、500.00、250.00、125.00、62.50、31.25 μg/mL）組和水楊酸（500.00、250.00、125.00、62.50、31.25 μg/mL）組；P.acnes誘導實驗設置為對照組、模型組、溶媒組、壬二酸（1 000.00、500.00、250.00、125.00 μg/mL）組和水楊酸（500.00、250.00、125.00、62.50 μg/mL）組。細胞用無血清RPMI 1640 培養基調整成12×105個/mL 或6×105個/mL 細胞懸液接種96 孔培養板，加入不同質量濃度的藥液孵育18 h 或6 h，繼續加入PMA＋LPS（終質量濃度100 ng/mL＋500 ng/mL）和不同質量濃度藥液共同作用48 h，或加入P.acnes（終濃度2.25×109CFU/mL或2.25×108CFU/mL）和不同質量濃度藥液共同作用48 h，收集細胞上清液，按ELISA 試劑盒說明檢測細胞培養上清液中IL-1β 和TNF-α 含量。

1.2.6 分子對接分析壬二酸、水楊酸與TLR4 蛋白受體的分子間相互作用模式 利用PubChem 數據庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）分別下載壬二酸、水楊酸的化學結構文件，再導入Chem 3D（v15.0）軟件生成3D 化學結構并使其能量最小化。通過RCSB PDB 數據庫（https://www.rcsb.org/）下載TLR4蛋白的晶體結構文件，采用PyMOL 軟件去除蛋白結構中的溶劑和有機物，然后利用AutoDock（v4.2.6）軟件對蛋白結構進行加氫、計算電荷、添加原子類型。由Autodock vina 分別實施壬二酸、水楊酸和TLR4 蛋白受體的分子對接，再利用PLIP 分別分析壬二酸、水楊酸和TLR4 蛋白受體對接的分子間相互作用模式，最后通過PyMOL 軟件可視化結果。

1.2.7 細胞免疫熒光檢測TLR4 蛋白表達 HaCaT細胞懸液1 mL（1×105個/mL）接種于直徑15 mm玻底培養皿，待細胞貼壁后加入藥液（壬二酸62.50 μg/mL、水楊酸31.25 μg/mL）孵育16 h，棄去孔內藥液后加入PGN＋LTA（終濃度50 μg/mL＋50 μg/mL）或P.acnes（終濃度2.25×109CFU/mL）及配制好的藥液（壬二酸62.50 μg/mL、水楊酸31.25 μg/mL），繼續作用24 h。無菌PBS 漂洗3 次，經4%多聚甲醛固定、0.5% Triton X-100 破膜、10%山羊血清封閉后，加入TLR4（1∶50）抗體，置4 ℃過夜，棄一抗，PBS 清洗，加入Alexa Fluor 488 標記山羊抗小鼠IgG（1∶500），避光孵育1 h，DAPI 核染5 min，激光共聚焦顯微鏡（×100）觀察并拍照。

1.2.8 壬二酸和水楊酸組合物對不同刺激劑誘導HaCaT 產生IL-8 及THP-1 細胞產生IL-1β 和TNF-α的影響 將壬二酸和水楊酸按15∶1 的比例配制成組合物，即質量濃度為125.00、62.50、31.25、15.63、7.81、3.91 μg/mL。組合物對不同刺激劑誘導后HaCaT細胞產生IL-8 以及THP-1 細胞產生IL-1β 和TNF-α的影響，實驗步驟同1.2.4 和1.2.5。

1.3 統計學方法

采用SPSS 25.0 軟件進行統計分析，通過單因素方差分析比較總體的組間差異，再采用LSD-t檢驗進行兩兩比較。

2 結果

2.1 壬二酸和水楊酸對HaCaT 和THP-1 細胞增殖的影響

細胞分別經62.50～1 000.00 μg/mL 的壬二酸和水楊酸作用48 h 后，發現壬二酸質量濃度為1 000.00、500.00 μg/mL 時，HaCaT 細胞的存活率分別為16%、35%，而壬二酸質量濃度為250.00 μg/mL 及以下時，HaCaT 細胞的存活率均高于75%；相同受試質量濃度范圍內的壬二酸對THP-1 細胞活力無明顯影響。1 000.00 μg/mL 水楊酸作用48 h，HaCaT 細胞存活率為43%，THP-1 細胞存活率為61%，而在500 μg/mL 及以下質量濃度，2 種細胞的存活率均高于75%，見圖1。

圖1 CCK-8 法檢測藥物作用48 h 對HaCaT 細胞和THP-1 細胞增殖的影響（，n＝3）Fig.1 Effect of drugs on the cell proliferation in HaCaT and THP-1 cells by CCK-8 method (，n＝3)

因此，在后續的HaCaT 細胞實驗中，選擇壬二酸62.50 μg/mL、水楊酸31.25 μg/mL 為最大實驗質量濃度；THP-1 細胞實驗中壬二酸的最大實驗質量濃度為1 000.00 μg/mL，水楊酸為500.00 μg/mL。

2.2 壬二酸和水楊酸對不同刺激劑誘導后HaCaT細胞產生IL-8 的影響

如圖2 所示，不同受試濃度的壬二酸、水楊酸對PGN＋LTA 或熱滅活P.acnes誘導后HaCaT 細胞產生IL-8 均表現出一定的抑制作用，PGN＋LTA誘導后，壬二酸：半數效應濃度（EC50）為5.17 μg/mL，水楊酸EC50為3.50 μg/mL。熱滅活P.acnes誘導后，壬二酸EC50為2.76 μg/mL，水楊酸EC50為2.80 μg/mL。且隨著藥物濃度的增加，IL-8 含量明顯下降，抑制作用呈劑量相關性。

圖2 壬二酸和水楊酸對PGN＋LTA（A）或熱滅活P. acnes（B）誘導后的HaCaT 細胞產生IL-8 的影響（，n＝3）Fig.2 Effects of azelaic acid and salicylic acid on IL-8 production in HaCaT cells induced by PGN+LTA (A) and heat inactivated P. acnes (B) stimulants (，n＝3)

2.3 壬二酸和水楊酸對不同刺激劑誘導后THP-1細胞產生IL-1β 和TNF-α 的影響

如圖3 所示，不同受試濃度的壬二酸、水楊酸對PMA＋LPS 或熱滅活P.acnes誘導后的THP-1 細胞產生IL-1β 和TNF-α 均有一定的抑制作用。PGN＋LTA 誘導后壬二酸抑制THP-1 細胞產生IL-1β，壬二酸EC50為1.05 μg/mL，水楊酸EC50為2.16 μg/mL，PGN＋LTA 誘導后壬二酸抑制THP-1 細胞產生TNFα，壬二酸EC50為3.74 μg/mL；水楊酸的抑制率均＞90%；熱滅活P.acnes誘導后抑制THP-1 細胞產生IL-1β 中，壬二酸EC50為3.04 μg/mL，水楊酸EC50為2.17 μg/mL；熱滅活P.acnes誘導后抑制THP-1 細胞產生TNF-α 中，壬二酸EC50為4.05 μg/mL，水楊酸EC50為3.02 μg/mL。且隨著藥物濃度的增加，IL-1β 和TNFα 含量均明顯下降，呈量效關系。

圖3 壬二酸和水楊酸對PMA＋LPS（A）或熱滅活P. acnes（B）誘導后THP-1 細胞產生IL-1β 和TNF-α 的影響（，n＝3）Fig.3 Effects of azelaic acid and salicylic acid on expression of IL-1β and TNF-α in THP-1 cells after induced by PMA+LPS(A) and heat inactivated P. acnes (B) stimulants (，n＝3)

2.4 壬二酸和水楊酸與TLR4 蛋白的分子間相互作用模式分析

如圖4 所示，壬二酸可通過氫鍵、疏水相互作用、鹽橋相互作用與TLR4 蛋白受體結合，親和力為?27.72 kJ/mol；水楊酸可通過氫鍵、疏水相互作用、鹽橋相互作用、π-堆積（平行）作用與TLR4 蛋白受體結合，親和力為?31.5 kJ/mol。結果表明，壬二酸、水楊酸均能與TLR4 蛋白受體有效地結合。

圖4 壬二酸和水楊酸與TLR4 蛋白受體的分子對接Fig.4 Molecular docking of azelaic acid,salicylic acid and TLR4 protein receptor

2.5 壬二酸和水楊酸處理后對HaCaT 細胞表面TLR4 蛋白表達的影響

與對照組相比，PGN＋LTA 或P.acnes刺激后細胞表面TLR4 蛋白熒光強度明顯增高（P＜0.01），62.50 μg/mL 壬二酸預處理后，PGN＋LTA 刺激的HaCaT 細胞表面TLR4 蛋白表達明顯降低（P＜0.01）；而31.25 μg/mL 水楊酸預處理后能明顯降低滅活后的P.acnes誘導的細胞表面TLR4 蛋白表達（P＜0.05），見圖5、6。

圖6 壬二酸和水楊酸對不同刺激劑誘導后HaCaT 細胞TLR4 相對蛋白表達量的影響（，n＝3）Fig.6 Effects of azelaic acid and salicylic acid on relative protein level of TLR4 in HaCaT cells induced by different stimulants (，n＝3)

2.6 壬二酸和水楊酸及兩者15∶1 組合物對刺激劑誘導后炎癥因子EC50 值比較

根據ELISA 結果計算EC50值發現，對PGN＋LTA 聯合刺激以及P.acnes滅活菌誘導HaCaT 細胞產生IL-8，兩者聯合應用后效價強度增高，同時組合物對于P.acnes滅活菌誘導THP-1 細胞產生IL-1β 的抑制作用也表現出顯著的聯合應用優勢，見表1。

表1 壬二酸和水楊酸及兩者組合物對刺激劑誘導后炎癥因子EC50 值比較Table 1 Comparison on EC50 values of azelaic acid,salicylic acid and their mixture on inflammatory factor induced by stimulants

3 討論

痤瘡俗稱粉刺、青春痘，是一種累及毛囊皮脂腺的慢性炎癥性皮膚疾病，發病因素較多，主要影響皮脂腺豐富的區域，嚴重的可導致疤痕和毀容，是一種對患者的心理和身體健康有較大影響的疾病。P.acnes是體表的正常菌群之一，為革蘭陽性厭氧菌，是痤瘡發病和炎癥維持的關鍵因素之一。P.acnes通過激活與痤瘡相關的關鍵細胞上Toll 樣受體（TLRs）表達，可轉錄激活轉錄因子蛋白家族（NFκB）信號通路，誘導下游促炎細胞因子如IL-1、IL-8、IL-6 和TNF-α 等表達，引起炎癥反應[6]，是天然免疫系統的重要模式識別分子。角質形成細胞是人類皮膚中抵御外源性病原體的第一道屏障，細胞中TLRs 可識別廣泛的微生物或其成分的配體，包括PGN、LTA、LPS 和細菌脂蛋白等[7]。P.acnes的主要胞壁成分PGN 和LTA 能刺激免疫細胞釋放炎癥介質，LPS 作為革蘭陰性菌的組成部分亦是一種免疫刺激因子[8]。TLR4 是角質形成細胞表面存在的TLRs 中的一個亞型。過往研究報導LPS 和LTA 均能觸發TLR4 的激活，導致下游IL-8 產生的級聯反應[9-10]。本研究中細胞免疫熒光結果也已證實，給予PGN＋LTA 聯合應用刺激，或用滅活P.acnes刺激后均能上調HaCaT 細胞表面TLR4 蛋白的表達。

痤瘡的治療主要包括口服藥、外用藥及物理治療等，外用藥治療中的維甲酸應用較多，但該藥易引起局部刺激?？股貙︷畀彽闹委熾m然有效，但隨之而來的耐藥性亦成為一個巨大的挑戰[11-12]，尋找和使用安全有效的局部用藥一直是臨床治療痤瘡的重要需求。

壬二酸具有多種藥理作用，能夠抑制線粒體代謝和微生物蛋白的合成，具有抗炎、抗菌以及改變毛囊表皮過度增殖和炎癥反應等活性，有利于痤瘡的治療[13-15]。作為一種非甾體類、亦具有抗炎活性的物質，水楊酸還有抑制真菌和細菌的作用，同時具有低濃度下調節角質細胞、高濃度松解剝脫角質細胞能力及美白作用，它在治療痤瘡的同時也對痤瘡炎癥后的色素沉著有淡化作用[16-17]，因此應用較為廣泛。但是2 種藥物治療痤瘡的機制有必要進一步研究。本研究結果表明，壬二酸和水楊酸對P.acnes成分PGN＋LTA，或P.acnes本身誘導的HaCaT 細胞產生IL-8，以及THP-1 細胞產生IL-1β 和TNF-α，均具有較強的抑制作用。分子對接結果表明，壬二酸、水楊酸均能與TLR4 蛋白受體有效地結合。體外實驗進一步表明，壬二酸、水楊酸對上述刺激劑誘導下的HaCaT 細胞表面TLR4 蛋白的表達也有明顯的下調作用，這些結果均提示，壬二酸和水楊酸能抑制P.acnes引起的角質形成細胞表面TLR4 蛋白的表達，以及下游促炎因子IL-8 的產生，和抑制P.acnes誘導的單核細胞IL-1β 和TNF-α 的產生，這可能是2 種藥物在臨床上治療痤瘡有效的機制之一。

另外，本研究還發現將壬二酸和水楊酸按15∶1聯合處理細胞后，再測定PGN＋LTA 或P.acnes誘導的HaCaT 細胞產生IL-8 的水平以及P.acnes誘導的THP-1 細胞IL-1β 的產生，發現聯合用藥時的效價強度優于單獨用藥。這一結果也提示，壬二酸與水楊酸的聯合作用可能更有利于發揮痤瘡治療中的抗炎效果。在痤瘡治療中壬二酸可能對皮脂的產生并不表現抑制作用[18]，而水楊酸為一種脂溶性物質，它可與毛囊中的表皮脂質和皮脂腺脂質相溶，具有良好的溶解角質和消除粉刺的特性[19-20]，結合以上的結果，本研究將壬二酸與水楊酸聯合應用，不僅利用了各自的作用特點，同時在對抗痤瘡促炎因子的產生中更有優勢。

綜上所述，壬二酸和水楊酸能抑制P.acnes引起的角質形成細胞和單核巨噬細胞中促炎因子的產生，同時還能減少角質形成細胞表面TLR4 蛋白的表達，從而發揮治療痤瘡的作用。2 種藥物聯合應用后治療痤瘡的其他機制仍值得深入探討。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突