羊偽結核棒狀桿菌的分離鑒定及部分生物學特性分析

宋 艷,袁永豐,錢虹宇,李鑫燦,羅洪艷,王芝英,周作勇

(西南大學動物醫學院,重慶 402460)

偽結核棒狀桿菌(Corynebacteriumpseudotuberculosis,Cp)為一種革蘭陽性的兼性細胞內寄生菌,可感染多種動物和人并引起慢性炎癥性疾病,如馬潰瘍性淋巴管炎、羊干酪樣淋巴結炎(caseous lymphadenitis,CLA)、牛乳腺炎和人壞死性淋巴結炎等[1],其中以Cp感染羊引起的CLA最為常見。Cp感染山羊可造成多個方面的危害,包括降低生產性能、引起繁殖障礙、在羊體表及內臟器官形成膿腫而影響銷售,以及Cp通過乳汁排出對食用羊奶的人群具有潛在危害等[2]。此外,因為Cp對外界環境的抵抗力強,且感染病程長,發病過程緩慢,一旦在羊場感染,則很難清除,是世界公認的難以防治的傳染病之一[1-2]。羊CLA呈全世界分布,廣泛流行,據世界動物衛生組織(OIE)統計,全球至少有64個國家確認有該病存在[3]。本病在意大利羊群中的血清陽性率為21.85%[4],巴西東北地區為30.3%[5],韓國為57.3%[6]。近年來,我國關于Cp感染山羊的報道日益增多,陜西[7]、四川[8]、重慶[9]、云南[10]、福建[11]等多個省市均有該病原感染的報道,其從膿腫樣本中的分離率為39.22%～100.00%。本文通過對所采集的山羊體表淋巴結膿腫病料進行Cp分離及病原特性研究,以明確重慶和貴州發病羊場Cp感染情況,為該病原防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及小鼠

營養瓊脂購自AOBOX公司;細菌微量生化鑒定管購自青島海博生物技術有限公司;PremixTaq購自TaKaRa公司;核酸染料購自SBS賽百盛公司;藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司;腦心浸出液(BHI)肉湯、萘啶酸、磷霉素鈉購自Solarbio公司。昆明系小鼠購自重慶萊彼特生物科技有限公司。

1.2 引物設計

參考偽結核棒狀桿菌的cp40基因序列(OL347 712.1)設計檢測引物:上游引物SF: 5′-ATGCATAATTCTCCTCHATCAGTC-3′,下游引物SR: 5′-TTATCTAGAACCAGTTGGCTTTCC-3′, 擴增片段為1 140 bp。其余基因,包括編碼延伸因子(fusA)、磷脂酶D(pld)、鐵攝取和調節相關毒力(因子FagA和FagB)、細菌σ因子(SigE)、小菌毛蛋白(SpaC)、鋅依賴的超氧化物歧化酶(SodC)、蛋白激酶G(PknG)、神經氨酸酶(NanH)和寡肽透過酶(OppB、OppD、OppF)的檢測引物均按文獻設計[9],由上海百力格生物技術服務有限公司合成。

1.3 病料采集方法

對重慶市3個羊場(江津區、涪陵區和秀山縣各1個),以及貴州省獨山縣1個羊場患膿腫的山羊采樣,首先對膿腫部位皮膚用碘伏消毒,進而以無菌手術刀片切開皮膚,擠出膿汁或干酪樣物質,收集于滅菌離心管中,低溫送至實驗室,進行病原分離培養。

1.4 細菌分離鑒定

將膿腫樣本接種在含5%兔血瓊脂平板上,37 ℃培養48 h。將疑似Cp的菌落接種在BHI液體培養基(磷霉素濃度為200 μg·mL-1,萘啶酸濃度為4 μg·mL-1)中震蕩培養24 h,再次進行三區劃線純化。將分離菌接種生化試驗管進行葡萄糖、木糖、甘露醇、麥芽糖、甲基紅、氧化酶和硝酸鹽還原的生化試驗。勾取單菌落至肉湯中培養,以該菌液作為模板,以Cp的fusA基因特異性引物進行PCR擴增鑒定是否為Cp[9]。

1.5 細菌致病性試驗

將15只昆明系小鼠隨機分成5組,每組3只,體重為24～28 g。每個區縣隨機選擇1株Cp(XS2、JJS-4、GZ-5和FL-2-5)在血平板劃線培養,挑取單菌落至1 mL BHI肉湯中培養24 h,按每只小鼠腹腔注射0.2 mL菌液(含1.25×107CFU),對照組注射等量生理鹽水,觀察小鼠發病及死亡情況。

1.6 毒力基因PCR檢測

以ATCC19410為對照,采用菌液PCR方法檢測Cp毒力基因,針對每個毒力基因的PCR反應體系:PremixTaq12.5 μL,毒力基因上、下游引物各1.0 μL,培養Cp菌液2.0 μL,ddH2O 8.5 μL,總體積25.0 μL。反應條件:94 ℃ 5 min;94 ℃ 40 s,60 ℃ 40 s,72 ℃ 40 s,共30個循環;72 ℃ 2 min。最后對PCR產物用1%的瓊脂糖電泳檢測。

1.7 藥物敏感性試驗及耐藥基因檢測

分別吸取培養至1.5×108CFU·mL-1的Cp菌液200 μL,均勻涂布于血瓊脂平板上,將藥敏紙片置于培養基的適當位置,37 ℃培養48 h,測量并記錄抑菌圈大小,參考美國臨床標準CLSI判定藥敏結果。采用NCBI′s AMRFinderPlus進行Cp全基因組的耐藥基因分析,發現在Cp菌中主要有2種耐藥基因:氨基糖苷O-磷酸轉移酶APH(3′)-IIa(aph(3′)-IIa)和廣譜A類β內酰胺酶TEM-116(blaTEM-116)。設計aph(3′)-IIa和blaTEM-116特異性引物(aph3-F: 5′-GGAAGGGACTGGCTGCTA-3′和aph3-R: 5′-GCGCGCCTTGAGCCTGGC-3′,預計擴增片段270 bp;blaTEM116-F:5′-ATCGGAGG-ACCGAAGGAG-3′和blaTEM116-R:5′-TTTATCAGC-AATAAACCA-3′; 預計擴增片段279 bp),檢測所分離菌株中耐藥基因攜帶水平。

1.8 細菌fusA測序及序列分析

將fusA的PCR擴增產物送至擎科生物公司進行雙向測序,拼接序列后提交至GenBank。分析所獲得CpfusA序列的相似度,每個羊場選擇一株菌fusA序列,同時在NCBI上選取國內外源自山羊、綿羊、馬、水牛等宿主且已經有明確生物型信息的CpfusA序列,羊生物型(biotypeovis)包括CP001809、NC_017301、CP01079、NC_017301、NZ_CP012695、NZ_CP015100和NZ_MDWN01000001,馬生物型(biotypeequi)包括CP003082、CP012022、NC_017307、NC_017730和NC_017945,以及潰瘍棒狀桿菌(C.ulcerans)、白喉棒狀桿菌(C.diphtheriae)的fusA序列,用DNAstar Lasergene 7.1.0 進行相似度分析,以結核分支桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)的fusA序列為外群,用Clustal X 1.83程序進行序列對位排序,利用MEGA 4.0構建系統進化樹。

2 結 果

2.1 Cp分離鑒定

從重慶市江津區、涪陵區和秀山縣,以及貴州省獨山縣發病山羊中共采集40份膿腫樣本,獲得23分離菌(重慶江津、涪陵、秀山和貴州獨山縣所各分離獲得11、1、10和1株菌),分離率為57.5%。分離菌在血瓊脂培養基上培養后出現1 mm大小,白色、不透明、干燥的菌落,接種環易將其在平板上推動,大部分菌株在血瓊脂培養基出現β型溶血環。革蘭染色鏡檢可見呈藍紫色、球桿狀細菌。選擇部分菌株進行生化試驗,結果顯示葡萄糖、麥芽糖和甲基紅試驗結果為陽性,而木糖、甘露醇、氧化酶和硝酸鹽還原試驗結果為陰性,其結果符合《伯杰氏細菌鑒定手冊》中Cp的生化特征。經Cp的fusA特異性引物PCR檢測,所有分離菌均檢測到fusA基因(圖1)。綜上,23株分離菌經鑒定為Cp。

M. 2000bp DNA相對分子質量標準;1. ATCC19410;2. FL-2-5; 3. GZ-5; 4～13. XS1、2、3、5、6、8、9、10、11、14;14～24. JJS-2、3、4、5、6、7、8、9、14、15、16;黑色箭頭指fusA基因M. 2000 bp DNA marker;1. ATCC19410;2. FL-2-5; 3. GZ-5; 4-13. XS1, 2, 3, 5, 6, 8, 9, 10, 11, 14;14-24. JJS-2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 14, 15, 16; The black arrow refers to the fusA gene

2.2 毒力基因PCR檢測

對23株Cp菌株毒力基因PCR檢測顯示,所分離的Cp中均攜帶pld、FagA、FagB、SigE、SpaC、SodC、PknG、NanH、OppB、OppD、OppF和cp40基因。

2.3 對小鼠的致病性分析

致病性分析顯示,不同地區的偽結核棒狀桿菌分離株對小白鼠致病情況不一致,其攻毒后死亡時間為 40～138 h,其中秀山分離株(XS-2)致病力最強,在48 h內全部死亡,其次為江津分離株(JJS-4)和貴州分離株(GZ-5),所有小鼠均在64 h內死亡,最后為涪陵分離株(FL-2-5),攻毒小鼠在138 h內死亡。攻毒后小鼠表現為精神不振、被毛粗亂、扎堆、飲欲食欲減退和活動減少等。剖檢發現,死亡時間在 48 h 內通常表現為臟器的出血腫脹,而死亡時間超過 48 h 的小鼠通?？梢娕K器多有膿腫(圖2)。

A. Cp感染40 h死亡小鼠的肺有出血(黃色箭頭);B. Cp感染138 h死亡小鼠腸壁上有膿腫(紅色箭頭)A. Lung bleeding of mice died 40 h after Cp infection (yellow arrow); B. Abscesses on the intestinal wall of mice died 138 h after Cp infection (red arrow)

2.4 藥敏試驗及耐藥基因檢測

藥敏試驗顯示,不同地區分離的Cp其敏感性藥物不完全一致。整體上,所分離Cp對頭孢拉定、丁胺卡那和多西環素敏感率最高,達95.65%(22/23),其次為青霉素、氨芐西林、四環素、萬古霉素和環丙沙星,敏感率為91.30%(21/23),但對呋喃唑酮100%耐藥,對新霉素和卡那霉素耐藥率為82.61%(19/23),對慶大霉素的耐藥率為69.57%(表1)。耐藥基因檢測發現,所分離Cp菌株中aph(3′)-IIa和blaTEM-116攜帶率分別為0和4.35%(1/23)。對應藥敏試驗結果,發現檢出blaTEM-116的Cp對β內酰胺類抗生素青霉素和氨芐西林具有耐藥性。

表1 Cp的藥敏試驗結果

2.5 Cp測序及序列分析

將23株Cp的fusA基因PCR擴增產物進行測序并提交GenBank,獲得登錄號:ON969140～ON969162。相似度分析顯示,除JJS-8 (ON969141)與其他Cp的相似度為99.9%,所獲得Cp的fusA序列間相似度為100%。因此每個場選擇1株Cp的fusA序列進一步分析,發現本次獲得Cp與羊生物型Cp(biotypeovis)的fusA序列相似度為99.8%～99.9%,與馬生物型Cp(biotypeequi)相似度為98.9%～99.2%,與潰瘍棒狀桿菌(C.ulcerans)相似度為94.0～94.3%,與白喉棒狀桿菌(C.diphtheriae)相似度為91.5%～91.7%。多序列比對顯示,羊生物型和馬生物型Cp的fusA差異位點主要在924 bp(羊A/馬C)、927 bp(羊C/馬T)、972 bp(羊G/馬A)、1 113 bp(羊C/馬G)、1 149 bp(羊C/馬T)、1230 bp(羊T/馬G),而與其他羊生物型Cp相比,本次分離Cp的fusA基因序列差異點主要位于第1 389 bp處,所獲得的序列該位點堿基為T,而其余Cp在該位點為C。氨基酸編碼分析顯示,僅在第371位氨基酸有差異,羊生物型為天冬氨酸(D),而馬生物型為谷氨酸(E)?；趂usA的系統進化分析顯示,除去外群,棒狀桿菌共分為四個分支,分別為Cp羊生物型(biotypeovis)、Cp馬生物型(biotypeequi)、潰瘍棒狀桿菌(C.ulcerans)和白喉棒狀桿菌(C.diphtheriae),本研究所分離Cp聚類到Cp羊生物型(biotypeovis),提示所分離獲得的Cp生物型為羊型(圖3)。

枝上數字為Bootstrap 1 000次重復抽樣百分比,三角形表示本研究獲得的Cp fusA基因序列The numbers on the branches representing the bootstrap values of 1 000 samples, and the triangle representing the fusA gene sequences of Cp obtained in this study

3 討 論

Cp是引起綿羊、山羊等反芻動物膿腫病的主要病原之一,在眾多診斷該病原感染的方法中,從膿腫樣本中分離出偽結核棒狀桿菌是最直接和最可靠的方法。本研究采用分離菌的菌落特征、染色特點并結合其延伸因子編碼基因fusA的特異性引物進行PCR鑒定。發現所采集的山羊體表膿腫樣本中Cp的分離率為57.5%(23/40),高于我國西南地區(39.22%,40/102)[9],以及墨西哥(35.63%,57/160)[12]、印度拉吉斯坦(51.9%,14/27)[13]報道的該病原分離率,而低于四川(65%,13/20)[8]、陜西(100%,9/9)[7]、埃及(90.07%,254/282)[14]報道的Cp分離率。致病力檢測表明,所分離的Cp具有較強的致病力。以上結果表明,Cp仍然是重慶和貴州部分羊場引發山羊體表膿腫的重要病原,急需引起當地養殖戶和相關部門的重視。

本研究發現91.30%以上的Cp對頭孢拉定、青霉素和環丙沙星等多種抗生素敏感,但有82.61%的Cp對卡那霉素和新霉素耐藥,69.57%的菌株對慶大霉素有耐藥性。關于Cp藥物敏結果的報道差異較大,如魏宇辰等[7]報道Cp對慶大霉素、環丙沙星敏感率達100%,但對青霉素耐藥或中度敏感。徐志豪等[8]報道,Cp對慶大霉素和青霉素的耐藥率分別達90.00%和95.00%,說明不同地區分離的Cp藥物敏感性差異較大。本次分離的Cp對卡那霉素和慶大霉素的耐藥率,遠高于本實驗室前期研究結果(10.53%的Cp對卡那霉素耐藥,7.89%的Cp對慶大霉素耐藥),提示即使在相近地區,不同養殖場中分離的Cp對抗生素的敏感性也有較大差異,這可能與不同羊場用藥習慣有關。此外,本研究發現所有的Cp分離株對呋喃唑酮完全耐藥,這與Li等[9]報道類似,深入發掘研究該病原對呋喃唑酮耐藥的基因將有利于該病原的防治。關于Cp耐藥基因相關研究極少,TEM是超廣譜β內酰胺酶(ESBLs)主要的耐藥基因型[15],其中TEM-116由Jeong等[16]首次在大腸桿菌和肺炎克雷伯菌臨床分離株中檢測到,本文在國內首次從Cp臨床分離株中檢測出blaTEM-116,且該菌對β內酰胺類抗生素青霉素和氨芐西林具有耐藥性,提示該基因的存在可能與Cp菌株對β內酰胺類抗生素耐藥有關。IIa型氨基糖苷類3′-O-磷酸轉移酶(APH(3′)-IIa)是一種常見的細菌抗氨基糖苷類抗生素的酶[17],主要存在于革蘭陽性菌中,雖然本研究發現Cp對氨基糖苷類的卡那霉素和慶大霉素耐藥率較高,但并未檢測出aph(3′)-IIa耐藥基因,其原因是否與Cp中可能存在其他類別的氨基糖苷類耐藥基因有待進一步研究。

毒力基因的PCR檢測結果表明,所有分離菌株中均攜帶有pld、FagA、FagB、OppB、OppD、OppF、SodC、SpaC、pknG、NanH、sigE、cp40這些毒力或假定毒力基因,與Li等[9]的研究結果相似。而Guerrero等[12]報道在98.2%的菌株中檢測到FagB基因,Aquino等[18]研究顯示FagC的檢出率為99.40%,FagD的檢出率為95.23%,表明不同地區的Cp分離菌株毒力基因攜帶情況不完全一致。此外,本研究表明,即使是具有相似的毒力基因譜,其致病力也不完全相同,其原因是否與這些菌株攜帶了其他不同的毒力基因,或同種毒力基因的表達水平不同有關尚待進一步研究。

根據硝酸鹽還原酶試驗結果將Cp分為兩個生物型,其中分離自馬和牛的Cp通常為馬生物型(biotypeequi,硝酸鹽還原陽性),而分離自綿羊和山羊的Cp為羊生物型(biotypeovis,硝酸鹽還原陰性)[19],本研究生化試驗顯示所檢測菌株硝酸鹽還原試驗為陰性,說明分離菌為羊生物型。研究發現延長因子P(elongation factor P)編碼基因(fusA)表達穩定,可作為定量分析Cp基因表達的內參[20]。此外,基于Cp管家基因fusA單獨或聯合其他管家基因dnaK、infB、groeL1和leuA的進化分析,有助于了解Cp的分子特征[9,21]。Li等[9]構建了基于fusA和16S rRNA的Cp系統進化樹,發現利用fusA而不是16S rRNA,可以有效將Cp羊生物型和馬生物型區分開,本文與Li等的研究結果一致,結合所分離的Cp硝酸鹽還原試驗陰性的結果,說明所分離的Cp均為羊生物型(biotypeovis)菌株。此外,本文進一步比對了羊生物型和馬生物型fusA基因序列及編碼氨基酸的差異,發現其堿基差異位點主要在第924、927、972、1 113、1 149和1 230 bp處,而氨基酸序列僅在第371位點有差異,提示雖然羊生物型和馬生物型Cp的核苷酸差異位點較多,但對其編碼蛋白功能可能影響不大,這些不同位點堿基改變與Cp出現羊生物型和馬生物型分化的關系及具體機制還有待進一步研究。綜上,本研究明確了引起重慶和貴州部分羊場發生體表淋巴結膿腫的Cp病原特點,為防控該病提供了參考資料。

4 結 論

偽結核棒狀桿菌是引起重慶和貴州部分羊場發生體表淋巴結膿腫的主要病原,本研究明確其部分生物學特性,為防控該病原提供了參考資料。