鴿微RNA病毒實時熒光定量RT-PCR檢測方法的建立

張靖鵬,陳翠騰,林 琳,付環茹,李兆龍,江 斌,黃 瑜,萬春和

(福建省農業科學院畜牧獸醫研究所/福建省禽病防治重點實驗室/福建省畜禽疫病防治工程技術研究中心,福州 350013)

根據國際病毒分類委員會(The International Committee on Taxonomy of Viruses,ICTV)[1]的分類,微RNA病毒屬(Megrivirus)屬于小核糖核酸病毒科Kodimesavirinae亞科,微RNA病毒屬有5個病毒種(Species),分別為微RNA病毒A型、微RNA病毒B型、微RNA病毒C型、微RNA病毒D型和微RNA病毒E型。

Megrivirus在一些患病的禽類中被鑒定,如在患火雞病毒性肝炎的火雞肝、腸道和泄殖腔拭子中均檢測到Megrivirus[2],但其對宿主是否致病及致病力如何尚未見相關報道。2013年,Phan等[3]在匈牙利與中國香港地區的野鴿糞便中均發現存在Megrivirus,將其命名為鴿微RNA病毒(pigeon megrivirus,PiMeV)(MeV-B1株和MeV-B2株),ICTV根據其基因特點將其劃入微RNA病毒B型,但未見進一步研究報道。

微RNA病毒是一類單股正鏈RNA病毒,無囊膜、呈球形、直徑20～30 nm。病毒基因組大小為6 000～9 700 bp[4],多數含有一個大的開放閱讀框(open reading frame,ORF),編碼一個大的多聚蛋白(polyprotein)。多聚蛋白一般由結構蛋白P1和2個非結構蛋白(P2和P3)組成。結構蛋白P1在蛋白酶的作用下分解為4種衣殼蛋白:VP1、VP2、VP3和VP4。P2和P3分解為7種非結構蛋白:2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D[5]。本研究根據GenBank中PiMeV代表株(MeV-B1株和MeV-B2株)序列特征設計檢測引物,從1例腹瀉綜合征信鴿糞便中檢測到PiMeV陽性(命名為PiMeV-CHN001株),為中國大陸地區信鴿群中首次發現該病。隨后基于3C基因特征,建立檢測PiMeV的實時熒光定量RT-qPCR方法,為后續開展PiMeV流行病學調查奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 毒株和菌株

鴿源禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)、鴿源禽I型副黏病毒(pigeon paramyxovirus type I,PPMV-1)、鴿輸血傳播病毒(pigeon torque teno virus,PTTV)、鴿腺病毒(pigeon adenovirus,PiAd)及鴿圓環病毒(pigeon circovirus,PiCV)[6-8]均由福建省農業科學院畜牧獸醫研究所鑒定并保存。

1.2 主要試劑與耗材

實時熒光定量試劑盒qPCR SuperMix Universal購自賽默飛(Thermo Fisher)公司;病毒核酸提取試劑盒EasyPure Viral DNA/RNA Kit、脫氧核糖核酸酶I(DNase I)、反轉錄試劑盒 Reverse Transcriptase、PCR擴增試劑盒2×TransTaq-T PCR SuperMix和T克隆載體試劑盒pEASY-T1 Simple Cloning Kit、膠回收試劑盒Quick Gel Extraction Kit和質粒小量提取試劑盒Plasmid MiniPrep Kit均購自北京全式金生物技術有限公司;熒光定量八排管(PCR-0208-C)購自愛思進(Axygen)公司;其他常規化學試劑和耗材,均購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.3 目的基因的克隆

1.3.1 序列擴增 參考GenBank上登錄的PiMeV代表株3C基因保守序列特征設計特異性檢測引物組(PiMeVF1和PiMeVR1,引物序列:PiMeVF1:5′-GAGCRACCTTYCTTGGCTTTATC-3′,PiMeVR1:5′-TTCAAGTTCTTTCCAKGCYTTCTG-3′),預期擴增片段長度974 bp。

向信鴿糞便中加入滅菌PBS(體積比為1∶3)混勻,反復凍融3次,4 000 r·min-1離心20 min,吸取上清液,利用EasyPure Viral DNA/RNA Kit提取病毒總RNA后將其反轉錄為cDNA,對其進行目的基因擴增,對RT-PCR產物用瓊脂糖凝膠電泳鑒定后克隆測序。

1.3.2 序列分析 將3C基因測序結果在NCBI上進行BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)分析,并和數據庫中的其他微RNA病毒進行分析比較,并繪制其遺傳進化關系[9]。本研究使用的毒株信息見表1。

表1 本研究涉及到的毒株信息

1.4 實時熒光定量RT-PCR檢測方法的建立

1.4.1 引物設計 根據“1.3”中3C基因設計特異性的RT-qPCR的引物,引物序列:Mes2-1F:5′-CCCACTTCTGTCCCTGAATAAG-3′;Mes2-1R:5′-CCAGGGCAAGGTCTTCTTTAT-3′,預期片段大小為110 bp。

1.4.2 標準曲線的建立 以“1.3”中含有3C基因的陽性質粒(命名為T-3C)為本研究的陽性標準品。利用微量核酸測定儀測定其濃度后,換算成拷貝數(5.4×1010拷貝·μL-1),進行10連續倍比稀釋后備用。按照熒光定量試劑盒說明書配制20 μL的實時熒光定量RT-PCR反應體系,在不同引物終濃度(0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 μmol·L-1)對退火溫度(56、58、60和62 ℃)進行反應條件優化。反應結束后,用優化后的反應條件進行擴增,獲得擴增動力學曲線。以標準品起始拷貝數(5.4×101～5.4×106拷貝·μL-1)的常用對數(log quantity)為橫坐標,以循環數閾值(cycle threshold,Ct值)為縱坐標,繪制出RT-qPCR反應的標準線性回歸方程(標準曲線)。

1.4.3 特異性、敏感性和重復性試驗 用優化后的RT-qPCR反應條件分別對鴿常見的病原(如AIV、PPMV-1、PTTV、PiAd和PiCV)進行檢測,評價建立方法的特異性。以連續倍比稀釋的質粒標準品為模板,進行RT-qPCR反應,確定最小檢測限。用建立的實時熒光定量RT-PCR方法分別對標準品質粒(含量為5.4×102、5.4×104、5.4×106拷貝·μL-1)進行檢測,每種標準品含量重復3次,計算批內(intra-group)變異系數。分別將上述標準品分裝后置于-20 ℃保存,每隔7 d取出,共檢測3次,計算批間(inter-group)變異系數。

1.5 臨床樣品檢測

對臨床收集的42份信鴿糞便,按照“1.3.1”進行處理后,用本研究建立的RT-qPCR檢測方法和常規RT-PCR方法平行檢測,驗證兩種檢測方法之間的符合率。

2 結 果

2.1 3C基因序列分析

使用特異性引物對(PiMeV1/ PIMeVR1)擴增出約974 bp的目的條帶,含有完整3C基因編碼區,其中3C基因全長為591 bp,編碼197個氨基酸。通過序列檢索發現PiMeV存在半胱氨酸蛋白酶((cysteine protease)的特征基序為GFCG。核苷酸相似性分析可見,PiMeV-CHN001株與GenBank中其他2株野鴿源PiMeV(MeV-B1株和MeV-B2株)核苷酸同源率分別為89.5%和92.0%,氨基酸相似性分別為97.5%和99.5%。與Megrivirus屬的其余成員的核酸相似性為52.7～57.4%,與Picornaviridae科中部分感染禽類的病毒的相似性均低于46.9%。遺傳進化分析結果(見圖1)顯示,PiMeV-CHN001株與GenBank中其他2株野鴿源PiMeV(MeV-B1株和MeV-B2株)處于同一遺傳進化分支(Megrivirus B型分支),均屬于Megrivirus屬分支。

圖1 3C基因遺傳進化分析Fig.1 Phylogenetic analysis based on the 3C gene of PiMeV

2.2 實時熒光定量RT-PCR條件

優化后的反應體系:SYBR Green I Master Mix 10 μL,上/下游引物各0.8 μL,模板2 μL,加去離子水至20 μL。最佳反應條件:95 ℃預變性2 min;95 ℃ 10 s,56 ℃ 15 s,72 ℃延伸15 s,40個循環。標準曲線結果所示:該方法的標準曲線在5.4×101～5.4×106拷貝·μL-1有良好的線性關系,相關系數(R2)為1.00,斜率-3.335,Y值37.93,擴增效率通過公式E=10-1/斜率-1換算結果為99.4%,說明該方法有較好的擴增效率。

2.3 敏感性、特異性和重復性分析

敏感性分析發現,建立的RT-qPCR方法最低檢測限為54拷貝·μL-1(5.4×101拷貝·μL-1)。特異性分析(圖2A)結果所示,擴增曲線圖顯示該方法僅能擴增出PiMeV,而與AIV、PPMV-1、PTTV、PiAd和PiCV無交叉反應,未見特征性熒光信號。熔解曲線(圖2B)結果顯示,僅有PiMeV出現特征性單一溶解曲線峰值,Tm值為(81.69±0.22)℃,表明建立的RT-qPCR方法特異性強。重復性試驗表明,建立的RT-qPCR方法其批內變異系數(0.22%～0.45%)和批間變異系數(0.11%～0.80%)均小于1.00%。上述結果表明,建立的RT-qPCR方法敏感性高、特異性強、重復性好。

A. 擴增曲線;B. 熔解曲線;1. 鴿源微RNA病毒;2. 鴿源禽流感病毒;3. 鴿源禽I型副黏病毒;4. 鴿輸血傳播病毒;5. 鴿腺病毒;6. 鴿圓環病毒;7. ddH2O A. Amplification curve; B. Melting curves;1. PiMeV; 2. AIV; 3. PPMV-1; 4. PTTV; 5. PiAd, 6. PiCV; 7. ddH2O

2.4 臨床樣品的檢測

用本研究建立的RT-qPCR進行檢測,結果陽性樣品2份,陽性率為4.7%。同時以常規RT-PCR檢測,檢測出陽性樣品1份,陽性率為2.35%,常規RT-PCR檢出的陽性樣品在RT-qPCR的檢測結果中同樣為陽性,符合率為100%。將常規RT-PCR陽性經克隆測序分析可見,其3C基因和PiMeV-CHN001株核苷酸相似性為100%。

3 討 論

小核糖核酸病毒科的病毒感染宿主范圍廣泛,在多種哺乳動物和禽類中被發現,其中至少有13個屬源自禽類[19];有2種重要的禽類疾病與Picornaviruses有關,分別是禽腦脊髓炎(avian Encephalomyelitis, AE)[20]和鴨病毒性肝炎(duck viral hepatitis,DVH)[21],目前發現的Megrivirus屬病毒的成員均來源于家禽和野禽,除了可能與火雞病毒性肝炎(Turkey viral hepaitis,TVH)[2]有關以外、還被認為與雞吸收功能障礙綜合征(malabsorption syndrome,MAS)[17]和雞傳染性腺胃炎(transmissible viral proventriculitis,TVP)相關[22],但目前均缺乏確切的證據,其主要原因是目前無法對該屬的病毒進行體外有效分離培養。本研究前期嘗試通過SPF雞胚分離PiMeV病毒,同樣無法分離到該病毒。

Picornaviruses科病毒的非結構蛋白基因1B、1C、1D、2C、3C和3D都是保守的[1]。本研究通過對已發布的PiMeV的序列進行比對,在3C基因片段處設計了一對PCR引物,并首次于輕度腹瀉的信鴿糞便中擴增出目的片段,證實了在信鴿中存在PiMeV。3C基因表達的3C蛋白酶(3CPro)通過氫鍵網絡將具有催化活性的氨基酸Cys、His、Asp或Glu連接形成活性催化基團(catalytic triad)的三聯體,參與了小核糖核酸病毒的多聚蛋白加工,具有明顯的病毒種屬特異性。近年來,對于Picornaviruses科病毒3C蛋白的研究表明,該蛋白參與病毒前體蛋白的剪切,與促進病毒復制、調控細胞凋亡以及逃避免疫應答等[23]密切相關。本研究擴增了PiMeV中的3C基因并進行克隆測序,通過比對發現其與另外2株野鴿源PiMeV(MeV-B1株和MeV-B2株)處于同一遺傳進化分支(Megrivirus B型分支),均屬于Megrivirus屬分支。其與MeV-B2株核苷酸相似性為92.0%,氨基酸相似性高達99.5%,僅為19處的His突變為Try,說明該基因的突變多為密碼子的同義替換;3C蛋白具有半胱氨酸酶的特征催化基序Gly-X-Cys-Gly[24],通過氨基酸序列的比對與檢索,在PiMeV中,該基序為GFCG,與同為Megrivirus屬的其他種均不相同;MeV-B2與MeV-B1被認為是鴿源Megrivirus的兩種類型[2],序列比對的結果說明MeV-CHN001與MeV-B1也有較高的相似性,核酸的相似性分別為89.5%,氨基酸序列的相似性為97.5%,顯示3C基因有較高的保守性。同源比對結果顯示,MeV-CHN001與來自于匈牙利的MeV-B2毒株的相似性較來自于中國香港的MeV-B1毒株高,沒有表現出地理相關性,限于目前公布的PiMeV的基因較少,該結果還需要更多的毒株序列進行佐證。

實時熒光定量PCR具有快速、特異、靈敏的特點,適用于與臨床檢測,但尚未見相關檢測技術應用PiMeV檢測的報道。本研究以PiMeV的3C基因片段設計了一對特異性引物,通過條件優化建立了檢測PiMeV的RT-qPCR方法,該方法有較強的特異性,僅對PiMeV檢測出現陽性熒光信號,而與AIV、PPMV-1、PTTV、PiAd和PiCV等鴿源病毒無交叉反應;該方法有較高的靈敏度高,最低檢測限為54拷貝·μL-1;重復性好,批內和批間的重復試驗結果顯示變異系數均較低。

4 結 論

本研究明確福建源PiMeV與GenBank中其他2株野鴿源PiMeV處于同一遺傳進化分支,均屬于Megrivirus屬分支。同時,本研究基于3C基因建立了PiMeV的RT-qPCR檢測方法,特異性強、靈敏度高、重復性好等優點,為開展PiMeV的流行病學調查奠定基礎。