原核表達的褐黃血蜱唾液腺蛋白和鐵蛋白1的免疫保護效果評價

陳 玲,陳 浩,岳嬋娟,馬 銳,范雪陽,劉頌蕊*,楊光友*

(1.成都大熊貓繁育研究基地,四川省瀕危野生動物保護生物學重點實驗室,成都 610081;2.四川農業大學動物醫學院,成都 611130)

蜱是一種常見的動物體表寄生蟲,也是多種動物疾病的傳播媒介,據估計在全球范圍內,蜱和蜱傳疾病每年會造成220億～300億美元的損失[1]。褐黃血蜱(Haemaphysalisflava)屬于硬蜱科血蜱屬,可寄生在犬、貓、山羊、刺猬、野豬以及鳥類體表[2-5],同時它也是危害野生大熊貓的優勢蜱種[6]。該蜱在我國廣泛分布于河南、湖南、湖北、四川、江蘇等地區[7-8]。據報道褐黃血蜱能夠攜帶立克次體(Rickettsiarickettsii)[9]、貝氏柯克斯體(Coxiellaburnetii)[10]、埃氏疏螺旋體(Borreliaafzelii)[5]和無形體(Anaplasma)[11]等諸多病原體,引起宿主或人類感染多種疾病,對動物和人類健康造成極大威脅?；瘜W防控是控制蜱和蜱傳疾病有效方法,但大量使用化學藥物可導致耐藥蜱的產生以及環境的污染問題,相比之下抗蜱疫苗更加環保并且有效減少蜱的數量,是替代化學殺蟲劑控制蜱感染和病原傳播的有效方法[12],研究顯示H.flava熱休克蛋白70-b2具有良好的免疫原性,可誘發體液免疫[13]。

鐵蛋白1(ferritin 1,Fer1)是調節蜱體內鐵的儲存和釋放來維持鐵代謝平衡的關鍵蛋白[14]。AV422蛋白是一種保守蜱唾液腺蛋白,其能在蜱的吸血過程中起到抑制血液凝固的作用[15]。本研究通過從褐黃血蜱轉錄組數據中(GSE67247 和GSE69721)篩選出唾液腺蛋白(HfAV422)和鐵蛋白1(HfFer1)兩個基因進行原核表達,通過動物試驗來評價重組蛋白的抗蜱效果,為褐黃血蜱的防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 蟲株和實驗動物

褐黃血蜱采自于四川省放牧的山羊體表,經分子鑒定為褐黃血蜱[6],并在四川農業大學動物寄生蟲病研究中心通過新西蘭兔進行傳代繁殖與保種。飽血雌蜱置于裝有濕潤棉花的培養皿中,在溫度為26 ℃±1 ℃,相對濕度為80%±10%的條件下孵育、產卵。卵在21 d左右孵化成幼蜱,經14～21 d靜止期后進行試驗。

22只新西蘭兔(平均體重3 kg±0.2 kg),購自成都達碩實驗動物有限公司。在試驗期間,每只兔獨籠飼養,給予充足的水和食物。

1.2 主要試劑與儀器

RNA提取試劑盒(TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit)購自北京天根生化科技有限公司;反轉錄試劑盒(Prime ScriptTMRT reagent Kitwith gDNA Eraser)購自成都福際生物技術有限公司;T4連接酶、QuickCutTM限制性內切酶SacⅠ/XhoⅠ/BamHⅠ/HindⅢ購自大連寶生物有限公司;HRP-標記山羊抗兔IgG購自武漢博士德生物工程有限公司;Rabbit IL-2、IL-4和IFN-γ ELISA Kit 試劑盒購自江蘇酶免實業有限公司。

PCR儀、凝膠成像分析系統、蛋白質電泳儀購自美國Bio-Rad公司;中高壓蛋白純化系統購自美國Cytiva公司;控溫搖床(HZQ-100)購自哈爾濱東聯電子技術開發有限公司。

1.3 褐黃血蜱總RNA的提取和cDNA合成

將褐黃血蜱饑餓幼蜱按照提取總RNA提取試劑盒說明書進行RNA的提取。以抽提的褐黃血蜱總RNA為模板,使用反轉錄試劑盒進行cDNA合成,將所得產物保存于-80 ℃。

1.4 生物信息學分析及目的基因擴增

從褐黃血蜱轉錄組數據獲取褐黃血蜱HfFer1和HfAV422的CDs序列,利用生物信息學分析軟件分別對這兩個基因進行生物信息學分析。切除信號肽和跨膜區后然后利用Primer 6.0軟件進行引物設計(表1),斜體為保護性堿基。

表1 HfFer1和HfAV422的序列設計

1.5 HfFer1和HfAV422基因的原核表達、蛋白純化及免疫印跡分析

將陽性菌液進行擴大培養和提取質粒,質粒用相對應的快切酶進行酶切然后進行T4連接測序。將測序正確的質粒轉入BL21感受態細胞中,挑取單個菌落接種于1 L含氨芐抗性的培養液中,37 ℃搖床培養至菌液OD590 nm為0.6后加入誘導劑IPTG(1 mmol·L-1),37 ℃誘導12 h(160 r·min-1),隨后進行可溶性分析,取收集的上清和沉淀制樣進行SDS-PAGE電泳,分析兩種蛋白可溶性表達情況。用鎳離子親和層析方法對重組蛋白進行純化。將純化后的蛋白進行免疫印跡分析,以1∶100稀釋的褐黃血蜱陽性兔血清作為一抗,以1∶2 000稀釋的HRP標記的山羊抗兔IgG作為二抗。

1.6 重組蛋白免疫保護性試驗

1.6.1 試驗分組及免疫程序 將新西蘭兔隨機分組,皂素對照組6只,蛋白組每組各8只。頸部皮下注射,相同劑量免疫兩次,間隔14 d(表2)。

表2 實驗動物分組和免疫程序

1.6.2 褐黃血蜱幼蜱的感染 在第二次免疫后一周,將褐黃血蜱幼蜱感染于兔耳部。每只兔感染100只幼蜱,為了方便收集飽血幼蜱,每只耳朵固定耳袋,并套上伊麗莎白圈。攻蟲24 h后觀察幼蜱感染情況并且計數,之后每天觀察并收集飽血幼蜱,并將飽血蜱放入濕潤的培養皿中并在溫度為26 ℃±1 ℃的條件下進行蛻皮。對飽血幼蜱進行計數、稱重以及觀察其蛻皮情況。

幼蜱的免疫效果是基于Aguirre等[16]描述的方法進行計算:抗幼蜱免疫效果=[1-Ra×Rb]%,Ra代表免疫組平均飽血蜱數量與對照組平均飽血蜱數量的比值,Rb代表免疫組蛻皮率與皂素對照組蛻皮率的比值。

1.6.3 抗體水平檢測 在首免前、免疫后每周固定時間以及攻蟲后一周采集兔血并分離血清,使用間接ELISA方法檢測IgG抗體水平(蛋白稀釋比1∶100,二抗稀釋比 1∶3 000)。

1.6.4 細胞因子檢測 按照試劑盒說明書對二免后兔血清進行細胞因子(IL-2、IL-4和IFN-γ)測定。

1.7 數據處理

2 結 果

2.1 PCR擴增

以褐黃血蜱cDNA為模板擴增出HfFer1(GenBank No.:OP820815)、HfAV422(GenBank No.:OP820814),擴增片段大小分別為525和636 bp(圖1)。

A. 基因HfFer1擴增結果;B. 基因HfAV422擴增結果;M. DNA相對分子質量標準A. HfFer1 amplication; B. HfAV422 amplication; M. DNA marker

2.2 HfFer1和HfAV422的生物信息學分析

克隆得到的HfFer1和HfAV422序列翻譯成氨基酸序列與褐黃血蜱湖南株的氨基酸序列比對存在一定差異,相似度分別為99.43%和96.68%(圖2)。其中HfAV422與美洲花蜱、變異花蜱氨基酸序列相似度較高,均在90%以上;與篦子硬蜱氨基酸序列的相似度較低,為85.99%(圖2A)。HfFer1與長角血蜱、美洲花蜱氨基酸序列的相似度較高,分別為96.55%和94.15%;而與篦子硬蜱氨基酸序列的相似度較低,為86.47%(圖2B)。

H. flava. 褐黃血蜱;A. americanum. 美洲花蜱;A. variegatum. 變異花蜱;I. ricinus. 篦子硬蜱;H. longicornis.長角血蜱;紅色長條塊. α螺旋;綠色箭頭. β折疊;紅色虛線方框. B抗原表位H. flava. Haemaphysalis flava; A. americanum. Amblyomma americanum; A. variegatum. Amblyomma variegatum; I. ricinus. Ixodes ricinus; H. longicornis. Haemaphysalis longicornis; Red rectangle. Alpha helix; Green arrows. Beta fold; Red dashed box. B antigen epitopes

2.3 原核表達、蛋白純化及免疫印跡

測序成功后的菌液擴培提取質粒,然后進行雙酶切得到的pMD19-T載體骨架和525 bp的Fer1基因片段、636 bp的AV422基因的目的片段與預期大小相符(圖3)。

A. HfFer1質粒雙酶切;B. HfAV422質粒雙酶切;M. DNA相對分子質量標準Marker ⅢA. Enzyme digestion of HfFer1 plasmid; B. Enzyme digestion of HfAV422 plasmid; M. DNA Marker Ⅲ

rHfFer1重組蛋白在25 ℃、1 mmol·L-1濃度的IPTG的條件下誘導12 h時能夠大量表達,并且表現為可溶性表達;rHfAV422重組蛋白在37 ℃、1 mmol·L-1濃度的IPTG的條件下誘導24 h后能夠大量表達,其重組蛋白主要表達在包涵體中(圖4)。重組蛋白通過鎳離子親和層析柱純化后,經凝膠電泳分離,結果顯示純化后的蛋白均為單一條帶(圖5)。免疫印跡分析rHfFer1、rHfAV422均能識別陽性血清,具有良好的免疫反應性(圖6)。

M. 蛋白質相對分子質量標準(ku);1. 重組菌誘導表達后菌體裂解物上清;2～4. 菌體裂解物先后溶解于2、4、8 mol·L-1尿素M. Protein molecular weight markers (in ku); 1. Soluble protein; 2-4. Inclusion body in 2, 4, 8 mol·L-1 urea

2.4 rHfAV422和rHfFer1的免疫保護效果

2.4.1 血清中特異性IgG抗體水平的變化 兩個免疫組分別免疫接種rHfFer1和rHfAV422后,每周在固定時間進行采血和收集血清。動物試驗結束后對血清中的特異性IgG抗體水平進行檢測。皂素對照組在免疫前后血清中平均IgG抗體水平一直維持在較低水平。而免疫組在免疫后血清中的平均IgG抗體水平明顯升高,其平均水平顯著高于皂素對照組的特異性IgG抗體水平(P<0.05),并且在攻蟲后一周的抗體同樣保持較高水平(圖7)。

immunization分別代表第一次和第二次免疫蛋白時間;Infestation.感染幼蜱的時間。不同字母標注的數據間存在顯著性差異(P<0.05),相同字母標注的數據間不存在顯著性差異(P>0.05)Immunization: Time of the first and second immunization with vaccine; Infestation. Time of challenge with larvae. There is a statistically significant difference between data labeled with different letters (P<0.05) and there is no statistically significant difference between data labeled with the same letters (P>0.05)

2.4.2 細胞因子水平分析 rHfFer1免疫組IL-2水平顯著高于皂素對照組,而IL-4和IFN-γ無明顯變化;rHfAV422免疫組IL-2和IL-4水平與皂素對照組存在顯著性差異,IFN-γ無明顯差異(圖8)。

不同字母標注的數據間存在顯著差異(P<0.05),相同字母標注的數據間不存在顯著差異(P>0.05)There is a statistically significant difference between data labeled with different letters (P<0.05) and there is no statistically significant difference between data labeled with the same letters (P>0.05)

2.4.3 抗蜱效果分析 從試驗結果來看rHfFer1免疫組的幼蜱飽血率和蛻皮率(41.13%和54.98%)均明顯低于皂素對照組(84.25%和80.25%)(P<0.05);rHfAV422免疫組的幼蜱飽血率和蛻皮率(64.78%和63.29%)與皂素對照組的飽血率和蛻皮率同樣存在顯著性差異(P<0.05)。而兩個免疫組與皂素對照組的幼蜱飽血體重均無明顯差異(表3)。rHfAV422和rHfFer1蛋白的抗蜱效力分別50.00%和68.06%。

表3 免疫 rHfAV422和rHfFer1蛋白對幼蜱攝食和蛻皮參數的影響

3 討 論

使用抗蜱疫苗誘導宿主產生針對蜱蟲和蜱媒病原體感染的免疫保護是一種經濟有效的替代方法,它可減少化學殺蟲劑的使用和耐藥蜱的產生[17-19]?？跪缫呙绲脑O計目的不是預防蜱的感染,而是通過蜱攝取宿主體內的抗體與蜱體內靶蛋白相互作用后破壞靶蛋白的功能,從而影響蜱的攝食、蛻皮和繁殖來控制蜱的數量[20-21]。早在1995年,Willadsen等[22]報道從微小扇頭蜱(Rhipicephalusmicroplus)中腸提取出的保護性抗原Bm86免疫牛后能夠明顯降低牛體表蜱蟲的感染數量,此后基于此抗原開發出GARDTM和GavacTM兩款商品化蜱疫苗,在大規模田間試驗中,基于Bm86抗原的疫苗能夠有效降低牛感染微小扇頭蜱(包括耐藥蜱株)的概率,而且還能夠控制血液寄生蟲的感染[23]。不過Bm86疫苗僅對微小扇頭蜱和扇頭蜱屬的蜱具有良好的抗蜱效果,對其他蜱種的防治效果有限。此后,有多種抗原(如絲氨酸蛋白酶抑制劑、谷胱甘肽S-轉移酶、金屬蛋白酶、4D8等)被證明可用作抗蜱疫苗候選抗原[24]。然而篩選高效且具有交叉保護作用的抗原仍為今后抗蜱疫苗研發的主要方向。蜱作為一種專性吸血的體表寄生蟲進化出一套特殊的生存機制,包括能夠長時間附著于宿主體表吸血,防止體內血液凝固以及長期儲存中腸內血餐等[25]。血餐是蜱的唯一營養來源,蜱的每一次蛻皮以及雌蜱完成產卵都需要吸食足夠的血液方可完成,而參與蜱吸血相關生理過程的基因成為抗蜱疫苗候選抗原的重要來源。

有研究報道,長角血蜱(Haemaphysalislongicornis)甘肅株P27/30基因的核苷酸序列和氨基酸序列與長角血蜱日本Okayama株、長角血蜱四川孤雌生殖株均存在差異,推測蜱株的地域性分布差異可能導致蟲株之間的氨基酸序列存在一定的差異[26]。在本試驗中擴增的褐黃血蜱HfFer1和HfAV422基因編碼的氨基酸序列與褐黃血蜱湖南株的相似度分別為99.43%和96.68%,這表明褐黃血蜱四川株與湖南株也存在一定的差異。

鐵蛋白(ferritin)廣泛存在于動物、植物和微生物中,負責鐵存儲和運輸鐵元素,在維持生物體的中維持鐵的動態平衡起著關鍵作用[27]。該蛋白主要由24個亞基組成,折疊成4個螺旋束后形成1個近乎球形外殼,并且有1個可以容納多達4 000個鐵原子的巨大空腔[28]。Fer1是一種關鍵細胞保護蛋白,其主要負責維持鐵代謝穩態和保護機體免受氧化損傷[27]。在蜱中Fer1通過將進入細胞質的Fe2+轉化成Fe3+后儲存在細胞內以減少Fe2+的氧化毒性,當機體需鐵時再將Fer1中儲存的鐵釋放出來[29]。在有關沉默蜱體內Fer1基因的研究中,發現Fer1基因的沉默能夠降低蜱的攝食、產卵及卵孵化能力,甚至導致飽血蜱死亡[30-32]。同樣,有學者對兔免疫長角血蜱(H.longicornis)重組蛋白rHlFer1后,觀察到飽血雌蜱產卵重量明顯降低(降低16%),并且在卵孵化期間部分幼蟲出現死亡[33]。這說明Fer1在蜱的吸血過程和繁殖中起關鍵作用。在本試驗中,接種rHfFer1蛋白后明顯降低了幼蜱的飽血率和蛻皮率,這可能是幼蜱從兔體內攝取的Fer1抗體與蟲體體內的Fer1發生反應,導致幼蜱因氧化應激而影響其飽血和蛻皮能力甚至引起死亡。

AV422最初在美洲花蜱體內發現,其轉錄水平在吸血后7 d的唾液腺中明顯上升,這表明其可能是一種唾液蛋白并且在吸血過程中發揮重要作用[15]。體外凝血試驗顯示,rHfAV422能夠延長凝血酶原時間(prothrombin time,PT)、活化部分凝血酶時間(activated partial thromboplastin time,APPT)和凝血酶(thrombin time,TT)時間,從而起到抗凝血作用[34]。美洲花蜱(Amblyommaamericanus)重組蛋白rAamAV422能夠延遲血漿凝固并抑制血小板聚集,并且當在沉默AamAV422 mRNA之后,該蜱飽血后的重量顯著降低(約44%)[35],這說明AV422在蜱吸血過程中可能會干預多個凝血步驟而起到抑制血液凝固的作用。在蜱體內血餐被消化之前會以液體的形式在消化道儲存,而血液的凝固可能會阻止血餐的攝取和消化,因此抗凝作用對蜱的存活至關重要[34]。有趣的是,AV422蛋白是蜱蟲體內獨有的一種蛋白,在其它節肢動物和脊柱動物體內沒有同源物,這可能意味著當該蛋白作為疫苗靶向抗原時,對脊椎動物宿主可能不會產生副作用[35]。AV422蛋白通常會在蜱吸血過程中從唾液腺分泌出進入宿主體內,從而引起宿主體液免疫反應。有研究發現篦子硬蜱(Ixodesricinus)重組蛋白rIrAV422能夠與感染過網紋革蜱(Dermacentorreticulatus)的大鼠血清和有過蜱蟲感染史的獵犬和人血清發生交叉反應,表明AV422具備交叉免疫反應性特征[35-37]。在本研究中,作者發現rHfAV422蛋白免疫實驗兔后表現出良好的抗蜱效果,與皂素對照組飽血率和蛻皮率相比較,免疫組幼蜱的飽血率和蛻皮率更低,說明AV422作為一種蜱保護性抗原,具有開發為控制不同蜱種的抗蜱疫苗的潛力。

IL-2、IL-4和IFN-γ在宿主免疫反應中發揮重要作用,其中IL-2和IFN-γ主要是由Th1細胞分泌,介導細胞免疫應答;IL-4是由Th2細胞分泌,它可促進B細胞分化和抗體的產生[38]。研究顯示,蜱唾液腺能促進IL-4上調使細胞因子向Th2型極化[39-40]。蜱在自然感染宿主過程中主要是引起Th2型免疫反應[41-43],其可能是因為蜱在叮咬宿主時從蜱唾液腺中分泌蛋白進入宿主體內引起IL-4、IL-10等相關因子的上調,誘導宿主Th2型免疫反應。在璃眼蜱(Hyalomma)rHaa86對雜交牛的免疫應答中發現rHaa86體外刺激免疫后不同時間段的外周血液淋巴細胞,IFN-γ表達水平均無明顯變化,這可能是因為該重組蛋白引起了宿主Th2型免疫反應[44]。不過有研究顯示向兔注射重組IL-2后表現出更強的抗蜱能力,能夠有效降低篦子硬蜱(Ixodesricinus)成蜱的飽血能力以及產卵重量,因此細胞免疫在蜱的免疫應答中同樣扮演重要角色[45]。本次試驗結果顯示,兩個免疫組的產生的IFN-γ水平與皂素對照組無明顯差異,但IL-2濃度水平與皂素對照組存在顯著差異,rHfAV422免疫組的IL-4濃度水平與皂素對照組同樣存在顯著性差異,這表明rHfFer1能夠引起Th1型免疫反應,而rHfAV422能夠同時引起Th1型和Th2型免疫反應。

4 結 論

本研究通過原核表達獲得了rHfFer1和rHfAV422,rHfFer1和rHfAV422兩個蛋白分別按500 μg劑量對兔進行兩次免疫后產生的抗蜱效率分別為68.06%和50.00%,rHfFer1可引起Th1型免疫反應,而rHfAV422能夠同時引起Th1型和Th2型免疫反應。本研究結果表明這兩個抗原具有成為抗蜱疫苗候選抗原的潛力。