利用1型糖尿病小鼠模型分析犬成纖維生長因子21的長效降糖效果

郭云鵬,牛 頓,李 爽,姜興昊,張立夏,任桂萍,尹杰超

(東北農業大學生命科學學院,哈爾濱 150030)

犬糖尿病(canine diabetes mellitus,CDM)是一種較為常見的內分泌性代謝病,其主要臨床表現包括:多飲、多尿、多食和消瘦[1],據統計犬糖尿病的發病率達到了0.3%～0.6%,且呈逐年上漲的趨勢[2]。其主要病因是由胰島素絕對或相對不足而引起的糖代謝障礙,從而繼發脂肪、蛋白質、維生素、水及電解質的代謝紊亂[3-4]。

CDM是一個復雜的多因素疾病,根據臨床上犬對胰島素治療的表現,可以分為胰島素依賴型糖尿病(insulin-dependent diabetes mellitus, IDD)和胰島素非依賴型糖尿病(insulin resistance diabetes,IRD)[5-6]。

IDD多發于5～12歲的中老年犬,類似于人類的1型糖尿病(T1DM),二者的病理過程均為胰島細胞的進行性破壞造成胰島素分泌減弱至完全喪失,但二者的致病機制卻存在一定的差異。犬IDD表現為原因不明的特發性胰島β細胞損害,且該過程很少發生在幼犬及青年犬中[1]。同時無論是何種原因(生長/類固醇激素拮抗、妊娠、肥胖、藥物、炎癥以及細胞信號傳導障礙)所引起的IRD,因為長期高血糖造成了胰島β細胞的耗竭,原發性的IRD最終轉歸為繼發性IDD[7]。由此可見,治療CDM的關鍵是長期維持安全的血糖水平及胰島β細胞的數量與活性。

成纖維細胞生長因子-21(fibroblast growth factor 21,FGF-21)是一種肽類激素,主要在肝、胰腺和脂肪等組織中表達,可調節機體的能量平衡、減輕體重和改善血糖[8-9]。許多研究表明,FGF-21改善肥胖與2型糖尿病(T2DM)的血糖及代謝狀態同時對其并發癥也有顯著的預防與治療作用[10]。據報道,FGF-21通過加速糖酵解,改善葡萄糖攝取和抑制糖異生從而降低T1DM患者的血糖,同時恢復棕色脂肪的功能,而且還能抑制1型糖尿病患者的并發癥[11]。此外,Xu等[12]研究發現犬源化FGF-21(cFGF-21)可通過調節stat3信號通路改善與抑制肝糖異生相關的高血糖的機制,另外通過激活細胞外信號調節激酶 (ERK)1/2和Akt信號通路保護β細胞免于凋亡。因此,FGF-21是一種非常具有應用前景的犬糖尿病治療候選藥物。

在嚙齒類動物和靈長類動物中,FGF-21的體內半衰期非常短約為1 h,并且易在體外和體內發生蛋白水解降解[13]。小分子量的FGF-21蛋白(約22 ku)容易通過腎小球過濾而消除[14-15]。因此,增加FGF-21半衰期和穩定性是其臨床應用的瓶頸問題。

細胞穿膜肽 (cell penetrating peptide,CPPs) 是一類具有穿過質膜能力的短肽(5～30 aa),被用于以“蛋白質轉導”的方式有效地幫助“分子貨物”在活細胞中內化,已經成為最有前途的蛋白質遞送載體[15]。細胞穿膜肽可根據理化性質分為三類:陽離子肽、兩親性肽和疏水性肽[16]。精氨酸的胍基在富含精氨酸的CPP的細胞穿透活性中起著重要作用,并且精氨酸的同型寡聚體(7～12個精氨酸)比天然富含精氨酸的CPP(如TAT 48-60)明顯更有效[17]。據報道,Fc融合蛋白藥物是將蛋白藥物與免疫球蛋白G(IgG)的可結晶片段(Fc)域相結合從而改善蛋白藥物的血清半衰期[18]。本研究分別將犬源IgG的Fc、11個精氨酸組成的穿膜肽R11(RRRRRRRRRRR)和HIV的反式激活調控蛋白(transactivating regulatory protein,TAT)穿膜肽TAT 47-57(YGRKKRRQRRR)與cFGF-21連接,構建融合蛋白Fc-cFGF-21、R11-cFGF-21和TAT-cFGF-21。通過T1DM小鼠模型,來比較這三種重組蛋白藥物治療T1DM的藥效差異,為研發治療犬糖尿病長效性降糖藥物提供重要的前期試驗數據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 基因和細胞 基因R11-cFGF-21、Fc-cFGF-21、TAT-cFGF-21由上海生工公司合成;pSUMO-cFGF-21質粒和HepG2細胞由東北農業大學生物制藥教研室提供。

1.1.2 實驗動物 6周齡健康的C57BL/6雄性小鼠(n=70),購自遼寧長生生物技術股份有限公司(合格證號:No.210726220100493528)。所有動物都飼養在22～25 ℃的可控溫度和55%～65%的相對濕度下,每12 h進行光照/黑暗循環,自由進食和飲水。

1.1.3 主要試劑 T4 DNA連接酶購自New England BioLabs公司;標準分子量蛋白Marker購自Fermentas 公司限制性內切酶購自TaKaRa 公司;IL-1β ELISA試劑盒購自Andygee公司;IL-10 ELISA 試劑盒購自Andygee公司;IL-17A ELISA試劑盒購自Andygee公司;胰島素ELISA試劑盒購自Andygee公司;SOD試劑盒購自南京建成生物工程研究所;ROS試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 cFGF-21的制備及體外活性檢驗 將R11-cFGF-21、Fc-cFGF-21和TAT-cFGF-21基因分別與pSUMO載體進行連接獲得重組質粒,然后重組質粒分別轉化到Rosetta受體細胞中。選擇鑒定正確的質粒接種于含氨芐青霉素(100 μg·mL-1)的液體培養基中,37 ℃,100 r·min-1,培養6 h。以1∶100比例接種于8 L的發酵罐中,當菌液OD600 nm升至7～8時,加入誘導劑IPTG(終濃度0.25 mmol·L-1),6 h后收集菌體。而后利用AKTA purifier 100系統對表達產物進行第一次親和層析,將SUMO蛋白酶按1∶50的比例加入蛋白中進行酶切,再通過鎳柱二次親和去除SUMO獲得純度為60%的目標蛋白。

將cFGF-21、Fc-cFGF-21、R11-cFGF-21和TAT-cFGF-21蛋白稀釋至終濃度為10、100和1 000 nmol·L-1并與饑餓12 h HepG2細胞于37 ℃共同培養24 h。用GOD-POD法檢測培養基中殘留的葡萄糖含量。培養結束后取2 μL上清液加到200 μL檢測液中,設立3個復孔檢測剩余葡萄糖量,避光處理8 min后,檢測其OD490 nm值,通過公式計算出葡萄糖的消耗率,統計學分析蛋白的降糖活性。細胞中葡萄糖的吸收率公式如下:

葡萄糖濃度(mmol·L-1)=(A樣品/A標準)×5.55;細胞葡萄糖消耗率=[(C空白葡萄糖-C給藥葡萄糖)/C空白葡萄糖]×100%。

1.2.2 動物模型與治療方案 建立T1DM模型,首先制備鏈脲佐菌素(STZ)溶液,STZ溶解在無菌檸檬酸鹽緩沖液(0.05 mol·L-1檸檬酸鈉,pH4.5)中;而后將饑餓12 h的小鼠以60 mg·kg-1的劑量進行腹腔注射,每天注射1次,3 d后測定小鼠血糖,小鼠血糖濃度>16.67 mmol·L-1則認為造模成功[19]。

分別選取T1DM模型小鼠(40只)和空白對照小鼠(6只)?？瞻讓φ战M(n=6):生理鹽水注射空白組小鼠。模型組(n=8):生理鹽水治療的T1DM模型小鼠。有研究結果表明50 nmol·kg-1FGF-21的劑量治療糖尿病小鼠是安全有效的[12]。因此,設立4個治療組(n=8):分別用上述4種重組蛋白(50 nmol·kg-1)治療的T1DM模型小鼠。本試驗分為3個階段:第一階段,每天治療一次(第1～14天);第二階段,每3 d治療一次(第15～29天);第三階段,每5 d治療一次(第30～44天)。

1.2.3 糖尿病小鼠的血糖、OGTT及HbA1c的檢測 治療過程中,每隔3 d對空腹過夜的小鼠進行尾部采血檢測血糖。保證每次測量的小鼠都空腹12 h,為小鼠盡量建立統一的條件。在每個試驗階段結束當天檢測小鼠12 h內血糖波動水平(自由飲食),早上8:00開始第一次檢測,此后每隔4 h檢測一次小鼠血糖。試驗結束前對所有小鼠空腹12 h后進行口服葡萄糖耐量試驗(oral glucose tolerance test, OGTT)。給每只小鼠喂食新鮮葡萄糖溶液(2 g·kg-1),分別在攝入后0、30、60、90、120 min測量血糖。采集各組小鼠血清測定其HbA1c(東北農業大學校醫院測定)的含量和胰島素水平(胰島素ELISA試劑盒,北京安迪基因生物技術有限公司)。

1.2.4 氧化應激和炎癥因子檢測 在保存的胰腺組織加入放射免疫沉淀試驗(radioimmune precipitation assay,RIPA)溶液和蛋白酶抑制劑(上海碧云天生物技術有限公司),充分研磨組織,收集上清液。胰腺的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)和活性氧(reactive oxygen species,ROS)通過SOD測定試劑盒和ROS測定試劑盒。白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞介素17(IL-17A)和白細胞介素10(IL-10)采用IL-1β ELISA試劑盒、IL-17A ELISA試劑盒和IL-10 ELISA試劑盒測定。

1.2.5 實時熒光定量PCR 分別取各組小鼠肝、腎、腸和脂肪等組織,用TRIzol法提取總RNA,逆轉錄為cDNA。通過實時熒光定量PCR檢測肝中靶基因葡萄糖6磷酸酶(G6pase)、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK)、葡萄糖激酶(GK)、葡萄糖轉運蛋白1(GLUT 1)、葡萄糖轉運蛋白4(GLUT 4)的轉錄水平;腸和腎中靶基因葡萄糖鈉協同轉運蛋白1(SGLT 1)和鈉-葡萄糖協同轉運蛋白2(SGLT 2)的轉錄水平;脂肪組織中過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)的轉錄水平。引物序列見表1。

表1 Real-time PCR引物

1.2.6 肝功能及脂代謝檢測 血樣以3 000 r·min-1離心 10 min分離血清。隨后,將各組血清樣本送至東北農業大學校醫院進行天冬氨酸氨基轉移酶(AST)、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、堿性磷酸酶(ALP)、谷氨酰轉肽酶(GGT)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)的檢測。

1.2.7 HE染色 將小鼠的胰腺組織在4%多聚甲醛中固定48 h。然后將部分組織包埋在石蠟中并用超薄半自動切片機(上海Leica Microsystems公司)切片。用蘇木精和伊紅染色后,用光學顯微鏡觀察每張載玻片并拍照。

2 結 果

2.1 重組cFGF-21蛋白制備

SDS-PAGE 分析結果表明,帶有SUMO標簽的重組蛋白SUMO-cFGF-21、SUMO-R11-cFGF-21、SUMO-TAT-cFGF-21、SUMO-Fc-cFGF-21相對分子質量分別是39、41、41和69 ku;去標簽后的cFGF-21、R11-cFGF-21、TAT-cFGF-21、Fc-cFGF-21蛋白相對分子質量分別為21、23、23和50 ku(圖1a～h)。體外細胞葡萄糖吸收的結果表明,與對照組相比,3個濃度的cFGF-21、Fc-cFGF-21、R11-cFGF-21和TAT-cFGF-21以劑量依賴性方式顯著增加HepG2細胞中的葡萄糖攝取(P<0.01)(圖1i)。但是,在相同濃度下,cFGF-21、Fc-cFGF-21、R11-cFGF-21和TAT-cFGF-21在促進葡萄糖攝取方面無顯著差異。

a～d. SUMO-cFGF-21、SUMO-R11-cFGF-21、SUMO-TAT-cFGF-21和SUMO-Fc-cFGF-21的表達;e～h. cFGF-21、R11-cFGF-21、TAT-cFGF-21和Fc-cFGF-21的純化;i. 四種重組cFGF-21對HepG2細胞葡萄糖吸收的影響,與空白組相比,**. 差異極顯著(P<0.01)a-d. Expression of SUMO-cFGF-21, SUMO-R11-cFGF-21, SUMO-TAT-cFGF-21 and SUMO-Fc-cFGF-21;e-h. Purification of cFGF-21, R11-cFGF-21, TAT-cFGF-21 and Fc-cFGF-21; i. Effects of four kinds of recombinant cFGF-21 on glucose uptake in HepG2 cells. Compared with the control group,**. Extremely significant difference (P<0.01)

2.2 糖尿病鼠血糖、血糖波動情況和HbA1c檢測

在整個研究過程中,cFGF-21、Fc-cFGF-21、R11-cFGF-21在試驗的第一階段能夠將血糖水平維持在接近正常水平,將血糖從最初的(20.03±1.98)、(19.45±1.57)和(19.63±1.62)mmol·L-1分別降低到為(8.82±0.47)、(9.85±0.61)和(9.24±0.95)mmol·L-1。TAT-cFGF-21在試驗的第一階段將血糖從最初的(20.03±1.65)mmol·L-1降低到(12.2±0.95)mmol·L-1(圖2a),與其他治療組相比效果略差。末次給藥24 h后,cFGF-21、Fc-cFGF-21和R11-cFGF-21組血糖在12 h內波動趨勢相近(10～14 mmol·L-1),與cFGF-21組相比,TAT-cFGF-21組在12 h內血糖水平較高(P<0.01),波動較大(14～21 mmol·L-1)(圖3a)。

a. 第一階段小鼠血糖檢測;b. 第二階段小鼠血糖檢測;c. 第三階段小鼠血糖檢測。與cFGF-21組相比,*. 差異顯著(P<0.05);**. 差異極顯著(P<0.01)a. The first stage of blood glucose detection in mice; b. The second stage of blood glucose detection in mice; c. The third stage of blood glucose detection in mice. Compared with the cFGF-21 group,*. Significant difference(P<0.05);**. Extremely significant difference (P<0.01)

a～c分別為第一階段、第二階段和第三階段結束后12 h內血糖波動檢測;d. OGTT;e. HbA1c水平。與cFGF-21組相比,*. 差異顯著(P<0.05);**. 差異極顯著(P<0.01)a-c are the blood glucose fluctuation tests within 12 hours after the end of phase 1, phase 2 and phase 3, respectively; d. OGTT; e. HbA1c levels. Compared with the cFGF-21 group,*. Significant difference(P<0.05);**. Extremely significant difference(P<0.01)

在試驗的第二階段,每3 d給藥一次,用藥時間間隔變大,cFGF-21、TAT-cFGF-21治療組的血糖較Fc-cFGF-21和R11-cFGF-21有明顯上升。cFGF-21、TAT-cFGF-21組的血糖分別上升到(15.1±0.53)和(17.86±0.92)mmol·L-1,而Fc-cFGF-21、R11-cFGF-21組的血糖無顯著增長,仍能保持在(10.82±0.57)和(11.2±0.67)mmol·L-1(圖2b)。末次給藥72 h后,cFGF-21、Fc-cFGF-21和R11-cFGF-21組血糖在12 h內波動趨勢相近(11～15 mmol·L-1),與cFGF-21組相比,TAT-cFGF-21組在12 h內血糖顯著升高(P<0.01),保持高水平波動(19～24 mmol·L-1)(圖3b)。

在試驗的第三階段,每5 d治療一次,cFGF-21、TAT-cFGF-21組血糖從第30天(即第一次連續5 d沒有給藥)開始升高,兩組血糖顯著高于Fc-FGF-21、R11-FGF-21組(P<0.01)(圖2c)。末次給藥120 h后,與cFGF-21組相比,Fc-cFGF-21和R11-cFGF-21血糖仍維持在較低水平(P<0.01),且波動趨勢相近(12～16 mmol·L-1),而TAT-cFGF-21組血糖仍保持在較高水平(P<0.01),血糖保持高水平波動(20～24 mmol·L-1)(圖3c)。

與模型組相比,cFGF-21、Fc-cFGF-21和R11-cFGF-21組的HbA1c水平分別顯著降低了35.15%、46.67%和46.96%(P<0.01)。與cFGF-21組相比,Fc-cFGF-21和R11-cFGF-21組的HbA1c水平分別顯著降低了11.68%和11.81%(P<0.01)(圖3e)。以上結果表明,R11-cFGF-21和Fc-cFGF-21長效降糖效果顯著優于cFGF-21和TAT-cFGF-21。

2.3 cFGF-21改善糖尿病鼠的口服葡萄糖耐量

與模型組相比,R11-cFGF-21和Fc-cFGF-21組的OGTT顯著改善,接近空白組。而cFGF-21和TAT-cFGF-21組與模型組相比雖然有所改善,但與R11-cFGF-21和Fc-cFGF-21組結果有顯著差異(P<0.01)。在整個試驗過程中,R11-cFGF-21和Fc-cFGF-21組的改善效果明顯優于cFGF-21和TAT-cFGF-21組(圖3d)。因此,經過Fc和R11修飾的cFGF-21治療的糖尿病小鼠對血糖的調節能力優于cFGF-21和TAT-cFGF-21組。

2.4 cFGF-21調節葡萄糖代謝的分子機制

實時熒光定量PCR結果顯示,與模型組相比,cFGF-21、Fc-cFGF-21、R11-cFGF-21和TAT-cFGF-21治療顯著降低了小鼠肝組織中G6pase和PEPCK的轉錄(P<0.01)(圖4a、c),同時促進了GK、GLUT1和GLUT4轉錄的升高(P<0.05,P<0.01)(圖4b、e、f)。由于G6pase和PEPCK表達的降低會抑制肝糖異生,同時GK、GLUT1和GLUT4表達的升高將會促進葡萄糖的吸收,這些變化將導致血糖的降低。與模型組相比,4個治療組均顯著增加了脂肪組織中PPARγ的轉錄水平(P<0.01),其中Fc-cFGF-21組的PPARγ的轉錄水平最高。這表明各治療組在脂肪組織中的胰島素敏感性顯著提高,葡萄糖吸收能力顯著增強(圖4 d)。此外,cFGF-21、Fc-cFGF-21、R11-cFGF-21和TAT-cFGF-21治療后,糖尿病小鼠的SGLT1和SGLT2轉錄水平顯著降低(P<0.01)。與cFGF-21組相比,Fc-cFGF-21和R11-cFGF-21組的SGLT1和SGLT2轉錄水平明顯降低(P<0.01),而TAT-cFGF-21組的SGLT1和SGLT2轉錄量沒有顯著差異(圖4 g、h)。以上結果表明,4種融合蛋白能促進肝、腸、腎和脂肪組織中的葡萄糖吸收,其中Fc-cFGF-21和R11-cFGF-21增加葡萄糖吸收的能力明顯優于cFGF-21和TAT-cFGF-21。

a～h. G6pase、GK、PEPCK、PPARγ、GLUT1、GLUT4、SGLT1和SGLT2的mRNA轉錄水平;與模型組對照相比,*. 差異顯著(P<0.05);**. 差異極顯著(P<0.01);與cFGF-21組比較,#. 差異顯著(P<0.05);##. 差異極顯著(P<0.01)a-h. mRNA transcript levels of G6pase, GK, PEPCK, PPARγ, GLUT1, GLUT4, SGLT1 and SGLT2. Compared with the model group,*.Significant difference(P<0.05);**. Extremely significant difference(P<0.01). Compared with the cFGF-21 group,#. Significant difference(P<0.05);##. Extremely significant difference(P<0.01)

2.5 cFGF-21改善糖尿病鼠的脂質代謝并修復肝損傷

治療后,cFGF-21、Fc-cFGF-21和R11-cFGF-21組的TG、TC和LDL顯著低于模型組(P<0.01),而HDL水平顯著高于模型組(P<0.01),與正常水平相當。與模型組相比,TAT-cFGF-21組的TG、TC和LDL的水平顯著降低(P<0.05),HDL水平顯著高于模型組(P<0.05)。與cFGF-21組相比,TAT-cFGF-21的TG、TC和LDL水平顯著上升(P<0.05,P<0.01),而HDL水平顯著降低(P<0.05)(表2)。

表2 血脂檢測

與模型組對照相比顯著,*.差異顯著(P<0.05);**.差異極顯著(P<0.01);與cFGF-21組比較,#.差異顯著(P<0.05);##.差異極顯著(P<0.01)

Compared with the model group,*. Significant difference(P<0.05);**. Extremely significant difference(P<0.01); Compared with the cFGF-21 group,#. Significant difference(P<0.05);##. Extremely significant difference(P<0.01)

此外,在試驗結束時還測定了肝功能指標。4個治療組的AST、ALT、ALP、GGT水平顯著低于模型組(P<0.05,P<0.01)。與cFGF-21相比,Fc-cFGF-21和R11-cFGF-21組的AST和ALT水平極顯著降低(P<0.01),ALP、GGT水平顯著降低(P<0.05)。與cFGF-21相比,TAT-cFGF-21組的AST、ALT、ALP水平極顯著上升(P<0.01),GGT水平顯著升高(P<0.05)(表3)。以上結果表明,Fc-cFGF-21和R11-cFGF-21可以改善糖尿病引起的肝損傷和脂質代謝紊亂。

表3 肝功能檢測

與模型組對照相比顯著,*.差異顯著(P<0.05);**.差異極顯著(P<0.01);與cFGF-21組比較,#.差異顯著(P<0.05);##.差異極顯著(P<0.01)

Compared with the model group,*. Significant difference(P<0.05);**. Extremely significant difference(P<0.01); Compared with the cFGF-21 group,#. Significant difference(P<0.05);##. Extremely significant difference(P<0.01)

2.6 cFGF-21修復糖尿病鼠的胰腺損傷

為探討cFGF-21對糖尿病小鼠氧化應激的影響,測定了胰中氧化應激相關酶的含量。結果表明cFGF-21、Fc-cFGF-21和R11-cFGF-21組的活性氧ROS水平(圖5d)顯著低于模型組(P<0.05),而抗氧化酶SOD水平(圖5e)顯著高于模型組(P<0.01)。與cFGF-21組相比Fc-cFGF-21和R11-cFGF-21組的ROS表達水平更低(P<0.05),SOD水平有更為顯著的升高(P<0.01),而TAT-cFGF-21組SOD和ROS的表達水平都與cFGF-21組較為接近。

a～f分別為IL-1β、IL-10、IL-17A、ROS、SOD表達水平和血清胰島素水平。與模型組對照相比,*. 差異顯著(P<0.05);**. 差異極顯著(P<0.01);與cFGF-21組比較,#. 差異顯著(P<0.05);##. 差異極顯著(P<0.01)a-f are IL-1β, IL-10, IL-17A, ROS, SOD expression levels and serum insulin levels, respectively. Compared with the model group,*. Significant difference(P<0.05);**. Extremely significant difference(P<0.01). Compared with the cFGF-21 group,#. Significant difference(P<0.05);##. Extremely significant difference(P<0.01)

ELISA結果表明,4個治療組糖尿病小鼠胰腺中的炎性因子,如IL-1β和IL-17A的表達水平(圖5 a,c)與模型組相比顯著降低(P<0.01),抗炎因子IL-10表達水平(圖5b)與模型組相比顯著升高(P<0.01)。TAT-cFGF-21組的IL-1β和IL-10表達水平與cFGF-21組沒有顯著差異,而IL-17A的表達水平比cFGF-21組有明顯升高。Fc-cFGF-21和R11-cFGF-21組炎癥因子IL-1β和IL-17A的表達水平明顯低于cFGF-21組,而抗炎因子IL-10表達水平遠高于cFGF-21組。以上結果表明,Fc-cFGF-21和R11-cFGF-21能更大程度地改善因糖尿病而引發胰腺的炎癥反應和氧化應激,而TAT-cFGF-21與cFGF-21沒有明顯差異。

HE染色結果表明,空白組胰島區域相對完整,其中包含大量的胰腺β細胞。相反,模型組胰島由于變形而受損,并且胰腺β細胞幾乎不可見。在cFGF-21組中,胰島的結構得到部分改善,胰腺β細胞的數量增加。TAT-cFGF-21組的胰島有一定程度的恢復,胰島β細胞數量仍然減少。而R11-cFGF-21組胰島結構相對清晰,胰腺β細胞的數量明顯增加。Fc-cFGF-21組胰島結構更加清晰,胰腺β細胞分布更均勻,數量明顯升高(圖6)。因此,經過Fc-cFGF-21和R11-cFGF-21治療后,糖尿病小鼠的胰腺修復情況明顯優于cFGF-21組,而TAT-cFGF-21組胰腺有一定程度的修復,但與cFGF-21組相比沒有顯著差異。此外,與模型組相比4個治療組血清胰島素都有顯著的升高(P<0.05,P<0.01),其中Fc-cFGF-21和R11-cFGF-21組的胰島素水平明顯高于cFGF-21組(P<0.05,P<0.01),而TAT-cFGF-21組與cFGF-21組沒有顯著的差異(圖5f)。

a. 胰腺組織HE染色(紅色箭頭表示胰島區域);b. 胰島β細胞在胰島中的百分比,與cFGF21組相比,*.差異顯著(P<0.05);**. 差異極顯著(P<0.01)a. HE staining of pancreatic tissue (Red arrow indicates islet area); b. Percentage of pancreatic β-cells in islets. Compared with the cFGF21 group,*. Significant difference(P<0.05);**. Extremely significant difference(P<0.01)

3 討 論

對于CDM的分類目前獸醫界尚有分歧,但無論哪一類型的CDM在病程的終末都會因為胰島β細胞的損壞造成對胰島素的依賴[20]。當前治療CDM的胰島素主要為人源及豬源胰島素類似物,其缺陷為血糖下降較快易造成低血糖、造成低鉀血癥以及產生抗胰島素抗體等問題[21]。

犬FGF-21在前期研究中表現出穩定安全降糖的特點,同時可調節機體和氧化應激水平[12]。與胰島素相比,犬FGF-21治療犬糖尿病的優點:無免疫原性;調節血脂、肝功能;改善炎癥和氧化應激,同時還能保護重要器官(如:胰腺和肝等)。但將其開發成為一種更高效、更長效的降糖藥物,仍需要在利用率和半衰期及長期藥效方面進行研究。

IgG 型免疫球蛋白的Fc具有許多功能,如延長半衰期、形成二聚體與受體結合等[22]。細胞穿透肽(CPPs)已被證明是一種有效的遞送載體,試驗表明它能將多種物質如蛋白質、多肽和小分子藥物等通過體內及體外的方式,在保證活性分子依然發揮作用的情況下導入到細胞內,而且不會產生免疫反應[23]。作者構建了3種融合蛋白Fc-cFGF-21、R11-cFGF-21和TAT-cFGF-21,通過治療T1DM小鼠模型來比較3種融合蛋白和cFGF-21治療效果,為提高cFGF-21治療CDM的長效性研究提供重要的依據。

3.1 試驗設計依據

FGF-21通過結合和激活由共受體β-Klotho和成纖維細胞生長因子受體1c(FGFR1c)組成的受體復合物而發揮其生物效應[24]。由于結構上的差異FGF-21分子的C端相對于N端的蛋白水解速度高達10倍,可能會改變藥代動力學及其藥效。與FGF-21的C端相連產生的復合物會降低對β-Klotho的親和力,使其作為FGF-21受體的激動劑的效力降低;而與FGF-21的N-端相連產生的復合物不存在這方面的弊端[25]。因此,為了盡最大程度保證cFGF-21的生物學功能,選擇將這3種標簽分別與cFGF-21的N端連接,構建3種融合蛋白,即:Fc-cFGF-21、R11-cFGF-21和TAT-cFGF-21。

由于犬FGF-21序列與小鼠FGF-21序列表現出約80%的相似性,并且兩個序列之間的功能區幾乎相同,因此推測cFGF-21可以在小鼠細胞或模型鼠中表現出其生物學活性。

3.2 Fc和R11提高了cFGF-21的長效降糖作用

在試驗的不同階段,重組蛋白表現出不同的能力,隨著給藥間隔時間的延長,cFGF-21長效降血糖能力逐漸下降,Fc-cFGF-21和R11-cFGF-21長效降血糖能力逐漸突顯。同樣12 h血糖波動試驗結果表明,Fc-cFGF-21和R11-cFGF-21可將小鼠血糖維持在較低水平且波動平穩。HbA1c能反映患者2～3個月的血糖平均水平,檢測結果表明,Fc-cFGF-21和R11-cFGF-21可使小鼠血糖保持長期平穩。

綜上所述,Fc和R11的修飾提高了cFGF-21的長效降糖作用,可使糖尿病小鼠的血糖長期保持接近正常的穩定水平。

3.3 cFGF-21調控糖代謝的分子機制

許多研究表明,肝的糖代謝在糖尿病的發病機制中起著重要作用[26]。葡萄糖生成的速度由關鍵步驟的葡萄糖生成酶(如PEPCK和G6Pase)的表達/激活決定[27]。FGF-21通過誘導脂肪細胞中葡萄糖轉運蛋白1(GLUT1)的表達來增強葡萄糖攝取,而胰島素通過增加葡萄糖轉運體4(GLUT4)向細胞膜的轉位,增加糖的攝取[28]。鈉依賴性葡萄糖協同轉運蛋白(SGLT1和SGLT2)在腎和腸道的葡萄糖吸收中起關鍵作用,已被提出作為糖尿病和心肌病的新型治療策略[29]。在本研究中,Real-time PCR分析結果顯示,Fc-cFGF-21和R11-cFGF-21顯著降低了糖尿病小鼠肝中G6pase、PEPCK、腎SGLT1和腸道中SGLT2的轉錄水平,提高了肝中GLUT1。這些結果表明,Fc-cFGF-21和R11-cFGF-21更有效抑制肝糖異生、促進肝組織的糖吸收以及抑制腎和腸道中葡萄糖重吸收來維持長期降糖作用。

3.4 Fc和R11提高了cFGF-21改善血脂代謝及肝功能的能力

據報道,糖尿病患者血脂異常會產生冠心病等并發癥[30]。模型組小鼠出現了嚴重的血脂異常,而經Fc-cFGF-21和R11-cFGF-21治療的小鼠LDL、TC和TG水平顯著降低(表2),且HDL水平與空白對照組接近,這表明Fc-cFGF-21和R11-cFGF-21改善了糖尿病鼠的血脂代謝紊亂。此外,在糖尿病患者中經常發現伴隨的肝疾病[31]。在本研究中,作者還發現糖尿病小鼠在不進行任何治療的情況下出現了肝損傷(與空白組小鼠相比,ALP、ALT、AST、GGT水平更高),而Fc-cFGF-21和R11-cFGF-21治療逆轉了這一現象。這些結果表明,在各治療組中Fc-cFGF-21和R11-cFGF-21顯著改善了高血糖引起的血脂異常和肝功能。

3.5 Fc和R11提高了cFGF-21修復胰的能力

有研究發現FGF-21通過抗氧化反應和抑制NF-κB炎癥途徑下調TNF-α、IL-1β和IL-17A,上調IL-10的表達水平來減輕類風濕關節炎、肥胖和急性炎癥等的嚴重程度[32-33]。此外,活性氧ROS增多影響胰島β細胞生理活性,并降低靶細胞對胰島素的敏感性[32]。本研究中,糖尿病小鼠肝在未接受任何治療的情況下處于高氧化應激狀態,經Fc-cFGF-21和R11-cFGF-21治療的小鼠ROS表達水平顯著降低,抗氧化酶SOD表達水平顯著增加,抑制了胰腺的氧化應激反應。胰腺炎癥會導致胰島β細胞的損傷,進而加重糖尿病患者的病情[33]。此外,脂肪中PPARγ的水平上升導致脂聯素分泌增加,間接增加了胰島素敏感性和抗炎作用[34]。本研究中,Fc-cFGF-21和R11-cFGF-21治療的模型鼠的炎癥因子IL-1β和IL-17A表達水平顯著降低,而PPARγ和抗炎因子IL-10表達水平明顯增加。這些結果表明,Fc和R11修飾后的cFGF-21抑制了胰腺炎癥的發生,改善了氧化應激反應,最終導致胰腺損傷被修復,這可能是Fc-cFGF-21和R11-cFGF-21長效降糖的主要原因。

HE染色結果顯示,模型組胰島嚴重變形,胰島β細胞幾乎全部消失,各治療組不同程度地修復了胰腺損傷。其中Fc-cFGF-21組修復效果最為理想,R11-cFGF-21組胰島結構相對清晰,胰島β細胞明顯增加,TAT-cFGF-21和cFGF-21組的胰島有一定程度的恢復,胰島β細胞數量相對較少。病理結果表明,Fc-cFGF-21和R11-cFGF-21顯著修復了胰腺損傷,TAT-cFGF-21修復胰腺能力較差。

胰腺的β細胞被損壞導致胰島素分泌不足,這是CDM的主要病因之一。本研究中,Fc-cFGF-21和R11-cFGF-21提高了糖尿病鼠血清胰島素水平并改善了糖耐受,且治療效果顯著優于cFGF-21。這些結果表明,Fc和R11修飾的cFGF-21有效地修復胰腺損傷,促進了胰島素分泌進而改善機體調節血糖的能力。

3.6 不同穿膜肽對cFGF-21治療效果的影響

穿透肽(CPP)進入細胞的具體分子機制目前還未揭示,不過任何一種CPP都不是以單一方式發揮穿膜作用。推測包括以下兩種方式:1、通過胞吞作用進入細胞;2、通過靜電作用與細胞膜相結合,而后誘導膜脂質雙分子層產生短暫的孔隙進而直接滲透進入靶細胞。

TAT和R11是陽離子CPP,賴氨酸(Lys,K)和精氨酸(Arg,R)對CPP攜帶正電荷起主要作用。Arg在側鏈有一個胍基,而Lys有一個銨基,胍基與脂質雙層的相互作用力明顯強于Lys的胺基,這通常導致富含Arg的CPP比富含Lys的CPP顯示出更高的細胞膜親和性[35]。富含精氨酸的CPP毒性小,并且Arg的CPP在低微摩爾濃度下不會引起膜滲漏[36]。

因為FGF-21需要與細胞膜受體結合后發揮生物學效應[37],R11的化學組成決定其比TAT對細胞膜更具親和力,因此這可能是R11-cFGF-21表現出比TAT-cFGF-21具有更好治療效果的主要原因。但TAT-cFGF-21的總體降糖效果差于cFGF-21,筆者推測可能是TAT更傾向于通過胞吞作用進入細胞,對細胞的滲透作用強于R11,致使有很大一部分TAT-cFGF-21進入細胞中無法發揮其生物學功能,故TAT的融合反而降低了細胞膜外TAT-cFGF-21的濃度。

4 結 論

R11-cFGF-21和Fc-cFGF-21可以顯著改善血脂代謝和肝功能,同時通過改善胰腺氧化應激和炎癥,從而修復胰島β細胞,增加胰島素的分泌,且治療效果優于cFGF-21和TAT-cFGF-21。經R11和Fc分子修飾的cFGF-21提高了其體內的生物有效性,且增強了長效降糖作用。