布瓦西坦片在健康受試者中的生物等效性研究

徐滿，秦月雯，賴健明，曾潔萍，程玲*

1.江西青峰藥業有限公司，江西 贛州 341000

2.成都中醫藥大學附屬醫院，四川 成都 610000

流行性病學調查顯示，我國約有900 萬以上的癲癇患者，并且每年有65～70 萬新發癲癇患者[1]。布瓦西坦是第2 代抗癲癇藥左乙拉西坦吡咯烷烴的4 位碳原子連接正丙基衍生物，由比利時優時比制藥公司研發，用于治療成人、青少年和2 歲以上兒童部分性癲癇發作[2]。布瓦西坦對突觸囊泡蛋白2A具有高親和力，是左乙拉西坦的15～30 倍，且易透過血腦屏障，顯著提高了其抗癲癇活性[3]。布瓦西坦口服吸收迅速，絕對生物利用度約為100%，具有良好的安全性和藥動學特征，特別是中樞神經系統的良好耐受性是其優于其他抗癲癇藥物的主要原因[2]?？崭狗貌纪呶魈蛊?，達峰時間（tmax）0.25～3 h，中位數為1 h，進食高脂餐后布瓦西坦的吸收減緩，tmax中位數為3 h，最大血漿濃度降低37%，但吸收總量不變[4]。布瓦西坦與血清蛋白質結合率較低（≤20%）。布瓦西坦主要通過乙酰胺基團的水解和丙基側鏈羥基化，在體外，布瓦西坦羥基化主要由CYP2C19 介導，代謝無藥理活性[5]。超過95%的劑量（包括代謝物）在72 h 內通過腎臟排泄，終末血漿半衰期（t1/2）約為9 h[4]。瓦西坦尚未在我國批準進口，2019 年6 月國家衛生健康委員會公布《關于第一批鼓勵仿制藥品目錄建議清單的公示》，涉及34 個品種，布立西坦名列其中，因此仿制該藥對于我國癲癇患者的治療具有重要意義。本研究建立了快速、靈敏、準確的UPLC-MS/MS 法測定布瓦西坦的血藥濃度，評價自制布瓦西坦片與原研布瓦西坦片在健康受試者中的生物等效性。

1 材料與對象

1.1 儀器

LC-20ADXR 高效液相色譜儀（日本島津公司），包括CBM-20A Lite 系統控制器，LC-20ADXR液相泵，DGU-20A5R 脫氣機，CTO-20AC 柱溫箱；Turbo Spray 離子源（Applied Biosystems/Sciex）；API4000 質譜儀（Applied Biosystems/Sciex）配有電噴霧離子化源（ESI）、Analyst 1.6.3 數據采集系統。

1.2 藥品與試劑

布瓦西坦片受試制劑（T），規格50 mg/片，江西青峰藥業有限公司生產，批號20 181114；布瓦西坦片參比制劑（R），規格50 mg/片，UCB Pharma S.A.公司生產，批號224103。布瓦西坦對照品，質量分數98%，TRC 公司，批號1-NYL-116-1；內標布瓦西坦-d7對照品，質量分數98%，TLC 公司，批號3263-001A5。甲醇、乙腈為色譜純（Merck KgaA 公司），醋酸銨、甲酸為ACS 級（Sigma-Aldrich 公司）。

1.3 研究對象

空腹試驗共篩選58 例18 歲以上健康成年受試者，最終入組28 例，其中男性18 例，女性10 例，年齡（24.43±4.22）歲，身高（165.75±8.23）cm，體質量（58.79±8.72）kg，身體質量指數（21.26±1.93）kg/m2。餐后試驗共篩選53 例受試者，最終入組28 例，其中男性19 例，女性9 例，年齡（25.93±5.29）歲，身高（165.04±8.43）cm，體質量（59.45±8.09）kg，身體質量指數（21.70±1.81）kg/m2。入組的受試者均完成試驗，均納入全分析集、安全性分析集、藥動學濃度集。所有受試者均自愿簽訂知情同意書。編號C003 受試者因方案違背，剔除參數數據進行分析；編號C005 受試者在第2周期發生嘔吐，剔除其數據進行分析。本研究經成都中醫藥大學附屬醫院醫學倫理委員會的審查同意，倫理批件號2018ZL-016。

2 方法與結果

2.1 給藥方案

空腹和餐后試驗均采用單中心、單劑量、隨機、開放、兩周期、交叉試驗設計。采用區組隨機法將受試者分配至2 個給藥順序組，每組14 人。每個周期給藥1 次，清洗期為7 d?？崭乖囼灲o藥前禁食至少10 h，餐后試驗服用高脂餐前禁食至少10 h，于給藥前30 min 依次進食高脂高熱餐，隨后按照隨機表分別單次給予布瓦西坦片受試制劑或參比制劑50 mg 即1 片，用240 mL 溫水送服。服藥前后1 h 內禁止飲水。

2.2 樣本采集

受試者于給藥當天早晨埋留置針?？崭乖囼灂r每個周期采集18 管靜脈血，分別在給藥0 min（給藥前60 min 內）及給藥后10、20、30、45 min 以及1、1.25、1.5、2、2.5、3、4、6、8、12、24、36、48 h 由外周靜脈采血約4 mL；餐后試驗時每個周期采集19 管靜脈血，分別在給藥0 min（給藥前60 min 內）及給藥后0.25、0.5、1、1.5、2、2.5、2.75、3、3.25、3.5、4、5、6、9、12、24、36、48 h 由外周靜脈采血約4 mL。各時間點采集的血樣置于K2EDTA 真空采血管中，4 ℃下2 500×g離心10 min，取上層血漿置凍存管中，置?20 ℃冰箱，備用。

2.3 LC-MS/MS 法測定布瓦西坦

2.3.1 色譜條件 Kinetex 2.6 μm XB-C18100? 色譜柱（50 mm×2.1 mm，2.6 μm）；流動相：含0.1%甲酸和5 mmol/L 醋酸銨的水溶液（A）–100%甲醇（B），梯度洗脫（0～0.40 min 43% B，0.40～1.90 min 43%～50% B，1.90～3.00 min 100% B，3.00～4.00 min 100%～43% B）；體積流量：0.350 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣室溫度：8 ℃；進樣量：5.00 μL。

2.3.2 質譜條件 電離模式：ESI 電噴霧離子化源（正離子方式）；掃描模式：多反應監測模式；離子源噴霧電壓：3 500 V；離子源溫度：600 ℃；氣簾氣：35 psi（1 psi＝6 895 Pa）；霧化氣：30 psi；輔助氣：50 psi；接口加熱：ON；碰撞氣：6 Unit；Q1、Q3 分辨率均為Unit。用于定量分析的反應離子對：布瓦西坦m/z213.1→168.1，布瓦西坦-d7220.1→175.2，去簇電壓分別為50、60 V，射入電壓均為9 V，碰撞電壓分別為19、20 V，碰撞室射出電壓分別為15、14 V，掃描時間為0.2 s。

2.3.3 溶液的配制

（1）標準曲線儲備液的配制：取適量布瓦西坦對照品，質量校正系數校正后溶于甲醇，制得1.00 mg/mL 儲備液，于透明玻璃瓶、?20 ℃條件下保存。

（2）標準曲線工作液的配制：用50%甲醇溶液稀釋儲備液配制成質量濃度為5.00（LLOQ）、10.00、50.00、200.00、600.00、1 500.00、2 400.00、3 000.00 ng/mL（ULOQ）標準曲線工作溶液，貯存于透明聚丙烯管中，于?20 ℃條件下保存。

（3）內標儲備液和工作溶液的配制：取1 支布瓦西坦-d7對照品，經質量校正系數校正后，將其溶于甲醇中，得到1.00 mg/mL 內標儲備液，于棕色玻璃瓶、?20 ℃條件下保存。用50%甲醇溶液稀釋內標儲備液以配制內標工作溶液，并將其貯存于透明聚丙烯管中，于?20 ℃條件下保存。

（4）質控（QC）樣品的配制：以人血漿（以K2EDTA 作為抗凝劑）作為空白基質配制質控樣品，用50%甲醇溶液稀釋布瓦西坦儲備液，配制成12.00（LQC）、500.00（MQC）、2 250.00（HQC）、6 000.00（DQC）ng/mL 的質控樣品溶液，并將其貯存于透明聚丙烯管中，于?20 ℃條件下保存。

2.3.4 血漿樣本處理 待測樣品（待測生物樣品、標準曲線樣品、質控樣品）室溫融化渦旋混勻后，向96 孔板中加入50.0 μL 樣品（待測生物樣品、標準曲線樣品、質控樣品）；對于雙空白樣品和零點樣品，加入50.0 μL 空白人血漿。向除雙空白樣品和不含內標的定量上限樣品外的所有樣品中加入30.0 μL 500 ng/mL 內標工作溶液；對于雙空白樣品和不含內標的定量上限樣品中，加30.0 μL 50%甲醇溶液。將96 孔板充分振搖1 min 后向所有樣品孔中加入400 μL 乙腈，密封振搖10 min 后將96 孔板在室溫條件下以4 000 r/min 離心10 min。轉移30.0 μL上清液至干凈的96 孔板中，將所有的樣品上清液用270 μL 50%甲醇溶液稀釋，充分振搖10 min 后置于自動進樣器中，進行HPLC-MS/MS 分析。

2.3.5 選擇性試驗 在6 個不同來源的單個空白基質中，待測物、內標干擾峰的平均響應（峰面積）不超出定量下限標準曲線樣品平均響應的0.0%。制備3 個重復的零點樣品以考察內標對分析物測定的干擾，在空白樣品中加入定量上限濃度的分析物而不加內標，配制不含內標的定量上限樣品考察分析物對內標測定的干擾，不加內標的定量上限樣品、零點樣品中待測物干擾峰的平均響應均不超出定量下限標準曲線樣品平均響應的0.0%。取20.0 μL冷凍全血加入980 μL 空白血漿得溶血基質，將20%英脫利匹特加入941 μL 空白血漿，制得高脂基質，在高脂、溶血基質配制的雙空白樣品中，在待測物或內標保留時間附近沒有顯著干擾。見圖1。

圖1 布瓦西坦的HPLC-MS/MS 典型色譜圖Fig.1 Typical HPLC-MS/MS chromatograms of brivaracetam

2.3.6 標準曲線和定量下限 根據2.3.3（1）項下加入到人空白血漿中配制5.00、10.00、50.00、200.00、600.00、1 500.00、2 400.00、3 000.00 ng/mL標準曲線樣本溶液。通過使用權重因子1/x2，采用Watson LIMS 7.5 SP1 軟件回歸，線性回歸得到理論質量濃度與響應之間的線性關系進行定量，得標準曲線方程Y＝5.614×10?3X－2.621×10?4（R2＝0.998 7），線性范圍為5.00～3 000.00 ng/mL。最低定量下限為5.00 ng/mL。

2.3.7 準確度和精密度試驗 5.00 ng/mL（LLOQ QC）、12.00 ng/mL（LQC）、500.00 ng/mL（MQC）、2 250.00 ng/mL（HQC）質控樣每個質量濃度重復6次評估準確度和精密度，4 個質量濃度水平的質控樣品檢測結果的批內、批間精密度RSD 值均小于5.8%，準確度偏差為?3.2%～12.8%。見表1。

表1 準確度和精密度試驗結果（，n=6）Table 1 Results of accuracy and precision tests (,n=6)

表1 準確度和精密度試驗結果（，n=6）Table 1 Results of accuracy and precision tests (,n=6)

2.3.8 稀釋可靠性試驗 配制一個質量濃度超過定量上限的稀釋質控樣品DQC（6 000.00 ng/mL）和高質量濃度質控樣品HQC（2 250.00 ng/mL），然后用空白人血漿將質控樣品稀釋，使其質量濃度落在標準曲線線性范圍內。在2 250.00～6 000.00 ng/mL，質控樣品待測物平均測定準確度偏差為2.7%（HQC：2 250.00 ng/mL）、?5.2%（DQC：6 000.00 ng/mL），測定精密度RSD 值小于2.4%。因此，稀釋因子為1∶5 時具有良好的稀釋可靠性。

2.3.9 穩定性試驗 布瓦西坦血漿樣品在室溫下放置20.2 h 穩定性良好，在?20、?70 ℃條件下5 次凍融循環穩定性良好，在?20、?70 ℃條件下長期冰凍56 d 穩定性良好，血漿樣品處理后的上清液在8 ℃自動進樣器中放置7 d 穩定性良好，見表2。

表2 穩定性試驗結果（，n=3）Table 2 Results of stability test (,n=3)

表2 穩定性試驗結果（，n=3）Table 2 Results of stability test (,n=3)

2.3.10 基質效應 以6 個不同來源的空白人血漿制備的雙空白樣品，提取之后加入待測物和內標，以使其最終質量濃度分別與12.00、500.00、2 250.00 ng/mL 質控樣品的進樣質量濃度一致，同時配制含有一定量待測物和內標的純溶液，其最終質量濃度分別與12.00、500.00、2 250.00 ng/mL 質控樣品的進樣質量濃度一致。通過計算基質存在下的峰面積與不含基質的峰面積的比值，計算每一個待測物和內標的基質因子。進一步通過待測物的基質因子除以內標的基質因子，計算經內標歸一化的基質因子（基質效應因子＝基質樣品峰面積平均值/對照溶液峰面積平均值）。6 個不同來源的單個基質在12.00、500.00、2 250.00 ng/mL 水平下，內標歸一化的基質因子均值為98.6%～101.9%，精密度RSD 值≤0.7%，3 個質量濃度水平內標歸一化的基質因子平均值為100.6%，精密度RSD 值為1.7%。高脂基質12.00、2 250.00 ng/mL 水平的質控樣品準確度偏差均值分別為3.3%、?2.8%，精密度≤4.8%。溶血基質12.00、2 250.00 ng/mL 水平的質控樣品準確度偏差均值分別為1.7%、?4.1%，精密度RSD 值≤2.7%。上述結果表明，各類基質對血漿中的布瓦西坦無顯著影響，不影響定量分析。

2.3.11 提取回收率試驗 內標測定質量濃度為500.00 ng/mL，待測物測定質量濃度為定量范圍內3個質量濃度水平12.00、500.00、2 250.00 ng/mL。6個重復的12.00、500.00、2 250.00 ng/mL 質控樣品（LQC、MQC、HQC）與18 個雙空白樣品一同處理。處理后，將含有待測物和內標的溶液加入空白人血漿制備的雙空白樣品中，以使其最終質量濃度與12.00、500.00、2 250.00 ng/mL 質控樣品的進樣質量濃度一致。通過比較單個質控樣品中待測物或內標響應值與提取后加入待測物、內標的雙空白樣品的響應值，計算回收率（回收率＝提取后樣品峰面積/未經提取峰面積平均值）。血漿樣品中布瓦西坦的提取回收率為96.3%～99.6%，在12.00、500.00、2 250.00 ng/mL 下的平均提取回收率分別為97.1%、96.3%、99.6%。內標布瓦西坦-d7的回收率為95.5%。

2.3.12 殘留 在批量樣品檢測過程中的殘留結果為待測物殘留0～6.8%，內標殘留0～0.1%，不影響定量分析。

殘留＝雙空白樣品中待測物或內標的最大峰面積/該分析批LLOQ（5.00 ng/mL）標準曲線樣品最小峰面積值

2.4 藥動和生物等效性研究

2.4.1 血藥濃度–時間曲線 根據測定的血藥濃度繪制血藥濃度–時間曲線，空腹和餐后試驗中受試者口服受試試劑、參比制劑的血藥濃度–時間曲線見圖2。

圖2 空腹（A）和餐后（B）受試者口服受試制劑、參比制劑后布瓦西坦的平均血藥濃度-時間曲線Fig.2 Mean concentration-time curves of brivaracetam in subjects after po administered with test and reference preparation under fasting (A) and fed (B) condition

2.4.2 藥動學參數和統計分析 使用 Phoenix WinNonlin 8.1 軟件，按照非房室模型并基于實際采血時間點計算每位受試者的藥動學參數，包括Cmax、AUC0-t、AUC0-∞、tmax、t1/2、λz和AUC%Extrap，主要藥動學參數為Cmax、AUC0-t、AUC0-∞?？崭购筒秃鬆顟B下口服布瓦西坦片的主要藥動學參數見表3。

表3 空腹和餐后口服布瓦西坦片的主要藥動學參數Table 3 Main pharmacokinetic parameters after po Brivaracetam Tablets under fasting or fed condition

2.4.3 生物等效性評價 基于生物等效性分析集（BES），采用SAS 9.4 軟件進行兩個制劑藥動學參數的推斷性統計分析。對受試制劑、參比制劑的主要藥動學參數Cmax、AUC0-t、AUC0-∞進行自然對數轉換，進行線性混合效應模型分析，基于主要藥動學參數（AUC0-∞、AUC0-t和Cmax）的線性混合效應模型分析，計算兩個制劑主要藥動學參數（AUC0-∞、AUC0-t和Cmax）幾何均數比值及其90%置信區間，并采用雙單側t檢驗進行生物等效性判定。受試制劑相對參比制劑的AUC0-∞、AUC0-t和Cmax幾何均數比值的90%置信區間在80.00%～125.00%則認為兩制劑生物等效?？崭?、餐后生物等效性評價結果見表4。結果表明，在空腹和餐后狀態下口服布瓦西坦受試制劑、參比制劑的幾何均值比、90%置信區間均在等效區間范圍內，二者具有生物等效性。

表4 空腹和餐后狀態下布瓦西坦片主要藥動學參數的生物等效性分析Table 4 Bioequivalence analysis of main pharmacokinetic parameters of Brivaracetam Tablets under fasting condition and fed condition

3 討論

布瓦西坦作用機制獨特，主要通過突觸囊泡蛋白2A 高親和作用和鈉離子通道抑制作用，具有較好的抗癲癇活性。布瓦西坦在體內吸收迅速，空腹給藥受試制劑在0.34 h 即可達峰，較參比制劑和既往文獻報道更迅速[6]，其半衰期約為9 h。

餐后試驗中，受試試劑、參比制劑的吸收較空腹試驗均延遲了約2 h，這可能與食物能降低胃排空速率有關[7]，進食后吸收程度無顯著差異，這與文獻報道的結果一致[4]?？崭菇o藥相對餐后給藥的療效更快，生物利用度更高，在充分考慮藥物安全性的情況下為了提高藥物臨床療效，可優先選擇空腹服藥。

本研究進行的餐后和空腹試驗中，布瓦西坦片的Cmax、AUC0-t、AUC0-∞、tmax和t1/2與既往試驗中的藥動學參數基本一致，與原研進行的試驗中得到的藥動學參數無明顯差別[3,6,8]。

本研究建立了LC-MS/MS 法測定人血漿中布瓦西坦，方法快速、準確、選擇性高、穩定性好，適用于布瓦西坦的藥動學研究。健康受試者空腹口服試驗結果表明布瓦西坦受試制劑與參比制劑具有類似的藥動學特性、生物等效。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突