虛擬篩選葒草素和異葒草素降血糖靶點和體外活性評價

趙晨穎 ，韓雪 ，賀一凡 ，史海龍，王斌，衛昊，史永恒*，劉繼平

1.陜西中醫藥大學，陜西 咸陽 712046

2.陜西省中醫藥管理局 中藥藥效機制與物質基礎重點研究室，陜西 咸陽 712046

糖尿病是以機體對糖利用效率降低引起的血糖過高為主要特征的代謝性疾病，進而引起蛋白質和脂肪代謝異常，后期會逐漸導致眼、心、腦、腎、足等多器官急慢性并發癥。2015—2017 年我國18歲及以上人群糖尿患病率為11.2%，達1.56 億人[1]。因此，尋找治療糖尿病的藥物是藥物研究的熱點。

葒草素和異葒草素是一類黃酮碳苷類化合物，為蓼科植物葒蓼PolygonumorientaleL.的主要活性成分，在西番蓮、決明、黃荊、竹葉、滿天星、麻花艽等中藥材中也存在。近年來的藥理學研究表明，葒草具有豐富的藥理活性，其主要活性成分葒草素和異葒草素具有心血管保護、抗衰老、抗腫瘤、抗炎、調血糖等藥理作用[2-4]。葒草素和異葒草素可以改善脂肪細胞中的葡萄糖代謝，維持肝細胞的底物利用率來改善胰島素抵抗現象已被證實[5]，但關于其降血糖的靶點及體外活性研究較少。

本研究擬通過虛擬分子對接篩選中藥葒草中黃酮碳苷類有效成分葒草素和異葒草素可能的降血糖靶點，并對關鍵靶點進行體外活性測試，從而揭示葒草素和異葒草素降血糖作用及其作用機制。

1 材料

1.1 藥品及主要試劑

葒草素（成都曼思特化學制劑有限公司，質量分數≥98%，批號20171105）；異葒草素（成都曼思特化學制劑有限公司，質量分數≥98%，批號20171105）；熒光脫氧葡萄糖（1-NBDG，藥明康德新藥開發有限公司，批號ET4099-7-P1）；達格列凈（上海瀚香生物科技有限公司，批號2014102202）；4-硝基苯基-α-D-葡萄糖苷（PNPG，成都華娜化學制劑有限公司，批號20171026）；阿卡波糖（成都艾娜華化學制劑有限公司，批號20170828）；DMEM培養基（武漢賽維爾生物科技有限公司，批號GP21110161645）；胰蛋白酶（武漢賽維爾生物科技有限公司，批號CR2112015）；磷酸緩沖液（武漢普諾賽生命科技有限公司，批號WH0022A071）；氯化膽堿、氯化鉀、氯化鎂、氯化鈣（天津市天力化學試劑有限公司）。

1.2 細胞

穩定過表達鈉–葡萄糖協同轉運蛋白 2（SGLT2）的HEK293（人胚胎腎上皮細胞），穩定高表達蛋白酪氨酸磷酸酶1B（PTP1B）的293T 細胞（人胚腎細胞），由中國醫學科學院協和細胞中心提供。

1.3 儀器

Radiance 2100 CLSM 激光共聚焦掃描顯微鏡（Bio-Rad 公司），MCO-15AC CO2培養箱（Sanyo 公司），Enspire 熒光酶標儀（Perkinelmer 公司）。

2 實驗方法

2.1 分子對接

從www.rcsb.org 網站依次下載糖尿病相關靶點在 Schr?dinger 軟件中對受體結構用 Protein Preparation Wizard 模塊分別進行加氫、加電荷、去除結晶水等處理，并采用Glide 模以原配體為中心（GPR40 和SGLT2 以文獻報道活性位點殘基為中心）生成格點文件；采用LigPrep 模塊對配體進行處理，采用Epik 方法生成pH（7±2）的所有可能構象，采用Glide 模塊以標準精度進行分子對接，得出分子對接結果，并計算陽性對照物與葒草素/異葒草素的分子對接得分差異度。

得分差異度＝（陽性對照物得分－葒草素/異葒草素對接得分）/陽性對照物得分

2.2 體外抑制SGLT2 活性實驗

本研究采用穩定過表達SGLT2 的人胚腎細胞（HEK293）模型，并以1-NBDG 為底物進行葡萄糖轉運實驗，采用文獻報道[6]的方法初步評價化合物對HEK293 細胞SGLT2 攝取功能的抑制強度。

將濃度為3×108個/L 的過表達SGLT2 的HEK293 細胞按100 μL/孔細胞鋪板，90%融合后，采用低糖無血清DMEM 培養基處理2 h 后，用非特異性攝取緩沖液（Na+-free buffer）/Na+依賴性攝取緩沖液（Na+-buffer）清洗1 遍，再加入含有1-NBDG（100 μmol/L）的攝取液進行葡萄糖攝取。

在上述培養板中按50 μL/孔依次加入葒草素、異葒草素和達格列凈（3 個平行濃度）溶液，濃度均為1×10?5mol/L，在37 ℃下攝取4 h；然后加入含有0.5 mmol/L 根皮苷的攝取緩沖液使反應停止；在熒光顯微鏡下觀察細胞內熒光強度。將0.1 mol/L NaOH 裂解細胞轉移至底部透明的96 孔黑板中，采用熒光酶標儀檢測細胞內1-NBDG 含量（激發波長/發射波長：485 nm/535 nm）。采用熒光酶標儀檢測細胞裂解液的熒光強度，結果以熒光強度/蛋白含量來表示。

2.3 體外抑制α-葡萄糖苷酶活性實驗

采用文獻報道的方法[7-8]評價葒草素和異葒草素對α-葡萄糖苷酶的抑制活性。實驗將分為對照組、葒草素（100 μmol/L）組、異葒草素（100 μmol/L）組、阿卡波糖（100 μmol/L）組，在160 μL 的96 孔板開展，每組3 個平行孔。將20 μL 0.1 mol/L 磷酸緩沖液（pH 7.0）、20 μL 底物溶液（2.5 mmol/L pNPG溶于0.1 mol/L 磷酸緩沖液）和20 μL 100 μmol/L 待測藥物依次加入孔中，混勻，在37 ℃水浴中振蕩10 min 后，再加入20 μL α-葡萄糖苷酶溶液（在含有0.2% BSA 的0.01 mol/L 磷酸緩沖液中加入0.2 U/mL α-葡萄糖苷酶，溶解），充分混勻，然后放入37 ℃水浴中反應20 min。結束后加入80 μL 0.2 mol/L 碳酸鈉溶液中止反應，采用酶標儀在405 nm處測定其吸光度（A），最后根據公式計算出各樣品的抑制率。

抑制率＝1－（A受試－A空白）/（A對照－A空白）

2.4 體外抑制PTP1B 活性實驗

采用文獻報道的方法[9]測定葒草素和異葒草素對PTP1B 的抑制活性。本實驗分為對照組、葒草素（100 μmol/L）組、異葒草素（100 μmol/L）組、陽性對照化合物V[10]（100 μmol/L）組，PTP1B 酶稀釋至0.5 ng/μL 待用，以pNPP 作為PTP1B 的底物，每組3 個平行孔。在160 μL 的96 孔板中，將10 μL待測物與5 μL PTP1B 于室溫下共孵5 min，后依次加入35 μL 反應液（含有50 mmol/L HEPES、5 mmol/L DTT、150 mmol/L NaCl、2 mmol/L EDTA）和50 μL pNPP 溶液（2 mmol/L，pH 7.0），在30 ℃下孵育10 min，加入25 μL 3 mol/L 氫氧化鈉溶液終止酶反應。水解產物對硝基苯酚鈉在405 nm 處有很強的光吸收，采用酶標儀測定405 nm 處的A，根據公式計算出各樣品的抑制率。

抑制率＝1－（A受試－A空白）/（A對照－A空白）

2.5 統計學分析

3 結果

3.1 葒草素和異葒草素與糖尿病相關靶點的分子對接結果

從www.rcsb.org 網站下載糖尿病相關靶點的晶體結構，見表1。葒草素和陽性對照物與糖尿病靶點的分子對接結果以結合能表示見表2，其中SGLT2、α-葡萄糖苷酶與陽性對照物達格列凈和阿卡波糖的分子對接結果分別?9.79 kcal/mol（1 cal＝4.4 J）、?5.58 kcal/mol；而葒草素與SGLT2 和α-葡萄糖苷酶對接得分分別為?9.32 kcal/mol、?5.67 kcal/mol，其與陽性對照物得分差異度分別為4.80%、1.59%，分子對接結果差異度小。其中葒草素與SGLT2 中的Thr153、Trq291、Ser460 形成4 個氫鍵，與α-葡萄糖苷酶中的Asp282、Asp518、Arg600、Asp616 形成6 個氫鍵。

表1 糖尿病相關靶點及PDB 編號Table 1 Diabetes-related targets and PDB numbers

表2 葒草素與糖尿病靶點的分子對接結果Table 2 Molecular docking results of orientin and diabetes target

異葒草素和陽性對照物與糖尿病靶點的分子對接結果見表3，異葒草素與SGLT2 中的Asn75、Aer460、Ser400 形成 4 個氫鍵，對接結果為?8.63kcal/mol，其與陽性對照物達格列凈對接得分相比其差異度為11.84%；與α-葡萄糖苷酶中的Asp282、Arg281、Asp404、Phe525、Asp616 形成5個氫鍵，對接結果為?5.34 kcal/mol，比陽性對照藥阿卡波糖的?5.58 kcal/mol 略弱，但二者的差異度為僅4.30%。異葒草素與其他靶點的分子對接普遍較弱，而與PTP1B 的分子對接結果僅為?4.93 kcal/mol，其與陽性對照物化合物902 的差異度達46.88%。

表3 異葒草素與糖尿病靶點的分子對接結果Table 3 Molecular docking results of isoorientin and diabetes target

由表2、3 可知，葒草素和異葒草素在糖尿病靶標中，對α-葡萄糖苷酶有較強的結合作用，其次對SGLT2 也具有較好的結合能力，但對PTP1B 的結合能力很弱。因此。葒草素和異葒草素的降血糖作用可能是通過抑制雙靶點α-葡萄糖苷酶和SGLT2 發揮。

3.2 葒草素和異葒草素抑制 α-葡萄糖苷酶、SGLT2、PTP1B 活性

體外活性測試結果表明，在100 μmol/L 時葒草素對α-葡萄糖苷酶的抑制率為（16.7±5.8）%，異葒草素對α-葡萄糖苷酶的抑制率為（11.8±3.8）%，同濃度的陽性對照藥阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶的抑制率為（63.7±5.8）%；葒草素對SGLT2 蛋白的抑制率為（15.4±1.2）%，異葒草素對SGLT2 抑制率為（9.4±1.1）%，而同濃度的陽性對照藥達格列凈對SGLT2 的抑制率為（92.7±8.8）%；葒草素對PTP1B的抑制率僅為（3.0±0.5）%，異葒草素對PTP1B 的抑制率為（?3.8±0.6）%，同濃度的陽性對照藥V 對PTP1B 的抑制率為（73.4±8.3）%，見表4。

表4 葒草素、異葒草素對SGLT2、α-glucosidase、PTP1B 蛋白的抑制率的影響Table 4 Effects of orientin and isoorientin on the inhibition rates of SGLT2,α-glucosidase and PTP1B proteins

4 討論

糖尿病的藥物治療靶點多，藥物多，但糖尿病發病率高，嚴重影響人們的身心健康和生活質量，且許多治療糖尿病的藥品商品化嚴重，成本高，且藥物之間的相互作用與不良反應較多[13]，而傳統中藥在治療糖尿病時可能耐受性較強，不良反應較少，因此從天然藥物中尋求治療糖尿病的藥物研究一直是藥學研究的熱點。SGLT2 抑制劑和α-葡萄糖苷酶抑制劑均是良好的降血糖藥物[14-16]，但是兼有抑制SGLT2 和α-葡萄糖苷酶的藥物報道較少。

在靶點篩選中發現，葒草素和異葒草素對α-葡萄糖苷酶具有較好的結合作用，其分子對接得分與陽性對照藥阿卡波糖基本接近，但其細胞實驗發現葒草素和異葒草素在100 μmol/L 時對α-葡萄糖苷酶的抑制率分別為（16.7±5.8）%、（11.8±3.8）%，均對α-葡萄糖苷酶表現出溫和的抑制作用；葒草素和異葒草素對SGLT2 也表現出較好的結合作用，其分子對接得分與陽性對照藥達格列凈的差異度分別為4.80%、11.84%，但細胞實驗顯示二者對SGLT2的抑制率分別為（15.4±1.2）%、（9.4±1.1）%，均有一定的抑制活性；在PTP1B 的研究中，葒草素和異葒草素在分子對接均表現出對該蛋白弱的結合作用，在細胞實驗中幾乎無抑制作用。因此，葒草素和異葒草素可同時抑制α-葡萄糖苷酶和SGLT2 2個蛋白，呈現出很好的雙靶點降血糖作用，是潛在的一類具有SGLT2 和α-葡萄糖苷酶雙靶點抑制的化合物。

對比葒草素和異葒草素，可以發現，葒草素對α-葡萄糖苷酶和SGLT2 2 個蛋白表現出較強的抑制作用。在分子對接中，葒草素與阿卡波糖的分子對接差異度為1.59%，優于異葒草素與阿卡波糖分子對接差異度4.30%，葒草素與達格列凈的分子對接差異度為4.80%，也優于異葒草素與達格列凈分子對接差異度11.84%；在細胞實驗中，葒草素在100 μmol/L 時對α-葡萄糖苷酶SGLT2 蛋白的抑制率分別為（16.7±5.8）%、（15.4±1.2）%，均優于異葒草素對α-葡萄糖苷酶SGLT2 蛋白抑制活性的（11.8±3.8）%、（9.4±1.1）%。因此，葒草素比異葒草素具有更好的靶點抑制活性，可能比異葒草素具有更好的降血糖作用。

綜上，葒草素和異葒草素對SGLT2 和α-糖苷酶均具有一定的抑制活性，對PTP1B 基本沒有抑制作用，且葒草素的體外活性略強于異葒草素。葒草素有可能作為一類具有雙靶點作用的降血糖先導化合物，對其開展進一步研究，拓展葒草素在降血糖方面的應用，對新型降血糖藥物的研發具有一定意義。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突