新的犬ANP32A的克隆及其在流感病毒跨物種感染中的作用

畢振威,王文杰,劉雅坤,彭大新

(1.江蘇省農業科學院獸醫研究所 農業農村部獸用生物制品工程技術重點實驗室,南京 210014;2.揚州大學江蘇省人獸共患病學重點實驗室,揚州 225009;3.獸用生物制品(泰州)國泰技術創新中心,泰州 225300)

A型流感病毒(influenza A virus,IAV)是一種單股、分節段負鏈RNA病毒,水禽是其最大的天然儲存庫。該病毒亞型眾多,可突破種間屏障跨物種感染傳播,宿主范圍十分廣泛[1]。H3N8亞型犬流感病毒(canine influenza virus, CIV)來源于馬,而H3N2亞型CIV是由禽流感病毒(avian influenza A virus, AIV)跨宿主傳染至犬形成的,兩種CIV均可在犬間傳播[2]。2006年,我國第一例H3N2 CIV在廣東省被報道,自此之后,H3N2 CIV在我國江蘇、浙江、遼寧、黑龍江等多地報道,并一直呈上升趨勢[3-5]。除此之外,多種亞型AIV,如H5N1[6]、H5N2[7]、H9N2[8]和H10N8[9]均被報道感染犬,犬越來越成為AIV的宿主。不僅如此,豬流感病毒和人的pdmH1N1(pandemic H1N1)流感病毒也可感染犬[10]。不同亞型流感病毒在犬體內重組而產生了新病毒,如H3N2 CIV與pdmH1N1的重組毒株[10]。因此,犬可成為流感病毒的“混合容器”。犬在促進流感病毒哺乳動物適應性和產生流感病毒重組毒株方面發揮著關鍵作用。因此,犬體內的流感病毒具有成為人畜共患傳染病原的風險。

流感病毒跨物種感染,其生命周期的各個階段均可能受到新宿主的限制。流感病毒RNA聚合酶催化病毒的復制和轉錄,同時需要大量宿主因子的參與,而不同物種的宿主因子差異性可能限制病毒RNA聚合酶活性,被認為是重要的物種屏障之一。酸性核磷蛋白32A(acidic nuclear phosphoprotein 32A, ANP32A)是ANP32蛋白家族成員,在細胞中具有多種功能,包括轉錄調節,染色質重構,mRNA輸出、細胞死亡,蛋白磷酸酶PP2A活性抑制等[11]。酸性核磷蛋白32A(ANP32A)在禽類與哺乳類中存在物種差異,禽類ANP32A比哺乳類多出33個氨基酸插入,能夠支持AIV的RNA聚合酶活性,而哺乳類ANP32A缺少33個氨基酸插入,而不能支持AIV的RNA聚合酶活性[12]。AIV感染哺乳動物發生基因突變,如PB2 E627K突變,以適應“較短”的哺乳類ANP32A。豬對AIV和哺乳動物流感病毒均易感,一直被認為是流感病毒的“混合容器”。研究發現,豬ANP32A比禽類也缺少33個氨基酸插入,但是豬ANP32A能支持AIV的RNA聚合酶活性。與其他哺乳動物ANP32A(106I/156P)相比,豬ANP32A是106V/156 S,這兩個位點的差異使豬ANP32A具有支持AIV的RNA聚合酶活性的功能[13-14]。AIV已經跨物種感染犬,那么犬ANP32A(caANP32A)是否也能像豬ANP32A對AIV RNA聚合酶活性有支持作用?目前已有關于犬ANP32A蛋白對A型流感病毒RNA聚合酶活性影響的報道[15]。但是ANP32A有不同的剪接變體,對流感病毒RNA聚合酶活性的調控也存在差異[16]。犬是否存在與已知報道不同的其它ANP32A形式也未知。

本研究從MDCK細胞及犬的組織中克隆caANP32A,以期發現新的caANP32A。利用流感病毒RNA聚合酶雙熒光報告系統探索新的caANP32A對流感病毒RNA聚合酶活性的影響,分析caANP32A在流感病毒跨物種感染中的作用,為解析CIV的哺乳動物的適應機制提供新的理論依據,對于防控CIV具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

Trizol購自北京天恩澤基因科技有限公司;基因組DNA提取試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司;反轉錄酶試劑盒購自翌圣生物科技(上海)股份有限公司;質粒小量提取試劑盒、膠回收試劑盒為OMEGA公司產品;蛋白Marker購自擎科生物科技有限公司;鼠源抗Flag標簽抗體為Sigma公司產品;兔源抗Myc標簽多克隆抗體(R1208-1,杭州華安生物科技有限公司);HRP標記的羊抗鼠抗體購自博奧龍生物科技有限公司;A488標記的驢抗兔抗體(A488-LKT,A21206)和A546標記的驢抗鼠抗體(A546-LKS,A10036)購自Invitrogen公司;DNA高保真酶Mix、同源重組酶、雙熒光素酶報告基因試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司;jetPRIME轉染試劑為Polyplus公司產品;NP-40細胞裂解液、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液購自碧云天生物技術有限公司;EcoRⅠ和XhoⅠ購自NEB公司;DNA Marker購自寶生物技術工程有限公司(大連)。

1.2 樣品來源、質粒及毒株

犬脾、肺、腸組織樣品均取自中華田園犬,由本實驗保存;pCA-Flag-chANP32A-X1、pCA-Flag-chANP32A-X2、pCA-Flag-huANP32A真核表達質粒及H9N2流感病毒[A/chicken/Zhejiang/A2013/2017 (H9N2)]聚合酶活性雙熒光素酶報告基因系統由畢振威在南京農業大學免疫研究所攻讀博士學位期間構建[17];H3N2亞型犬流感病毒[A/Canine/Nanjing/11/2012(H3N2)]由本實驗室分離鑒定[18];以H3N2 CIV流感病毒NA基因為模板,按照畢振威的方法[17],構建含有人PolⅠ啟動子的螢火蟲熒光素酶報告基因質粒phuPolⅠ-vNA-Luc;含有海腎熒光素酶報告基因的內參質粒pRL-TK均由本實驗室制備并保存;293 T細胞、MDCK細胞由本實驗室保存;H3N2 CIV的RNA聚合酶PB2/PB1/PA以及NP真核表達質粒均構建于pCAGGS表達載體上。

1.3 引物的設計及合成

參考GenBank中公布的caANP32A基因ORF序列(NM_001003013)設計特異性引物, 并在5′端加上同源臂(下劃線部分),針對caANP32A基因組(NM_001003013)的外顯子4和外顯子5周圍的序列設計3對引物,(表1)。引物由生工生物工程有限公司(上海)合成。

表1 引物序列

1.4 組織、細胞RNA/DNA提取及反轉錄

將犬脾、肺及腸組織分別取約0.1 g剪成小塊,或培養收獲MDCK細胞(1×106個),按照TRizol法提取RNA,將提取的RNA進行反轉錄,取0.5～1.0 μg RNA,以隨機引物按照反轉錄試劑盒說明書反轉錄獲得cDNA。反轉錄反應體系與程序:模板RNA 0.5～1 μg、5×gDNA digester Mix 3 μL、RNase-free ddH2O加到15 μL,輕輕混勻,42 ℃孵育2 min,加入4×Hifair?Ⅲ SuperMix plus 5 μL,輕輕混勻,25 ℃ 5 min,55 ℃ 15 min,85 ℃ 5 min。將培養收獲的MDCK細胞(1×106個)用基因組DNA提取試劑盒提取細胞DNA。將反轉錄的cDNA產物和提取的DNA置于-20 ℃冰箱凍存。

1.5 caANP32A mRNA和基因的擴增及真核表達質粒的構建

以反轉錄的cDNA為模板,用caANP32A-F和caANP32A-R為引物擴增MDCK及犬肺、脾、腸的caANP32A。PCR反應體系(50 μL):2×Phanta Max Master Mix(Dye Plus)25 μL、上游引物F和下游引物R各2 μL、DNA模板2 μL、ddH2O 19 μL。PCR反應條件:95 ℃ 3 min;95 ℃ 15 s,56 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,35個循環;72 ℃ 7 min,16 ℃保存。將PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,用DNA膠純化回收試劑盒回收。將pCAGGS-Flag載體用EcoRⅠ和XhoⅠ進行雙酶切,取線性化的載體50 ng,加入5×CE II buffer 4 μL和Exnase 2 μL,補水至20 μL,輕輕混勻,置于37 ℃反應30 min,冷卻5 min。取5 μL反應產物加入E.coliDH5α感受態細胞,輕輕混勻,42 ℃作用90 s,加入LB培養基,37 ℃搖床45 min;將培養菌液4 000 r·min-1離心5 min收集菌體,用100 μL LB培養基重懸涂于含氨芐青霉素的LB平板。挑取單個菌落由南京擎科生物技術有限公司和通用生物(安徽)股份有限公司測序。以提取的MDCK細胞的DNA為模板,分別用引物F1/引物R1、引物F2/引物R2、引物F3/引物R3進行PCR擴增,PCR反應體系和反應條件與上述方法相同。將擴增的PCR產物連接到pMD-19 T simple載體,并進行測序。利用DNAStar軟件進行氨基酸序列比對。

1.6 激光共聚焦試驗

將293 T細胞接種到激光共聚焦小皿中,于5% CO2和37 ℃培養箱培養過夜。將pCA-Flag-caANP32A與H3N2 CIV RNA聚合酶亞基pCA-Myc-PB2、PB1和PA共轉染293 T細胞。轉染24 h后,吸棄培養基,用PBS洗兩遍,然后用4%多聚甲醛在室溫下固定30 min,并用0.1% Triton-X-100透化15 min,在5%牛血清白蛋白(BSA)中封閉30 min后,將細胞與鼠源抗Flag抗體及兔源抗Myc抗體37 ℃孵育1 h,用PBS洗滌三次,每次5 min,然后用A488標記的驢抗兔抗體和A546標記的驢抗鼠抗體作為二抗,在37 ℃孵育1 h。隨后用PBS洗滌三次,細胞核用DAPI染色15 min,洗滌三次。然后將激光共聚焦小皿置于激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.7 caANP32A對流感病毒RNA聚合酶活性的影響

將293 T細胞鋪于24孔板中,培養約16 h待細胞密度達60%～80%左右,分別將pCA-flag-chANP32A-X1、pCA-flag-caANP32A-1、pCA-flag-caANP32A-2、pCA-flag-huANP32A真核表達質粒與H9N2 AIV、H3N2 CIV的RNA聚合酶亞基和NP基因真核表達質粒pCAGGS-PA/PB1/PB2/NP以及phuPol Ⅰ-vNA-Luc和pRL-TK共轉染293 T細胞。所使用的脂質體是jetPRIME,轉染體系如下:每孔按PA(0.1 μg)、PB1(0.1 μg)、PB2(0.1 μg)、NP(0.1 μg)、phuPol Ⅰ-vNA-Luc(0.05 μg)和pRL-TK(0.05 μg),以及ANP32A真核表達質粒(0.2 μg)或pCAGGS-Flag空載體(0.2 μg)加入25 μL無血清的Opti-MEM培養基中充分混合均勻,靜置5 min,然后加入2 μL jetPRIME轉染試劑,混勻后于室溫靜置5 min。加入鋪有293 T細胞的24孔板中的每孔內,置于37 ℃培養箱內培養24 h。轉染24 h后棄掉細胞培養液,參照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書裂解細胞和取樣,利用多功能熒光檢測儀測定Firefly和Renilla的熒光值,計算出流感病毒聚合酶的相對活性。

1.8 統計分析

2 結 果

2.1 caANP32A的克隆和序列分析

從MDCK細胞中用RT-PCR反應擴增獲得大小在750～1 000 bp之間的目的條帶(圖1A),用同源重組的方法將該目的條帶與pCAGGS-Flag載體連接,轉化E.coliDH5α,挑取10個陽性單菌落進行測序。結果表明,在MDCK細胞中擴增到兩種不同的序列,分別命名為caANP32A-1和caANP32A-2。caANP32A的大小為762 bp,推導的氨基酸序列為253aa。caANP32A-1的59、147位點處的氨基酸為N、V,而caANP32A-2這兩個位點處的氨基酸為D、G。將該caANP32A氨基酸序列與禽類ANP32A(chANP32A-X1、chANP32A-X2)及其他哺乳類ANP32A(huANP32A、swANP32A和caANP32A)進行比較,結果本研究擴增的caANP32A比之前已經報道的caANP32A以及huANP32A、swANP32A多出4個氨基酸(176LSLV179),而多出來的4個氨基酸與chANP32A-X1的177LSLV180一樣(圖1B、圖2)。因此,作者擴增和克隆到新的caANP32A。進一步地,從犬肺組織中擴增到caANP32A-1,從犬脾組織中擴增到caANP32A-2,從犬腸組織中擴增到caANP32A-1和caANP32A-2。

A.PCR擴增結果(M. DL5000 DNA 相對分子質量標準;1. caANP32A cDNA的原液; 2. caANP32A cDNA的10倍稀釋; 3. caANP32A cDNA的100倍稀釋; 4. 正常MDCK細胞); B. 測序結果,黑框為“176LSLV179”對應的核苷酸A. Amplification results of PCR(M. DL5000 DNA marker;1.Original solution of caANP32A cDNA; 2.10×dilution of caANP32A cDNA; 3.100×dilution of caANP32A cDNA; 4. Normal MDCK cells); B. Sequencing result, the black box showed the nucleotide corresponding to "176LSLV179"

圖2 不同物種ANP32A氨基酸序列比對Fig.2 Amino acid alignment of ANP32A in different species

2.2 caANP32A部分基因的克隆和測序

禽類ANP32A是由8個外顯子拼接而成的,雞的內含子4含有兩個3′剪接位點(3′ splice site, 3′ss),這兩個位點相差12 bp。ChANP32A-X1是由近端的3′ss位點剪接而成,而chANP32A-X2是由遠端的3′ss位點剪接而成,因此chANP32A-X1比chANP32A-X2多出4個氨基酸殘基。與禽類相比,哺乳類ANP32A缺少禽類ANP32A的外顯子5(外顯子5由99 bp堿基組成,編碼33個氨基酸),因此,哺乳類ANP32A是由7個外顯子剪接而成的。為了檢測新的caANP32A的176LSLV179的來源,設計了3對引物對caANP32A外顯子4、外顯子5及其之間的內含子4的基因進行PCR擴增(圖3)。如圖4所示,擴增的序列結果與NCBI中注冊的caANP32A(注冊號:NM_001003013)一致,均查找不到“TTATCTCTAGTG”,因此氨基酸序列“176LSLV179”并不能從caANP32A基因序列中推導獲得,表明這種改變的發生不是在DNA水平上,因此,作者發現的新的caANP32A并不是由基因編碼的外顯子mRNA剪接形成的。

藍色框為外顯子4,綠色框為外顯子5The blue box represents exon 4, and the green box represents exon 5

2.3 caANP32A與H3N2犬流感病毒RNA聚合酶共定位

將pCA-Flag-caANP32A載體轉染293T細胞,24 h后收獲細胞,進行Western blot,用Flag抗體檢測Flag-caANP32A在細胞中的表達。結果顯示,空載體未見陽性反應條帶,而pCAGGS-Flag-caANP32A-1、pCAGGS-Flag-caANP32A-2和pCAGGS-Flag-huANP32A在33～43 ku出現特異性條帶,但與Flag-caANP32A的分子量理論值30 ku(caANP32A的分子量理論值為29 ku,Flag標簽的分子量理論值為1 ku左右)稍偏大,這可能與caANP32A在細胞中存在一些翻譯后修飾有關,表明pCAGGS-Flag-caANP32A蛋白在293T細胞中成功獲得表達(圖5A)。將Flag-caANP32A與H3N2 CIV的RNA聚合酶Myc-PB2、PB1、PA共轉染293T細胞,激光共聚焦結果顯示,caANP32A和RNA聚合酶在細胞核中發生共定位現象(圖5B)。

A. Western blot(1. pCAGGS-Flag空載體;2. pCA-Flag-caANP32A-1真核表達質粒;3. pCA-Flag-caANP32A-2真核表達質粒;4. pCA-Flag-huANP32A真核表達質粒); B. caANP32A與H3N2 CIV RNA聚合酶共定位A. Western blot (1. PCAGGS-Flag empty carrier; 2. pCA-Flag caANP32A-1 eukaryotic expression plasmid; 3. pCA-Flag caANP32A-2 eukaryotic expression plasmid; 4. pCA-Flag huaANP32A eukaryotic expression plasmid); B. Co-location of caANP32A and H3N2 CIV RNA polymerase

2.4 caANP32A對流感病毒RNA聚合酶活性的影響

將chANP32A-1、caANP32A-1、caANP32A-2、huANP32A表達質粒分別與H9N2 AIV、H3N2 CIV的RNA聚合酶PB1/PB2/PA和NP真核表達質粒以及vNA-Luc、pRL-TK真核表達質粒共轉染293T細胞,24 h后收獲細胞,檢測流感病毒RNA聚合酶的活性。結果顯示,過表達chANP32A-X1均顯著促進了H9N2 AIV和H3N2 CIV的RNA聚合酶活性,而過表達新的caANP32A-1、caANP32A-2和huANP32A均不能促進H9N2 AIV和H3N2 CIV的RNA聚合酶活性(圖6)。

3 討 論

禽源ANP32A存在不同的剪接變體,對AIV的RNA聚合酶適應性和病毒進化的驅動力不同。雞ANP32A是由8個外顯子拼接而成的,內含子4含有兩個3′的剪接位點(3′ss),這兩個位點相差12 bp。由內含子4近端的3′ss位點剪接形成的外顯子5為99 bp,而由遠端的3′ss位點剪接而成的外顯子5為87 bp,由此形成了剪接體chANP32A-X1比chANP32A-X2多出4個氨基酸殘基。而chANP32A-X3在剪接時缺少外顯子5,比chANP32A-X1少33個氨基酸插入。人ANP32A基因組缺少轉錄外顯子5的基因,因此人ANP32A是由7個外顯子剪接而成,比chANP32A-X1少33個氨基酸插入[16]。NCBI中注冊的犬ANP32A很少,且為預測的序列信息,張媛等[15]克隆到了1個caANP32A轉錄本,與其它哺乳動物一樣,比chANP32A-X1少33個氨基酸插入。本研究從MDCK細胞和犬組織中克隆出一個新的caANP32A變體,比已報道的caANP32A多出4個氨基酸插入(LSLV),與chANP32A-X1中33個氨基酸插入的150LSLV168一致。通過對caANP32A基因組測序發現,該序列不能從基因組DNA序列中推導獲得,表明這種改變的發生不是在DNA水平上,因此,作者發現的新的caANP32A并不是剪接形成的。RNA編輯是轉錄后的RNA在編碼區發生堿基的加入,丟失或轉換等現象[19]。該新的caANP32A可能是在RNA水平增加了原來DNA模板中不曾編碼的堿基。

2016年,Long等[12]首次揭示了AIV的RNA聚合酶在不同宿主細胞中的適應性與ANP32A的種屬特異性相關。禽類ANP32A在175 aa位置處插入了額外的33個氨基酸片段,能支持AIV的RNA聚合酶活性,而哺乳類ANP32A缺少這33 aa片段,限制了AIV的RNA聚合酶活性[12]。33個氨基酸片段有27aa是ANP32A的(149DRDDKEA-PDSDAEGYVEGLDDEEEDED175)的重復序列,剩下的為6個獨特的氨基酸 (176VLSLVK181),其中176VLSLV180被認為SUMO互作基序序列(SUMO interaction motif-like sequence, SIM)[20]。作者前期發現,在huANP32A的175 aa處插入6 aa(176VLSLVK181)能支持AIV的RNA聚合酶活性,盡管活性不及整個33 aa,而huANP32A加入27aa則不能支持AIV的RNA聚合酶活性,表明33 aa插入的6個氨基酸(176VLSLV1806aa)在ANP32A支持AIV的RNA聚合酶活性中起著重要的作用[21]。chANP32A-X2由于缺乏6個aa中的4個aa(176VLSL179)嚴重破壞了其對AIV的RNA聚合酶的支持作用[21]。本研究克隆鑒定到一個新的caANP32A,該caANP32A在175 aa多了6 aa中的4 aa(LSLV片段),但仍然不能促進AIV的RNA聚合酶活性。而作者之前發現huANP32A插入4aa(176VLSL179)也不能促進AIV的RNA聚合酶活性?？梢?6個氨基酸(176VLSLV1806aa)的完整性是chANP32A支持AIV的RNA聚合酶所必需的。

豬對于感染禽和哺乳動物的流感病毒均易感,被認為是流感病毒的“混合容器”。盡管豬ANP32A比禽類同樣缺少33 aa插入,但與其它哺乳動物不同,豬ANP32A能支持AIV的RNA聚合酶活性。與其他哺乳動物物種的ANP32A(106I/156P)相比,豬ANP32A為106V/156 S,增強了豬ANP32A和AIV RNA聚合酶之間的相互作用從而支持AIV的RNA聚合酶活性[13-14]。作者發現的新caANP32A在這兩個氨基酸位點未發生I106V/P156 S突變,也不能支持AIV的RNA聚合酶活性。因此caANP32A對AIV的RNA聚合酶仍然具有物種限制性。

H3N2亞型CIV未發生PB2 E627K哺乳動物適應性突變,仍然保持禽流感病毒PB2 627E位點。與chANP32A-X1能促進CIV 的RNA聚合酶活性相比,caANP32A則不能,表明caANP32A對CIV仍然具有較強的宿主限制性。這可能是單純的CIV感染并不能引起犬嚴重的臨床癥狀的重要原因。通過比對發現,caANP32A與huANP32A的核苷酸相似性是94.1%,氨基酸序列相似性為95.2%,存在12個氨基酸變異,但在293 T細胞上過表達caANP32A與huANP32A均不能促進CIV的RNA聚合酶活性,表明caANP32A和huANP32A對AIV的RNA聚合酶的限制作用相同。與CIV能感染犬不同,目前并沒有人感染CIV的報道。除了ANP32A,最近研究發現,huANP32B在促使PB2 E627K突變中起關鍵的主要作用,而caANP32B則不能,表明AIV在犬和人上發生哺乳動物適應性突變不同[22]。另外,犬呼吸道含有IAV使用的兩種唾液酸受體(2,3-和2,6-連接)[23],而人則僅僅含有2,6-連接的唾液酸受體。這些發現可能解釋CIV尚未感染人的原因。本研究所用的毒株為2012年分離到的,為早期毒株,最新的研究發現,H3N2 CIV具備了人樣受體結合能力,且在人支氣管上皮細胞中的復制能力也逐漸增加,H3N2 CIV對公共衛生安全的潛在威脅性增強,值得警惕[24]。

4 結 論

克隆了新的犬物種特異的酸性核磷蛋白32A(caANP32A),在176～179位存在四個氨基酸LSLV的插入,但新caANP32A對AIV的RNA聚合酶活性仍然有物種限制性,且該新的caANP32A也未增強CIV的RNA聚合酶活性。