新西蘭白兔BMP15基因的真核表達載體構建、表達模式及其在卵巢組織的表達

陳孟娟,劉雨晴,王智通,溫佳樂,許會芬,于光晴,李 明

(河南農業大學動物科技學院,鄭州 450046)

兔(Oryctolaguscuniculus)是最重要的經濟動物之一,可為人們提供肉、皮毛等生產生活資料。兔肉具有低脂肪、低膽固醇和高蛋白質的特點,其深受消費者的歡迎[1]。兔繁殖性能是影響兔產業發展和經濟效益的重要因素,雌性動物的繁殖潛力主要取決于卵巢和卵泡的生長和發育[2],因此,探究兔卵巢卵泡生長發育的分子機制,在其生產過程中具有重要的科學意義。

卵巢的發育是一個動態變化過程,在每個生殖周期都經歷著廣泛的組織重塑,包括卵泡的形成和閉鎖、排卵、黃體形成和退化的過程,并且還伴隨著血管系統和微環境的變化[3-5]。卵泡是卵巢的功能單位,多種卵巢內因子參與膜內細胞、顆粒細胞和卵母細胞之間的旁分泌/自分泌信號傳導,并且有助于優勢卵泡的發育[6]。研究發現,卵巢內的信號通路調節著卵泡的發育和生長,如卵泡信號傳導過程中轉化生長因子-β(TGFβ)家族發揮著重要作用,它可以調控卵泡顆粒細胞的增殖和孕酮的分泌進而調控卵泡的發育和閉鎖[7]。

骨形態發生蛋白15(BMP15)由卵母細胞分泌,屬于轉化生長因子(TGF-β)超家族的多功能胞外分泌蛋白,在哺乳動物卵巢、卵泡的生長發育、成熟以及排卵過程中起著不可或缺的作用[8-9]。BMP15 蛋白作為卵母細胞分泌因子,以內分泌或旁分泌的方式分泌到胞外,通過調節卵泡顆粒細胞的生長和分化來控制卵泡的生成和排卵,最終影響優勢卵泡的選擇和閉鎖卵泡的形成[10]。Hosoe等[11]研究發現,BMP15在成年母牛卵巢卵丘細胞中的表達水平顯著高于小牛,且在母牛的卵母細胞和卵丘細胞中均有表達。在小鼠卵巢中,BMP15最早出現于初級卵母細胞中,持續表達于卵母細胞晚期,并維持至排卵發生,存在于卵泡發育的各個階段[12]。當 BMP15敲除后,導致豬卵巢發育功能不全以及正常卵泡的數量顯著減少[13]。綿羊BMP15基因突變為純合子后,其卵泡發育停滯[14]。BMP15能夠刺激顆粒細胞中促卵泡激素(FSH)mRNA表達增加,從而調控卵巢內固醇類激素的合成和促黃體受體(LHR)的表達[15]。還有研究發現,BMP15基因通過TGF-βRⅡ 激活SMAD4信號分子從而實現調控卵泡顆粒細胞的發育[16]。BMP15作為家畜繁殖力的重要候選基因,在卵巢發育過程中起著重要的調節作用,對其深入研究能更好地理解卵巢卵泡生長發育的分子機制。

目前,BMP15的研究已經在多個物種中開展,但BMP15對于兔卵巢發育影響的研究較少,BMP15基因對兔繁殖機能的調控機制尚未清楚。本試驗以新西蘭白兔卵巢組織RNA反轉錄的cDNA為模板,克隆出BMP15 基因的CDS區,構建該基因的真核表達載體,對BMP15蛋白進行生物信息學分析,通過激光共聚焦方法檢測BMP15在細胞內的定位情況,并且通過實時熒光定量PCR方法檢測新西蘭白兔BMP15基因在不同組織及器官中的表達情況,初步分析BMP15基因的功能及表達特點,以期為深入研究兔BMP15基因對卵巢發育的調控機制奠定基礎,為提高家畜繁殖能力提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗樣品

選取180日齡健康的新西蘭白兔雌兔3只,屠宰后迅速采集心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、子宮、腿肌、卵巢組織,用PBS沖洗后,剪成小塊,轉入2 mL無酶凍存管中,液氮速凍后,放入-80 ℃冰箱內保存備用。本試驗所使用的細胞系為人胚胎腎細胞(HEK293 T)和人非小細胞肺癌細胞(H1299)購自中國科學院典型培養物保藏中心。

1.2 主要試劑

Trizol試劑和DH5α感受態細胞均購自于北京全式金生物技術有限公司,KOD高保真酶購自于上海東洋紡生物科技有限公司,DNA Marker、實時熒光定量試劑盒和反轉錄試劑盒購自于莫納(武漢)生物科技有限公司,膠回收試劑盒和質粒提取試劑盒均購自于北京天根生化科技有限公司,T4連接酶購自TaKaRa(日本)公司,KpnⅠ、EcoR Ⅰ限制性內切酶購自NEB(北京)公司,PBS、胎牛血清和 DMEM高糖培養基購自武漢普諾賽生命科技有限公司,Lipofectamine 3000試劑購自Thermo(美國)生物科技有限公司,4% PFA多聚甲醛購自上海碧云天生物科技有限公司,DAPI和抗熒光淬滅劑購自武漢賽維爾生物科技有限公司,Myc抗體購自Santa Cruz(美國)公司 (sc-40),BMP15抗體購自上海生工生物工程有限公司 (D121992),β-actin抗體購自賽維爾(武漢)生物科技有限公司(GB11001-100),蛋白質裂解液、蛋白質上樣緩沖液、蛋白marker購自上海雅酶生物醫藥科技有限公司。

1.3 引物設計及合成

參考GenBank中公布的兔BMP15基因序列(GenBank登錄號:NM_001 199 117.1),使用SnapGene設計BMP15基因特異性克隆引物,隨后使用NCBI網站進行引物驗證,使用NCBI設計實時熒光定量引物,擴增片段長度大小為100～200 bp。內參為GAPDH基因(GenBank登錄號:NM_001082-253.1),引物序列信息見表1。引物由上海生工生物科技有限公司合成。

表1 引物信息

1.4 RNA 的提取及反轉錄

取黃豆大小(100 mg)的組織樣品進行研磨,用Trizol法提取組織總RNA,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的質量,超微量分光光度計檢測RNA的濃度。用反轉錄試劑盒將其反轉錄成cDNA。

1.5 家兔BMP15基因的克隆

以新西蘭白兔卵巢組織cDNA為模板進行PCR擴增。PCR反應體系為:模板cDNA(500 ng·μL-1)5 μL,BMP15-F(10 ng·μL-1)1.5 μL,BMP15-R(10 ng·μL-1)1.5 μL, KOD OneTM PCR Master Mix 25 μL,ddH2O補至50 μL。PCR 反應程序:98 ℃預變性2 min;98 ℃變性10 s , 60 ℃退火5 s, 68 ℃延伸13 s, 35個循環;68 ℃終延伸5 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后,膠回收試劑盒回收目的條帶,將回收的目的條帶、Pmcherry-N1 和pCMV-Myc載體用KpnI、EcoR I限制性內切酶酶切37 ℃、30 min后,酶切產物經1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測后,膠回收,將回收的目的基因以及載體使用T4連接酶連接,體系為:T4連接酶1 μL,Buffer 1 μL,目的基因膠回收產物 5 μL,載體3 μL,16 ℃連接過夜,將連接產物轉化,涂在含有卡那霉素、氨芐霉素的培養板上,第2天挑取陽性菌落,菌液PCR結果正確后送擎科生物有限公司測序。

1.6 生物信息學分析

測序結果利用SeqMan軟件與兔BMP15基因進行序列比對。利用在線工具進行生物信息學分析,分析工具如表2所示,利用Mega7.0軟件對不同物種BMP15基因進行同源性比較,并繪制不同物種BMP15基因的氨基酸序列系統進化樹。

表2 生物信息學分析網址

1.7 實時熒光定量 PCR

以新西蘭白兔的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、肌肉、卵巢、子宮的cDNA為模板,準備相對應的1.5 mL無酶EP管,將相對應上下游引物、水、SYBRGreen Mix預混在一起,分別均勻加至每孔,生物重復和技術重復各3個,反應體系為10 μL:cDNA模板1 μL,上、下游引物各 0.2 μL,SYBRGreen Mix 5 μL, ddH2O 補足至 10 μL。使用實時熒光定量儀器進行 PCR 反應。根據熒光定量所得到的 Ct 值,采用2-ΔΔCt法對數據進行分析,GraphPad Prism 7.0軟件作圖。

1.8 細胞培養

將凍存的H1299細胞和HEK293 T細胞從液氮中取出,放在37 ℃水浴鍋中解凍,期間不斷搖晃使受熱均勻,隨后將細胞凍存液移至細胞培養瓶中,分別加入含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養基和DMEM高糖培養基,放入含有5% CO2的37 ℃培養箱進行培養。傳代2～3次,用于后續實驗。

1.9 細胞轉染

當細胞密度達到70～80%時,按照Lipofectamine 3000 試劑盒說明書轉染質粒,將pCMV-Myc-BMP15轉染到HEK293 T細胞內,對照組轉染pCMV-Myc空載體,每組各設置3個生物學重復,培養24 h 后,收取細胞樣品用于檢測mRNA 水平的過表達效果;48 h 后,收取細胞樣品用于檢測蛋白水平表達效果。同樣地按照Lipofectamine 3000 試劑盒說明書轉染Pmcherry-N1-BMP15質粒,設置3個生物學重復。

1.10 激光共聚焦分析

待細胞生長狀態良好時,將細胞接種于預先加入圓形蓋玻片(直徑2 cm)的6孔板中,細胞密度為2×105個·孔-1;培養24 h后,轉染構建的Pmcherry-N1-BMP15質粒;24 h后,去除培養基,用 PBS漂洗3次,用1 μg·mL-1DAPI 室溫下染色10 min,PBS清洗細胞3次;封片:取約5 μL抗淬滅劑滴加到載玻片上,然后將蓋玻片倒置于抗淬滅劑上(有細胞的一面向下),用吸水紙吸凈溢出來的抗淬滅劑;用Leica 激光掃描共聚焦顯微鏡觀察并拍照。

1.11 Western blotting

使用裂解液提取細胞或組織的蛋白,加入蛋白上樣緩沖液后,100 ℃煮10 min。待蛋白樣品冷卻后,根據蛋白含量,在上樣孔中加入5～10 μL蛋白樣品和2.5 μL蛋白Marker。將電壓設為80 V進行電泳,待溴酚藍條帶進入分離膠,將電壓設置為120 V,電泳50～60 min(根據目的蛋白分子量大小調整電泳時間)。電泳結束后進行轉膜,將蛋白轉印至PVDF膜上,120V,60 min。5%脫脂奶粉封閉60 min,孵育一抗 4 ℃過夜,一抗工作濃度為1∶1000稀釋,TBST洗膜3次,每次5 min,室溫孵育二抗60 min,二抗工作濃度為1∶10 000,TBST洗膜3次。PVDF膜滴加ECL發光液,放入到暗室中進行顯影。

1.12 免疫熒光

采取健康新西蘭白兔的卵巢,10%多聚甲醛固定后,制作石蠟切片,將切片置于0.1 mol·L-1、 pH=6的枸櫞酸液修復液中進行抗原修復;PBS洗2次,每次2 min,加0.2% TritonX-100透膜15 min;PBS洗兩次,每次2 min;玻片上PBS用濾紙擦凈,在濕盒內用BSA室溫封閉1 h;PBS洗兩次后,4 ℃孵育一抗過夜,一抗工作濃度為1∶1 000稀釋,PBS洗5次,滴加熒光二抗并在濕盒內室溫避光孵育1 h,二抗工作濃度為1∶500稀釋;PBS洗3次,滴加DAPI避光孵育15 min,PBS洗兩次后,滴加抗熒光淬滅劑封片,烘干后在熒光顯微鏡下觀察。

1.13 數據分析

定量和蛋白量化數據使用 SPSS 26.0 軟件進行分析處理,經齊性檢驗后,進行單因素方差分析比較顯著性差異,顯著性水平為: *P<0.05表示差異顯著,**P<0.05表示差異比較顯著,***P<0.05表示差異極顯著。使用GraphPad Prism 軟件進行統計分析和圖形繪制。

2 結 果

2.1 新西蘭白兔 BMP15 基因的克隆

以反轉錄的卵巢組織cDNA為模板,PCR 擴增BMP15基因,擴增片段為1 182 bp,1% 瓊脂糖凝膠電泳結果與預期片段相符(圖1)。測序后進行序列比對,與NM_001 199 117.1的相似度為100%,可以初步確定為兔BMP15 CDS區序列。

M. DNA 相對分子質量標準;1. BMP15 基因CDS區全長的PCR產物M. 2000 bp DNA marker; 1. PCR amplification product of CDS region of BMP15 gene 圖1 新西蘭白兔BMP15基因CDS區克隆Fig.1 The CDS region of New Zealand white rabbits BMP15 gene

2.2 新西蘭白兔 BMP15 基因及蛋白生物信息學分析

2.2.1 新西蘭白兔BMP15基因編碼核苷酸序列分析 新西蘭白兔BMP15基因序列與小鼠、人、牛、豬、馬、綿羊、雞、犬的同源相似性分別為66.3%、75.5%、81.2%、81.9%、81.2%、79.9%、38.3%、81.7%(圖2A)。系統進化樹結果表明(圖2B),兔與豬的親緣關系最近,與雞的親緣關系最遠

A. 新西蘭白兔與其他物種BMP15基因核苷酸序列同源性比較; B. 新西蘭白兔BMP15基因系統進化樹A. Comparison of nucleotide sequence homology of BMP15 gene between New Zealand white rabbits and other species; B. Phylogenetic tree of BMP15 gene in New Zealand white rabbits

2.2.2 新西蘭白兔BMP15蛋白理化性質分析 蛋白理化性質分析結果顯示,新西蘭白兔BMP15蛋白分子式為C2020H3199N591O550S18,其原子總數為6 378,含有393個氨基酸,蛋白質理論等電點為9.69,屬于堿性蛋白,不穩定指數為55.32,為不穩定蛋白,脂肪酸指數為92.80%,總平均親水性為-0.865,為親水性蛋白(圖3)。對新西蘭白兔BMP15蛋白氨基酸主成分分析結果如表3所示,其中負電荷殘基(Asp+Glu)總數為31,正電殘基(Arg+Lys)總數為48。

圖3 新西蘭白兔 BMP15 蛋白疏水性分析Fig.3 Hydrophobic analysis of BMP15 protein in New Zealand white rabbits

表3 新西蘭白兔 BMP15 蛋白的氨基酸組成

2.2.3 新西蘭白兔BMP15蛋白跨膜結構和信號肽預測 蛋白跨膜結構分析結果表明,新西蘭白兔BMP15 蛋白不含跨膜結構,表明BMP15蛋白不屬于跨膜蛋白(圖4A)。信號肽預測結果顯示(圖4B), BMP15蛋白在25位氨基酸處存在一個信號肽,屬于分泌型蛋白。

A. 新西蘭白兔 BMP15 蛋白跨膜區預測; B. 新西蘭白兔 BMP15 蛋白信號肽預測A. Prediction of transmembrane region of BMP15 protein in New Zealand white rabbits; B. Prediction of BMP15 protein signal peptide in New Zealand white rabbits

2.2.4 新西蘭白兔BMP15蛋白質磷酸化位點和糖基化位點分析 如圖5所示,新西蘭白兔BMP15蛋白共檢測出26個磷酸化位點,其中19個Serine(絲氨酸)磷酸化位點,7個Threonine (蘇氨酸) 磷酸化位點。NetNGlyc4.0分析表明BMP15蛋白共有15個糖基化位點。

圖5 BMP15蛋白磷酸化位點圖Fig.5 Phosphorylation site map of BMP15 protein

2.2.5 BMP15蛋白質二級結構、三級結構預測 通過蛋白質在線分析系統預測BMP15蛋白的二級結構,結果顯示,新西蘭白兔BMP15蛋白主要由α-螺旋、無規則卷曲、延伸鏈、β-轉角組成,占比分別為38.68%、37.4%、15.52%、8.40%,為混合性蛋白(圖6)。該蛋白的三級結構預測主要以 α-螺旋和無規則卷曲為主,與二級結構預測結果一致(圖7)。

h.α-螺旋;e.延伸鏈;t.β-轉角;c.無規則卷曲h. α-helix; e. Extension chain; t. β-rotation; c. Irregular crimp

圖7 BMP15 三級結構預測Fig.7 BMP15 tertiary structure prediction

2.2.6 新西蘭白兔BMP15蛋白的互作分析 通過STRING在線數據庫檢索分析BMP15蛋白的相互作用,如圖8所示,發現BMP15蛋白與促卵泡激素受體(FSHR)、生殖系a因子(FIGLA)、骨形態發生蛋白受體1B(BMPR1B)、配體特異性II型受體(AMHR2)、新生兒卵巢同源基因(NOBOX)等蛋白之間存在相互作用。

圖8 新西蘭白兔 BMP15 蛋白與其它蛋白相互作用Fig.8 Interaction between BMP15 protein and other proteins in New Zealand white rabbit

2.3 BMP15 基因在新西蘭白兔不同組織和器官中的表達量分析

對BMP15基因在新西蘭白兔各個組織中的表達情況進行分析,結果如圖9所示,由結果可知,BMP15基因僅在卵巢中表達(P<0.05)。

圖9 BMP15基因在新西蘭白兔不同組織中的表達量Fig.9 Expression of BMP15 gene in different tissues of New Zealand white rabbits

2.4 BMP15亞細胞定位分析

將已構建成功的紅色熒光標簽標記的真核表達載體轉染至H1299細胞中,BMP15主要分布在細胞質中(圖10)。

mCherry-BMP15代表紅色熒光通道;DAPI代表藍色熒光通道;MERGE表示兩個通道的疊加mCherry-BMP15 represents red fluorescence channel; DAPI represents blue fluorescence channel; MERGE represents the superposition of two channels

2.5 兔BMP15基因在HEK293 T細胞中的過表達

將帶有Myc標簽的BMP15質粒轉染至HEK293T細胞內,定量結果顯示(圖11A),BMP15 mRNA水平相比對照組上調約13 666倍(P<0.001),Western bloting結果顯示,與對照組相比,過表達BMP15后,BMP15蛋白表達量顯著上升(P<0.001)(圖11B,C)。

A. 過表達后BMP15 mRNA相對表達量;B. 過表達后BMP15蛋白的表達;C. 蛋白表達量化結果。CON. 空質粒轉染對照組;OVE. 重組質粒轉染組。***. P<0.001A. Relative expression of BMP15 mRNA after overexpression; B. Expression of BMP15 protein after overexpression. C. Quantitative results of protein expression.CON. Empty plasmid transfection control group; OVE. Recombinant plasmid transfection group. ***. P<0.001

2.6 BMP15 在卵巢組織的定位及表達

卵巢組織免疫熒光結果顯示(圖12A),BMP15表達于不同發育時期卵泡的顆粒細胞中,并且主要在顆粒細胞的細胞質中表達。同時,BMP15蛋白在新西蘭白兔卵巢組織的表達如圖12B所示。

3 討 論

近年來,對于BMP15在卵巢發育中作用的研究不斷深入, BMP15對卵泡生長發育影響的分子機制也慢慢明確,但BMP15在兔上的研究還甚少。秦明鳴等[2]通過構建豬BMP15基因報告載體隨后顯微注射至不同細胞內及體外培養的卵泡中,發現啟動子只在卵巢細胞內特異性表達,并且能在卵母細胞體外成熟18 h 啟動表達。本研究通過克隆得到新西蘭白兔BMP15基因的CDS區序列,并且成功構建出BMP15真核表達載體,可以為深入探究BMP15基因對于兔繁殖性能影響的分子機制提供基礎。接下來通過對不同物種間BMP15基因及其編碼序列分析發現,兔與豬、犬、牛、綿羊的同源性較高,而與雞的序列同源性較低,說明在哺乳動物中BMP15基因進化比較保守。

本研究通過TMHMML 和SignalP-4.1在線軟件預測BMP15不屬于跨膜蛋白,并且含有一個信號肽,屬于分泌型蛋白。BMP15的無活性前體包括N端信號肽、前肽和含有成熟蛋白的C端區域,當其發揮生物學功能時,將進行翻譯后處理,包括信號肽的去除、二聚化和進一步的剪切[17]。BMP15蛋白成熟區域的二聚化包括其自身的二聚化或者與其它TGF超家族成員的成熟區域進行二聚化[18],有報道稱人類BMP15與GDF9成熟蛋白會形成成熟的同型二聚體、多聚體和異二聚體[19-20]。對BMP15蛋白進行磷酸化預測,發現該蛋白共有26個潛在的磷酸化位點,能發生磷酸化的氨基酸位點包括絲氨酸和蘇氨酸;糖基化預測發現該蛋白共有15個潛在的糖基化位點。磷酸化和糖基化是重要的蛋白質翻譯后修飾,蛋白質的磷酸化與多種生物學過程密切相關,包括 DNA 損傷修復、轉錄調節、細胞凋亡、信號轉導等,糖基化修飾是可以改變多肽的構象,進而使蛋白質更加穩定[21]。體外研究表明,受體需要磷酸化和糖基化來識別BMP15因子,從而保證其生物活性[22]。

蛋白質相互作用預測結果表明,BMP15蛋白與FSHR、FIGLA、BMPR1B等10種蛋白之間存在相互作用關系。其中FSHR蛋白是G蛋白偶聯受體超家族成員之一,對于動物卵巢卵泡的發育有著重要的調控作用[23],其突變會導致雌、雄動物的不孕或者是繁殖能力降低[24-25]。在新西蘭白兔生長發育過程中,FSHR mRNA 和蛋白質的表達水平隨著年齡的增長和卵巢卵泡的生長而同步增加[26]。Du等[27]研究發現,敲低FSHR會誘導豬顆粒細胞凋亡和卵泡閉鎖,并且能夠降低細胞內信號分子的水平。BMP15 可以通過Smad和非Smad途徑誘導人顆粒細胞中的 FSHR 表達,從而控制卵泡的生長[28]。FIGLA(生殖系a因子)是第一個生殖細胞特異性表達的轉錄因子,在卵泡發育和透明帶形成的過程中具有重要的調節作用,FIGLA基因異常會導致卵巢早衰,研究表明FIGLA在早期卵子發生期間通過抑制卵母細胞雌激素信號傳導來促進卵泡的形成[29-32]。BMPR1B蛋白與BMP15蛋白一樣均屬于TGF-β超家族成員,近年來,有大量研究表明BMPR1B基因是多種綿羊品種的多胎主效基因[33],也是綿羊高繁殖力的主效基因和控制綿羊繁殖性能遺傳的重要候選基因[34]。趙金[35]研究發現,BMP15通過受體BMPR1B激活MAPK通路調控卵泡顆粒細胞增殖和凋亡。以上這些結果表明,BMP15在卵巢卵泡發育、卵泡閉鎖、雌激素生成等眾多生理過程中發揮著一定的作用,但這只是初步預測分析結果,還需進一步深入研究驗證。

本研究用qRT-PCR技術檢測了BMP15基因在180日齡新西蘭白兔不同組織中的表達量,發現BMP15基因僅在卵巢組織中特異性表達,這一結果與李明霞等[36]在牦牛上的研究結果一致。但目前,有許多研究表明,BMP15基因的組織表達特點不盡相同,可能不同物種之間有所區別。Elis等[37]研究發現,BMP15基因在雞的卵巢以及其它組織中均有表達。劉世佳等[38]對綿羊的研究發現,BMP15基因在其卵巢以及十二指腸中高表達。H1299細胞系具有較大的細胞核,常被作為檢測亞細胞定位的工具。將BMP15質粒轉染至H1299細胞后,用激光共聚焦顯微鏡觀察,發現BMP15基因主要在細胞質內表達,同時卵巢免疫熒光結果顯示,BMP15主要定位在卵巢顆粒細胞的細胞質中,這些結果與其可能為分泌型蛋白的結果相一致。

BMP15基因在家兔卵泡生長發育過程中的調控作用還尚未報道,BMP15作為卵巢卵泡生長發育的重要調控因子,通過調控該基因的表達與活性可影響卵泡的生長和顆粒細胞的增殖與凋亡,最終影響家兔的繁殖性能,但其中具體的調控機制還需要深入探究。本研究獲得了新西蘭白兔BMP15基因的結構特點和表達特征,為進一步開展BMP15基因在家兔生長繁殖過程中的調控作用奠定了基礎。

4 結 論

本試驗成功克隆了新西蘭白兔BMP15基因的CDS區序列,全長1 182 bp ,編碼393個氨基酸。生物信息學分析表明,該蛋白與豬的親緣關系最近,與雞的親緣關系最遠。同時,該蛋白為堿性不穩定蛋白,并且還含有一個信號肽,可能為分泌型蛋白。蛋白互作分析表明,BMP15基因與多種蛋白質相互作用,這些蛋白在卵巢卵泡發育過程中具有一定的調控作用。組織表達分析表明,BMP15基因在新西蘭白兔卵巢組織中特異性表達,并且免疫熒光結果顯示BMP15表達于不同發育時期的卵泡顆粒細胞。亞細胞定位表明,BMP15主要分布在細胞質中。本試驗結果為進一步開展BMP15基因功能研究提供了理論依據。