脂磷壁酸合成酶ltaS基因缺失對產單核細胞李氏桿菌致病性的影響

秦 祎,胡文潔,方小偉,郭 騫,田籃鑫,劉 芳,方 春*

(1.長江大學動物科學學院,荊州 434025;2.衡水市農業綜合行政執法支隊,衡水 053000)

產單核細胞李氏桿菌(Listeriamonocytogenes,LM)是細胞內寄生的革蘭陽性菌,也是一種食源性人獸共患病原菌[1]。產單核細胞李氏桿菌具有較強的抗應激能力,例如酸性環境,堿性環境,低溫等[2]。產單核細胞李氏桿菌的生存和繁殖所需的養分來自宿主細胞,而如何從宿主細胞中攝取所需的養分,是LM生存的關鍵因素[3]。產單核細胞李氏桿菌可以通過污染的食物進入胃腸道后擴展至血液循環與淋巴循環進而突破胎盤屏障,血腦屏障等,在其感染過程的每一步均由特定的毒力因子介導(如InlA與InlB)[4-5]。

磷壁酸是革蘭陽性菌的一種特殊的化學結構,其中包含了脂磷壁酸(lipoteichoic acid, LTA)和壁磷壁酸(wall teichoic acid, WTA)[6]。脂磷壁酸是革蘭陽性細菌中重要的細胞壁聚合物,通常由聚甘油磷酸骨架組成,該骨架通過糖脂與膜相連,使用生物信息學方法已經確定參與糖脂(lmo2555和lmo2554)和LTA骨架(lmo0644和lmo0927)合成的產單核細胞李氏桿菌基因[7]。lmo0927和lmo0644編碼的蛋白質與負責聚甘油磷酸骨架合成的葡萄球菌LTA合成酶LtaS具有高度相似性。lmo0644充當LTA引發酶LtaP并將初始甘油磷酸轉移到糖脂錨上,而Lmo0927作為LTA合成酶LtaS,延長甘油磷酸骨架[7]。

在產單核細胞李氏桿菌中,磷壁酸能夠影響參與穿越宿主屏障的蛋白質與細胞壁共價或非共價相關蛋白。如InlA和InlB都是由細胞表面蛋白或分泌蛋白組成的,它們能夠轉移到細胞外并且錨定在特定部位,這對產單核細胞李氏桿菌的功能起著關鍵作用。雖然參與產單核細胞李氏桿菌蛋白轉位的系統有六個,如菌毛蛋白裝置(FPE)、鞭毛輸出裝置(FEA)、雙精氨酸分泌系統(Tat)以及Sec轉位系統等[8],但是Sec分泌系統是最重要的蛋白轉位系統之一。InlA和InlB都是通過Sec體系進行轉位的,在InlA轉位后,其LPXTG基因的基因序列被用 SrtA和細胞壁進行了共價的連接[9]。而InlB經折疊處理后,以非共價態固定于GW基鏈上的細菌表面,并且包含LTA和WTA。本文構建脂磷壁酸合成酶ltaS基因缺失株,并且通過Western blot試驗、細胞黏附侵襲試驗、細胞吞噬與胞內增殖試驗、小鼠致病性試驗來分析脂磷壁酸合成酶ltaS基因的缺失對產單核細胞李氏桿菌InlA和InlB錨定中的作用以及對產單核細胞李氏桿菌毒力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要材料 產單核細胞李氏桿菌EGDe-prfA*(血清型為1/2a型),穿梭質粒pKSV7由長江大學動物病原微生物實驗室保存。雞成纖維細胞DF-1細胞和小鼠巨噬細胞RAW264.7細胞由長江大學動物病原微生物學實驗室保存。BALB/c小鼠購自長江大學醫學院實驗動物中心。

1.1.2 主要試劑 腦心營養肉湯(BHI,HB8297-5)從青島高新技術園區海博生物科技有限公司購入;HRP標記山羊抗兔 IgG及 ECL顯影液從上海生工生物科技有限公司購入;核酸染料 Goldview從北京索萊寶科技有限公司購入;Onestep無縫克隆試劑盒從北京康普匯維科技有限公司購入;瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒及 DNA Marker購自武漢擎科生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 缺失株的構建 缺失株構建方法按參照文獻進行[10-11],基于產單核細胞李氏桿菌EGDe基因組(登錄號NC003210)利用Vector NTI軟件設計目的基因ltaS(lmo0927)缺失株所需的引物(表1);首先用引物pFL018-A/B和pFL018-C/D擴增出ltaS上游及下游的同源臂。將第一輪PCR產物共同回收純化作為 PCR模板,用pFL018-A/D引物進行融合同源臂。純化融合的同源臂,連接經過BamHⅠ線性化載體pKSV7構建重組穿梭質粒pFL018。使用電轉法將重組穿梭質粒pFL018轉入親本株感受態細胞中,經41 ℃的連續氯霉素抗性傳代進行同源性重組,再28 ℃連續無抗傳代消除質粒,使用旁側引物pFL018-A/E PCR鑒定缺失株ΔltaS構建成功。

表1 本研究所用的引物

1.2.2 生物學特性的測定 生長曲線試驗測定方法按參照文獻進行[12],將EGDe-prfA*和ΔltaS挑單菌落于3 mL BHI培養基中,37 ℃搖床220 r·min-1過夜培養。次日取1 mL菌液,12 000 r·min-1離心后用1 mL BHI重懸菌體,使用BHI稀釋至10-2,渦旋混勻后取200 μL菌液接于96孔板,每個組設3個平行,于37 ℃恒溫培養箱中培養,每間隔1 h使用酶標儀測定OD600 nm值直至細菌生長平臺期。

使用革蘭染色法觀察細菌的形態特征,分別挑取EGDe-prfA*和ΔltaS的單菌落于3 mL BHI液體培養基中,置于37 ℃恒溫培養箱過夜培養。次日取1 mL菌液,12 000 r·min-1離心后用1 mL 1×PBS重懸菌體后取10 μL菌液涂布于載玻片中間,干燥、固定后進行染色,初染滴加草酸鉸結晶紫水洗后滴加碘液媒染,媒染后使用95%乙醇脫色,最后用番紅復染再水洗,自然干燥后使用光學顯微鏡進行細菌形態的觀察。

1.2.3 Western blot檢測 蛋白樣品制備參照文獻進行[13],將菌液劃線于無抗BHI平板,置于37 ℃ 培養箱過夜培養;次日挑取單菌落于無抗BHI培養基中37 ℃ 搖床220 r·min-1過夜培養;將培養菌液按1∶50轉接于50 mL BHI培養基,置于37 ℃搖床220 r·min-1培養10 h后12 000 r·min-1離心收集上清和菌體沉淀。菌體沉淀用PBS洗滌后加入含2% SDS的PBS重懸,置于37 ℃恒溫培養箱靜置2 h,間隔10 min渦旋一次,最后12 000 r·min-1離心并收集上清,則為表面蛋白樣品。取40 μL蛋白樣品加入10 μL的 SDS-PAGE上樣緩沖液混勻,煮沸10 min后離心。按相應配方配制12% SDS-PAGE蛋白膠,將預染蛋白 Marker及10 μL樣品一次加入膠孔,進行SDS-PAGE分離濕轉法轉膜(80 min 230 mA)將PAGE膠上蛋白轉移至PVDF膜上封閉采用1×TBST配制5%脫脂乳浸泡膜,置于25 ℃的搖床60 r·min-1封閉2 h;用 1×TBST清洗2～3次,然后將膜放入一抗溶液中,一抗為5%脫脂乳(TBST 配制),對應于1∶500的自制InlA、InlB、GAPDH多克隆抗體血清,在4 ℃靜置孵育過夜;次日使用 1×TBST清洗膜5次,每次10 min;二抗在5%的脫脂乳與1∶5 000羊抗兔IgG二抗中,置于25 ℃ 60 r·min-1的搖床中培養1 h;二抗孵育完成后,使用 1×TBST清洗5次,每次10 min,將 ECL顯影液均勻鋪于薄膜表面,并使用化學發光成像系統進行顯影。使用軟件Image J分析軟件對Western blot圖像數據進行灰度分析,用內參GAPDH灰度值校正各組分中對應的目的條帶灰度值,相對灰度值為校正后缺失株的灰度值與親本株比值。

1.2.4 細胞黏附與侵襲試驗 試驗方法按參照文獻進行[12],將DF-1細胞以2×105細胞·孔-1接種于24孔板,在5% CO2培養皿中靜置過夜,24 h后,用950 μL的無抗生素的細胞培養液替代;添加50 μL的稀釋度適宜的菌液,使感染的復數(MOI)大約為10∶1,將其混勻后置于37 ℃ 的5% CO2培養皿內,用平板計數法計數實際感染劑量N0。黏附試驗,感染后30 min,棄掉培養液,PBS清洗3次,將1 mL ddH2O加入各個孔,充分吹打使細胞裂解,稀釋后用平板計數法計數黏附的菌數目N1。黏附率計算方法為N1/N0×100%。侵襲試驗,感染后30 min,棄掉培養液,PBS清洗3次后添加含有50 μg·mL-1慶大霉素的DMEM培養基,置于細胞培養箱中培養1 h后用PBS洗3次,使用相同的方式進行細胞裂解,用平板計數法計數入侵細胞的細菌數量N2,侵襲率計算方法為N2/N0×100%。

1.2.5 細胞吞噬與巨噬細胞內增殖試驗 細菌吞噬與巨噬細胞內增殖試驗的細胞培養方法與黏附侵襲試驗相同。細菌抗吞噬試驗,細菌與細胞混勻感染30 min后,棄掉培養液,PBS清洗3次后添加含有50 μg·mL-1慶大霉素的DMEM培養基,置于細胞培養箱中溫養1 h,根據細胞黏附侵襲試驗棄培養液,清洗,裂解細胞,稀釋,用平板計數測定吞噬細胞的數量N3。巨噬細胞內增殖試驗,細菌與細胞混勻感染30 min后,棄掉培養液,PBS清洗3次后添加含有50 μg·mL-1慶大霉素的DMEM培養基,置于細胞培養箱中溫養4 h,棄培養液、清洗、細胞裂解、稀釋,用平板計數法計數細胞的數量N4。吞噬率計算方法為N3/N0×100%;增殖倍數計算方法為N4/N3,試驗3次重復。

1.2.6 小鼠致病性試驗 將BALB/c小鼠隨機分為3組,親本株組和缺失株組各12只,未感染組5只,飼養一周,使小鼠適應環境。菌液劃線于無抗BHI平板,置于37 ℃ 培養箱過夜培養。第二天離心收菌,用PBS緩沖液(磷酸鹽緩沖液)洗滌3次,調節OD600 nm至0.6,然后將菌液用PBS稀釋100倍。將稀釋的菌液經腹腔注射感染小鼠,每只注射0.2 mL(約為4.0×106CFU)用點板計數來測定真實的感染劑量,未感染組的5只小鼠注射0.2 mL PBS,作為對照。在注射后48 h隨機選擇親本株組和缺失株組小鼠各7只,在超凈臺中無菌操作取出小鼠肝和脾,磨碎后在研缽中加入1 mL的PBS緩沖液轉移至EP管內,再將組織原液進行梯度稀釋點板計算肝和脾細菌數量。各組剩余的5只小鼠,繼續觀察,記錄存活情況,繪制存活曲線。對于LD50試驗,將原始菌液(約為2.0×109CFU)梯度稀釋至10-2、10-3、10-4三個梯度,每個梯度腹腔接種0.2 mL至BALB/c小鼠,每組8只。使用改良寇氏法計算7 d內親本株EGDe-prfA*與缺失株ΔltaS對BALB/c小鼠半數致死量LD50。

1.2.7 統計分析 用3個重復試驗的平均值和標準偏差來表達結果,用 GraphPad Prism 5作圖,采用非配對t檢驗(unpairedttest)法進行統計學分析,P<0.05表明有統計學差異,差異顯著,使用“*”標注;P<0.01表明有統計學差異,差異極顯著,使用“**”標注;P>0.05表明差異不顯著,使用“ns”標注。

2 結 果

2.1 缺失株的構建

親本株EGDe-prfA*基因組作為模板,用引物pFL018-A/B和pFL018-C/D,分別獲得上游同源臂610 bp、下游同源臂697 bp片段。(圖1A);將PCR產物回收純化后作為模板,用引物pFL018-A/D進行擴增,獲得1 307 bp的融合同源臂片段(圖1A)。將融合同源臂片段純化后與線性化的pKSV7重組連接轉化后成功構建重組質粒pFL018(圖1 B)。使用電轉法將重組質粒pFL018轉入親本株感受態細胞中(圖1B),經41 ℃的持續性有抗傳代來篩選重組后的菌株,并在28 ℃連續無抗傳代,以不間斷傳代的方式消除質粒,使用旁側引物采用PCR方法鑒定篩選缺失株ΔltaS(圖1C)。

M.DNA 相對分子質量標準;1. 上游同源臂;2. 下游同源臂;3. 融合的同源臂;4. DH5α-pFL018;5.EGDe-prfA*-pFL018;6. 親本株EGDe-prfA*;7. 缺失株ΔltaSM.DNA marker;1. Upstream homology arm; 2. Downstream homology arm; 3. Fusion homologous arm; 4. DH5α-pFL018; 5. EGDe-prfA*-pFL018; 6. Parent strain EGDe-prfA*; 7. Mutant strain ΔltaS

2.2 ltaS缺失不影響產單核細胞李氏桿菌的生長和菌體形態

體外培養試驗結果表明,缺失株ΔltaS與親本株EGDe-prfA*在細菌遲緩期、對數生長期以及平臺期基本一致(圖2A)。將缺失株ΔltaS與親本株EGDe-prfA*進行革蘭染色后鏡檢發現菌體形態無變化(圖2B)。

圖2 細菌生長曲線測定(A)以及細菌形態觀察(B)Fig.2 Determination of bacterial growth curve (A) and observation of bacterial morphology (B)

2.3 ltaS缺失減少產單核細胞李氏桿菌表面錨定的InlB

Western blot試驗分析InlA和InlB在產單核細胞李氏桿菌表面的錨定情況,灰度分析結果顯示,與親本株相比,在缺失株ΔltaS表面,InlA和InlB錨定量極顯著降低(P<0.01)(圖3)。結果說明ltaS基因缺失后顯著減少InlA和InlB在產單核細胞李氏桿菌表面的錨定。

*.差異顯著(P<0.05);**.差異極顯著(P<0.01);ns.無顯著差異(P>0.05)。下同*.Significant difference(P<0.05);**.Extremely significant difference(P<0.01);ns.No significant difference(P>0.05).The same as below

2.4 ltaS缺失顯著降低產單核細胞李氏桿菌對細胞的黏附侵襲能力

細胞黏附試驗結果表明,缺失株ΔltaS對 DF-1細胞的黏附率極顯著低于親本株EGDe-prfA*的黏附率(P<0.01)(圖4A);細胞侵襲試驗結果表明,缺失株ΔltaS對 DF-1 細胞的侵襲率極顯著低于親本株EGDe-prfA*的侵襲率(P<0.01)(圖4B)。

細菌對DF-1細胞的黏附率(A)和侵襲率(B)Bacterial adhesion rate (A) and invasion rate (B) to DF-1 cells

2.5 ltaS缺失顯著降低產單核細胞李氏桿菌在巨噬細胞內增殖能力

試驗結果表明,小鼠巨噬細胞RAW 264.7對ΔltaS的吞噬率與親本株EGDe-prfA*無顯著性差異(P>0.05)(圖5A);產單核細胞李氏桿菌在巨噬細胞內增殖試驗結果表明,在RAW 264.7中,ΔltaS與親本菌株EGDe-prfA*的增殖倍數存在明顯差異(P<0.05)(圖5B)。這說明ltaS基因缺失顯著降低產單核細胞李氏桿菌在巨噬細胞內的增殖能力。

RAW264.7對細菌吞噬率(A)和細菌在RAW264.7細胞中增殖倍數(B)Bacterial phagocytosis rate (A) and bacterial proliferation factor in RAW264.7 cells (B)

2.6 ltaS缺失顯著減弱產單核細胞李氏桿菌對小鼠的致病性

以BALB/c小鼠為動物模型去評估產單核細胞李氏桿菌的致病性。小鼠臟器載菌量試驗結果表明,感染后48 h內缺失株ΔltaS感染的小鼠肝中的細菌載量與親本株EGDe-prfA*相比細菌載量極顯著降低(P<0.01);與親本菌株相比,在小鼠脾中的細菌載量也極顯著降低(P<0.01)(圖6A)。在存活試驗中通過改良寇氏法計算得出EGDe-prfA*與ΔltaS對BALB/c小鼠半數致死量LD50分別為1.7×104CFU 和7.49×106CFU。EGDe-prfA*感染后4 d時小鼠全部死亡,ΔltaS感染后4 d還有80%存活率(圖6B)。結果表明ltaS基因缺失能降低產單核細胞李氏桿菌致病力。

圖6 ltaS基因缺失對產單核細胞李氏桿菌感染小鼠肝和脾中細菌載量(A)以及存活率(B)的影響Fig.6 Effects of ltaS gene deletion on bacterial load in liver and spleen (A) and survival rate (B) of Listeria monocytogenes infected mice

3 討 論

產單核細胞李氏桿菌是革蘭陽性食源性致病菌,通過消化道感染人體,并且可以突破宿主三大屏障,胎盤屏障、腸道屏障以及血腦屏障,可引發孕婦流產,宿主腦膜炎、敗血癥,嚴重的會導致死亡[14]。LTA是由多個核糖醇連接而成的大分子聚合物,是革蘭陽性菌(G+)細胞壁上的一種具有高度免疫能力的特殊多聚體,它是由磷酸氫核糖醇和/或磷酸甘油酯與細胞膜的脂質共價鍵合而成,為兩性分子,一端與細胞膜上的脂質共價鍵合,而另一端則通過細胞壁向外伸展[15-17]。LTA是革蘭陽性菌細胞壁所特有的,研究表明LTA對革蘭陽性菌細胞壁的修飾很重要而細胞壁的功能修飾往往會對毒力因子錨定產生影響[18]。在產單核細胞李氏桿菌中脂磷壁酸是由脂磷壁酸合成酶ltaS和脂磷壁酸引物酶ltaP兩個基因編碼產物合成。

本研究利用同源重組技術成功構建脂磷壁酸合成酶ltaS基因缺失株,評估親本株EGDe-prfA*與缺失株ΔltaS生長能力與細菌形態,對毒力因子錨定、細胞黏附侵襲率、細胞吞噬能力和巨噬細胞內增殖能力以及對小鼠致病性等生物學特性。生長曲線試驗表明ltaS基因缺失并不影響產單核細胞李氏桿菌在BHI中的正常生長,并且光學顯微鏡下觀察細菌形態大小無差別。Western blot試驗結果表明ltaS基因缺失會極顯著降低產單核細胞李氏桿菌細胞壁表面InlA與InlB蛋白含量。InlA與InlB是在產單核細胞李氏桿菌感染過程中重要的毒力因子,有幫助其穿越宿主胃腸屏障的功能。InlA介導細菌通過E-鈣黏蛋白入侵細胞,而InlB則是一種特異性更低的入侵蛋白[19-20]。研究表明,InlB與LTA結合主要是與該蛋白質和該聚合物的聚甘油磷酸骨架的特異性相互作用[21-22],并且兩者以非共價錨定方式在細菌表面[23-24]。當ltaS基因缺失時會導致LTA骨架合成失敗,進而導致InlB在細胞表面錨定量降低。然而InlA和InlB是由同一操縱子編碼的蛋白質,InlB是InlA依賴性侵襲途徑中的促進者,InlB錨定量的降低會影響InlA對細胞侵襲量[25-27]。這也可能是InlA與InlB在缺失株ΔltaS中錨定量降低的主要原因。

體外細胞試驗結果表明,ltaS基因缺失會極顯著影響產單核細胞李氏桿菌對DF-1細胞的黏附侵襲能力,這與前面Western blot結果相符的。由于ltaS基因缺失導致胞外InlA與InlB含量減少,產單核細胞李氏桿菌黏附侵襲能力減弱。ltaS基因缺失不影響巨噬細胞RAW264.7對產單核細胞李氏桿菌的吞噬能力,但是在巨噬細胞內增殖能力極顯著減弱。體外動物致病性試驗通過小鼠臟器載菌量以及小鼠存活試驗表明,ΔltaS感染的小鼠肝與脾中的細菌載量與親本株EGDe-prfA*相比細菌載量極顯著降低。Webb等[7]提出雙酶系統進行 LTA 合成,發現產單核細胞李氏桿菌內兩個 LtaS 旁系物的不同酶促功能。在沒有LtaP的情況下,LtaS可以使用糖脂作為錨點。但是ltaS缺失影響細菌表面LTA合成,在Δlmo0927中完全不存在LTA[7]。DltABCD基因家族主要功能是對LTA進行D-丙氨?；揎?通過催化D-丙氨酸殘基與細胞壁脂磷壁酸結合。當LTA合成減弱時,Dlt家族基因無法進行修飾導致無法正常發揮功能。Abachin等[28]發現DltABCD失活會導致產單核細胞李氏桿菌在小鼠肝與脾載量降低,并且在巨噬細胞(BMM)內增殖能力減弱,推測可能是由于ltaS基因缺失影響Dlt家族基因功能導致產單核細胞李氏桿菌致病性減弱。

4 結 論

ltaS基因缺失會減少產單核細胞李氏桿菌表面毒力因子InlA和InlB的錨定量并且會減弱對DF-1細胞的黏附侵襲能力。ltaS基因缺失會減弱產單核細胞李氏桿菌在小鼠臟器載量并且降低致死率。本研究將為脂磷壁酸合成酶ltaS基因后續的機制探索奠定基礎。