剪接因子hnRNPF對蒙古馬精子生成的影響

翁雅娟,李 蓓,芒 來,薛嘉寧,特日格樂,宋代玲,王國慶,藺雅楠

(內蒙古農業大學動物科學學院,內蒙古自治區馬屬動物科學研究與技術創新重點實驗室,農業農村部馬屬動物遺傳育種與繁殖科學觀測實驗站,內蒙古農業大學馬屬動物研究中心,呼和浩特 010018)

可變剪接(alternative splicing,AS)又稱為選擇性剪接?？勺兗艚邮钦婧松铼氂械囊环N在生命演化漫長過程中產生的調控方式[1]。前體mRNA通過選擇不同的剪接方式產生不同結構的成熟mRNA這一過程稱為可變剪接(選擇性剪接)[2]。這種調控方式使原本有限的基因序列可以根據環境的不同而編碼出多樣、復雜的蛋白質,從而更好地適應復雜的生活環境[3]?？勺兗艚訋缀醢l生在所有動物體的組織中,雄性動物最重要的生殖器官—睪丸也不例外,睪丸組織是可變剪接mRNA異構體數量最豐富的組織之一[4]。精子生成又稱為精子發生,是以曲精細管為起始部位,精原細胞經過有絲分裂和兩次減數分裂等一系列生理過程變為精細胞,精細胞再變為精子的過程[5-8]。在精子發生的時期往往伴隨著十分復雜的機體調控機制。例如,蛋白質的新舊交替,激素類輔助與調節,細胞因子的靶向和調控等[9-10]。Chen 等[11]的研究結果表明,小鼠在發生可變剪接的基因數量變化模式與精子發生過程中的基因表達模式非常相似,說明可變剪接與雄性動物的精子生成密切相關。

前體mRNA的剪接主要通過形成剪接復合體的形式行使功能[12]。剪接復合體包含了核小RNA蛋白質復合體和其他多種蛋白質因子。這包括富含精氨酸和絲氨酸蛋白參與組成的核不均一核糖核蛋白(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein,hnRNP)家族,是各種前體mRNA被加工成為核糖或蛋白復合體過程中最主要的一類蛋白質[13]。hnRNP 家族C端富含甘氨酸,含有一個 RNA 識別域和一個核定位序列,C末端作用多樣,包括 RNA 結合、細胞定位及與蛋白之間的相互作用[14]。剪接過程主要包括剪接位點與前體mRNA剪接復合體的形成、內含子的切除和外顯子的連接、剪接產物的釋放與復合體的解聚[12]。hnRNP家族通過與剪接沉默子結合,防止SR蛋白或者剪接體組件與可調控外顯子的聯系,從而引起外顯子跳躍[15]。其中hnRNPF通過與剪接位點的G束結合來控制可變剪接[16]。叉狀頭轉錄因子FOXP3的外顯子2編碼區域與hnRNPF的第二個準RNA識別基序結合會抑制hnRNPF與靶前體mRNA結合,從而抑制可變剪接[17]。hnRNPF包含3種亞型:hnRNPH1、hnRNPH2與hnRNPH3,其中hnRNPH1在減數分裂細胞中表達并定位于染色體,會破壞減數分裂過程,損害生殖-支持細胞通信最終導致不育[18]。不止如此,當hnRNPF在細胞中異常表達時往往會伴隨著多種疾病的發生。

可變剪接事件的發生受剪接調節因子等的調控,剪接因子可通過對可變剪接調控,從而影響精子的生成。例如,牛睪丸中的某種結構蛋白與其精子的生成息息相關,可變剪接參與調控該基因的表達就會影響其精子的質量,進而影響種群的繁殖效率[19]。剪接調節因子,如多聚嘧啶區結合蛋白1(PTBP1)、多聚嘧啶區結合蛋白2(PTBP2)、RNA結合蛋白(RBMXL2和Sam68)等,可通過調控精子發生中的可變剪接事件保證精子的生成[20]。PTBP1和PTBP2是分別調節雄性哺乳動物睪丸中精原細胞有絲分裂和精母細胞減數分裂可變剪接的調節因子,能保證精子的正常生成;支架蛋白SYMPK是一種減數分裂所必需的相關蛋白,同時也與精原細胞的存活密切相關,在睪丸內表達量很高,該蛋白可以調控生殖細胞的可變剪接進而影響小鼠的精子生成過程[21-22]。孫武[23]發現,大部分睪丸表達基因都發生了可變剪接,而且發生在成熟期的比例明顯高于其他時期,表明可變剪接事件在睪丸發育及精子生成中發揮著關鍵性作用。既然正常的基因可變剪接能促進精子的生成,那么異常的可變剪接也會對精子生成產生抑制作用,而這種情況便會導致雄性的生殖性能受到影響,嚴重時甚至會導致不育,例如:無頭精子綜合征[24-25]。Li等[26]對未性成熟與性成熟蒙古馬睪丸進行了轉錄組測序可變剪接分析,發現精子發生過程中存在許多不同的可變剪接事件,發生可變剪接產生的不同蛋白質大多發生外顯子跳躍。國外尚未有文章報道有關馬屬動物可變剪接對精子生成的影響。

本課題組在前期的研究中發現剪接因子hnRNPF在蒙古馬性成熟后的睪丸組織中表達量較高,可能對蒙古馬精子生成具有一定的影響。為研究可變剪接因子對蒙古馬精子生成的作用,本試驗以蒙古馬為研究對象,構建hnRNPF過表達慢病毒載體,轉染至體外培養的蒙古馬睪丸支持細胞(sertoli cell,SC),檢測細胞的增殖情況及精子生成相關基因在不同細胞中的差異表達情況,揭示hnRNPF調控精子生成的作用機制,為提高蒙古馬精子數量與精液品質提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗對象 本研究采用蒙古馬睪丸支持細胞作為試驗材料。在試驗后續過程中所進行的細胞分離與體外培養的操作均嚴格按照本試驗室的流程進行[27]。

1.1.2 主要儀器、試劑 倒置相差顯微鏡(OLYMPUS)、數顯電熱恒溫水浴鍋(YiTong)、細胞計數板(Watson)、純水儀(OLABO)、-80 ℃冰箱(Haier)、臺式離心機(Sigma)、高速冷凍離心機(Sigma)、二氧化碳培養箱、超凈工作臺(ESCO)、CFX實時熒光定量PCR儀(Bio-Rad)、普通PCR反應擴增儀(Bio-Rad)。

細胞培養液(50 mL):DMEM/F-12培養基+1%丙酮酸鈉+10%胎牛血清(FBS)+2%雙抗+0.001 5 g 碳酸氫鈉(NaHCO3)+2% 谷氨酰胺;清洗液(50 mL):杜氏硝酸緩沖鹽溶液(DPBS)+1%雙抗;細胞凍存液:FBS+二甲基亞砜(DMSO);胰蛋白酶溶液(Gibco);細胞活力檢測試劑盒(biosharp);反轉錄試劑盒(TaKaRa);定量反轉錄聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)試劑盒(TaKaRa)。

1.2 試驗方法

1.2.1 hnRNPF過表達慢病毒載體的構建 通過NCBI官網https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/下載hnRNPF馬屬動物基因序列,由蘇州安升達生物科技有限公司進行過表達慢病毒載體的合成。

1.2.2 hnRNPF過表達慢病毒載體轉染蒙古馬睪丸支持細胞 選擇使用1×107濃度的過表達慢病毒載體進行轉染,將保存在-80 ℃冰箱中的過表達慢病毒載體取出,冰上溶解。實驗室前期研究顯示,蒙古馬睪丸支持細胞在第3代時細胞活性最高。取出培養好的第3代蒙古馬睪丸支持細胞,棄廢液,DPBS清洗兩次。根據病毒∶培養基為1∶9的比例抽取適量慢病毒載體和培養基注入培養皿中,混勻后放入37 ℃、5%二氧化碳培養箱中培養。24 h后吸去皿中液體,加入培養基。以24 h為間隔,不同時間段拍照觀察,確定最佳轉染時間。

1.2.3 CCK-8檢測細胞增殖活性 在96孔板中培養蒙古馬睪丸支持細胞,待細胞生長至約70%后,一組加入hnRNPF過表達慢病毒載體,一組不加,形成對照,每組設置4個重復。24 h后換液,并在分別轉染0、24、48、72 h時更換90 μL培養液和10 μL CCK-8試劑,細胞培養箱繼續孵育2 h,酶標儀檢測450 nm處吸光值,對比兩組細胞的增殖情況。

1.2.4 總RNA抽提試劑(TRIzol)法提取轉染細胞與未轉染細胞RNA并反轉錄為cDNA (1)將1 mL TRIzol試劑加入細胞培養基中,樣本充分渦旋混勻15 s。15～30 ℃靜置10 min。(2)TRlzol:氯仿為5∶1。按照比例添加氯仿。小心蓋好樣品管。用手大力搖管15 s。15～30 ℃ 孵育15 min。2～8 ℃,離心機12 000 g離心15 min。(3)離心結束后管中分3層。紅色為酚-氯仿相層。然后依次為中間相和水相層。水相層無色。水相層轉移至新管保存。(4)在室溫下孵育樣品10 min。離心機溫度控制在4 ℃,12 000 g離心10 min。(5)棄上清。用75%的乙醇洗滌 RNA 沉淀一次。渦旋振蕩將沉淀彈起來。4 ℃ ,7 500 g離心5 min。在該過程結束時,冰上干燥RNA沉淀30 min。無 RNA 酶水70 μL吹打幾次溶解 RNA 。(6)溶解后,用酶標儀測定RNA濃度及純度,利用反轉錄試劑盒迅速將RNA反轉錄成cDNA,-20 ℃保存樣本。

1.2.5 qRT-PCR檢測精子生成相關基因在兩種細胞中的差異表達 選取精子生成相關基因(PKMYT1、CDC25C、YWHAZ、BUB1、BTRC、CCNE1、CALM1、PLK1、REC8、MAPK3、ADCY7)設計引物(表1),由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 引物序列信息

將轉染后的細胞設為試驗組,未轉染的細胞為對照組,每組設置3個重復,選取GAPDH作為內參基因。反應體系:TB Green 12.5 μL,上、下游引物各1 μL,cDNA模板2 μL,RNase-free ddH2O 8.5 μL。反應條件:95 ℃預變性30 s;95 ℃變性5 s,60 ℃退火30 s,95 ℃延伸15 s,共40個循環;60 ℃退火30 s;4 ℃保存。

1.2.6 數據處理 qRT-PCR結果以F=2-ΔΔCt為運算公式計算,檢驗方法為獨立樣本t檢驗,P<0.05為差異顯著,使用Graphpad prism軟件作圖。

2 結 果

2.1 蒙古馬睪丸支持細胞培養

圖1為培養48 h蒙古馬睪丸支持細胞4倍鏡下圖片。由圖可見細胞已貼壁,視野內細胞數量多。蒙古馬睪丸支持細胞呈現細長梭狀,在顯微鏡下略顯透明,但輪廓清晰,細胞核明亮清楚。

圖1 蒙古馬睪丸支持細胞培養Fig.1 Culture of Mongolian horse testicular sertoli cells

2.2 hnRNPF過表達慢病毒載體構建

合成基因hnRNPF,連接至載體pGWLV10(GFP),構建hnRNPF in pGWLV10(GFP),大抽并去內毒素,包裝過表達慢病毒,滴度檢測。瓊脂糖凝膠電泳檢測構建結果如圖2所示,目的條帶與目的基因片段的長度相一致,證明 hnRNPF in pGWLV10(GFP)慢病毒構建成功,可以用于后續試驗。

圖中電泳圖譜泳道從左到右依次為空載體、hnRNPF過表達慢病毒載體(目的條帶)、參照條帶The electrophoresis lanes in the figure from left to right are empty vector, hnRNPF overexpression lentiviral vector (target bands), and reference bands

2.3 hnRNPF過表達慢病毒載體轉染蒙古馬睪丸支持細胞

將構建的hnRNPF過表達慢病毒載體轉染至支持細胞中,分別在24、48、72、96 h在熒光顯微鏡下觀察轉染效率。通過圖3比較發現,在72 和96 h載體轉染效率相同,說明載體在72 h后轉染效率不再升高,考慮細胞活性,轉染效率最適時間為72 h,故選擇載體轉染細胞72 h時用于后續試驗。

A-D圖依次為轉染時間24、48、72、96 h時熒光顯微鏡下轉染狀態The A-D plots show the transfection status under fluorescence microscope at 24, 48, 72 and 96 h of transfection

2.4 CCK-8檢測結果與分析

根據酶標儀數據結果,利用Graphpad prism軟件作圖顯示(圖4)?？梢园l現數據曲線呈先下降再上升的趨勢。兩組細胞的增殖情況從被轉染的24 h內出現下降趨勢,但在轉染24 h后呈現上升趨勢,并且轉染后的細胞增長趨勢始終高于未轉染的細胞。由此可得出,hnRNPF剪接因子會促進蒙古馬睪丸支持細胞的增殖。

圖4 hnRNPF過表達慢病毒感染細胞CCK-8活力增殖曲線Fig.4 Activity proliferation curve of cells transfected with hnRNPF overexpression lentivirus by CCK-8

2.5 qRT-PCR檢測結果與分析

選擇與精子生成相關基因進行實時熒光定量PCR試驗,以轉染hnRNPF過表達慢病毒細胞為試驗組,未轉染病毒細胞為對照組。以GAPDH作為內參基因,Graphpad prism軟件作圖(圖5)。結果顯示,上述11種基因在轉染病毒細胞中的表達量均遠高于對照組細胞,且差異顯著,說明hnRNPF可能對于蒙古馬精子生成具有促進作用。

*. P<0.05;**. P<0.01;***. P<0.001;****.P<0.000 1

3 討 論

精子生成是一個復雜的生理過程,包括有絲分裂、減數分裂和精子形成。大多可變剪接所需的反式作用剪接因子都在睪丸中表達。精子生成過程中一些重要的基因在特定的發育階段有著不同的剪接變異。參與基因可變剪接過程的剪接因子對精子生成具有重要意義。Ptbp2是神經系統中的重要可變剪接因子,可調節睪丸細胞中生殖細胞的mRNA可變剪接,對男性睪丸細胞的存活以及生殖能力至關重要。當生殖細胞中的Ptbp2缺失時會導致精母細胞和精細胞的增殖下降,并且伴隨睪丸中mRNA剪接異常,影響生殖細胞存活[20]。RNA結合蛋白Rbm5同樣也是男性生殖細胞中重要的剪接因子,對于精子生成選擇性剪接具有重要作用[28]。當Rbm5缺失時,大規模功能性基因的選擇性剪接發生異常,影響基因表達。Ranbp9是一種RNA結合蛋白,可以與多種剪接因子(SR蛋白和HNRNPs家族)結合共同調節與精子生成相關的可變剪接,確保精子生成可變剪接的正確性[29]。將生殖細胞中的Ranbp9特異性敲除會導致精母細胞和精細胞大量缺失,進而導致生殖能力明顯下降。乳腺癌擴增序列2(BCAS2)作為一種剪接因子通過復制蛋白A復合物參與DNA損傷修復,經過小鼠試驗發現BCAS2剪接因子對于小鼠受精卵的內源性及外源性DNA損傷具有修復作用,可以通過復制蛋白A復合物維持小鼠胎盤基因組的完整性[30]。BCAS2在小鼠睪丸中高度富集,Vasa-Cre 對生精細胞BCAS2有破壞作用,當BCAS2缺失時就會導致男性不育,對精母細胞具有影響但對精原細胞影響不大,經過進一步研究發現,BCAS2參與睪丸精原細胞的可變剪接并對精子發生過程中有絲分裂向減數分裂的轉變和男性生育能力具有重要作用[30]。有研究發現,改變轉錄因子環磷酸腺苷反應元件調節因子(CREM)的表達會導致男性不育,在對比了CREM發生可變剪接產生的不同異構體對人和種公馬精子生成的影響,發現缺乏CREM激活子同樣會導致種公馬不育[31]。

異質核糖核蛋白 (hnRNP)是在哺乳動物細胞中大量表達的典型RNA結合蛋白的大家族。在hnRNP蛋白中發現了4種不同類型的RNA結合結構域,包括RNA識別基序(RRM)、非經典準RRM(q-RRM)、富含甘氨酸的結構域和K同源性(KH)結構域[32]。核不均一核糖核蛋白hnRNPF包含3個非經典q-RRM,該蛋白最經典的功能是調節可變剪接,主要通過調節與外顯子相關的可變剪接事件來調節基因的可變剪接[33]。有體外研究表明,hnRNPF 通過其 q-RRM 直接結合富含 G 的前 mRNA 序列參與可變剪接調控[34]。雄性生殖細胞最獨特的特征是復雜的可變剪接模式,因此剪接因子在雄性生殖過程中就顯得尤為重要。通過檢測hnRNP家族在小鼠睪丸中的表達含量,發現hnRNPF在睪丸中高度表達[35]。因此,有理由相信hnRNPF在雄性生殖過程中具有重要的作用。目前,hnRNPF對雄性生殖系統及精子生成方面的具體影響還未可知。本研究發現,經過表達hnRNPF轉染后的SC細胞增殖情況要優于未轉染的SC細胞;說明剪接因子hnRNPF會促進蒙古馬睪丸支持細胞的增殖。為從基因水平上研究hnRNPF對精子生成的影響,本研究選取了11個與精子生成相關的基因,研究其在兩類細胞中的差異表達,例如:酪氨酸3-單加氧酶/色氨酸5單加氧酶激活蛋白(YWHAZ)通過與細胞周期調控因子(CDC25)蛋白結合并調節其功能,參與細胞G1/S期和G2/M期轉變,在有絲分裂間期發揮作用[36]。YWHAZ蛋白在小鼠早期胚胎的各個時期均有表達,同時定位于早期胚胎的細胞質與細胞核中,提示該蛋白可能在小鼠早期胚胎發育過程中發揮一定的作用。CDC25C是一種磷酸酶編碼基因,對細胞周期的調控有著重要作用[37]。蛋白激酶膜相關酪氨酸/蘇氨酸1(PKMYT1)是一種周期性的調節蛋白激酶,能夠有效地去除磷酸化,生物學功能是防止在細胞增殖時發生DNA改變[38]。苯并咪唑出芽抑制解除同源物蛋白1(BUB1)也影響細胞分裂,有研究表明,BUB1作為有絲分裂檢查點的平臺蛋白,可通過形成復合物的形式直接或間接對其他重要周期蛋白進行調控,從而影響整個細胞周期的進程[39-40]。Polo樣激酶1(PLK1)對于早期胚胎發育至關重要,有研究顯示PLK1會調節小鼠精子發生減數分裂過程中的DNA雙鏈斷裂(DSBs)修護[41]。敲除精子細胞中的PLK1會導致不育[42]。在本研究中,qRT-PCR試驗顯示精子生成相關基因的表達量在轉染過表達hnRNPF慢病毒載體的蒙古馬睪丸支持細胞中高于未轉染的細胞,且差異顯著,表明剪接因子hnRNPF可能通過調控上述基因的表達量從而調節精子生成,具體作用機理還需進一步的探尋。

4 結 論

本研究結果顯示,轉染了hnRNPF后的蒙古馬睪丸支持細胞增殖情況優于未轉染的細胞,精子生成相關基因在轉染后細胞中的表達量較高,且差異顯著。結果表明,剪接因子hnRNPF發生可變剪接可能對蒙古馬精子的生成起促進作用,研究成果為提高蒙古馬精子數量和精液品質提供了新的思路。