右美托咪定通過抑制RIPK/MLKL通路減輕OGD/R誘導的神經元壞死性凋亡

孫凱

鄭州大學第二附屬醫院麻醉與圍術期醫學部 鄭州 450014

缺血性腦卒中(ischemic stroke,IS)是最常見的腦血管疾病。由于全麻后血管擴張及圍術期禁飲食,常導致有效血容量降低,尤其對有基礎病的老年患者,因腦血流灌注不足易發生圍術期IS[1]。溶栓后所引發的腦缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury, I/R)將進一步加劇腦損傷。減輕腦缺血再灌注造成的腦損傷,對于治療IS具有重要意義。壞死性凋亡是最新發現的一種兼具凋亡與壞死形態特征的細胞死亡方式[2]。研究表明,I/R過程中伴隨著壞死性凋亡[3],而壞死性凋亡抑制劑可顯著減輕I/R引起的腦損傷[4-5]。右美托咪定是一種常用的鎮靜藥,具有良好的鎮靜、鎮痛、抗焦慮、抑制交感活動作用[6],并可保護大腦免受I/R導致的損傷[7]。本研究采用HT22小鼠海馬神經元細胞,在體外建立氧糖剝奪/再灌注(oxygen-glucose deprivation/reperfusion,OGD/R)模型,擬評價右美托咪定在體外對OGD/R誘導的神經元損傷的保護作用,并基于抑制壞死性凋亡探討其作用機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 美國Bio-Rad公司的Imark酶標儀。美國Thermo Fisher公司的FRESCO21離心機。美國ABI公司的Q5熒光定量PCR儀。日本尼康公司的TS-2倒置熒光顯微鏡。美國Beckman公司的CytoFLEX流式細胞儀。

1.1.2 材料 HT22細胞購自中科院上海細胞庫。右美托咪定(純度≥98%)購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。DMEM培養基、青-鏈霉素雙抗、胰酶購自美國Thermo Fisher公司。胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)購自美國Gibco公司。細胞計數試劑盒(cell counting kit-8,CCK-8)購自日本同仁化學研究所。乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)試劑盒購自南京建成生物工程研究所。ANNEXIN V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自北京索萊寶公司?？俁NA提取試劑盒、cDNA合成試劑盒購自北京天根生物公司。SYBR熒光定量試劑盒購自美國Invitrogen公司。受體相互作用蛋白激酶1 (receptor-interacting protein kinase 1, RIPK1)、混合系列蛋白激酶樣結構域(mixed lineage kinase domain like protein,MLKL)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)抗體購自美國CST公司。增強型化學發光試劑(enhanced chemiluminescence,ECL)購自美國Merck公司。

1.2 方法

1.2.1 OGD/R模型的建立 HT22細胞培養于DMEM高糖培養基(含10% FBS,1%青-鏈霉素雙抗)中。細胞長至約60%<70%時,采用PBS清洗細胞3次,將培養基更換為無血清無糖培養基,置于低氧培養箱(1% O2、5% CO2、94% N2)中培養12 h后,復糖復氧24 h。

1.2.2 細胞給藥處理 (1)HT22細胞分為7組,右美托咪定分別設0、2.5、5、10、20、40、80 μM不同濃度梯度。給藥處理24 h后,采用CCK-8檢測細胞存活率。(2)HT22細胞分為5組,分別為對照組,OGD/R組,右美托咪定低、中、高濃度組(分別為2.5、5、10 μM)。細胞低氧12 h后,加入相應藥物,復氧24 h后,檢測細胞存活率、上清液中LDH含量,流式細胞儀檢測細胞凋亡,收集細胞提取RNA和蛋白用于后續實驗。

1.2.3 細胞存活率檢測 HT22細胞培養于96孔板中,藥物處理24 h后,每孔加入100 μL CCK-8溶液,置于37℃、5% CO2培養箱中培養1 h。采用酶標儀在450 nm處測定吸光值,計算細胞存活率。每組設置6個復孔,實驗重復3次。

1.2.4 細胞上清LDH含量檢測 HT22細胞培養于96孔板中,藥物處理24 h后,1 000 rpm離心10 min,取上清液,按照試劑盒說明書加入反應試劑,采用酶標儀在450 nm處測定吸光值,計算上清液中LDH含量。每組設置6個復孔,實驗重復3次。

1.2.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡 HT22細胞培養于6孔板中,藥物處理24 h后,加入胰酶消化2 min,加入血清終止消化。1 000 rpm離心10 min,棄上清,加入PBS清洗3次,1 000 rpm離心10 min,棄上清,PBS重懸細胞,加入5 μL Annexin V/FITC染料吹打混勻,室溫避光孵育5 min,加入5 μL PI染料后上機檢測。

1.2.6 逆轉錄-聚合酶鏈式反應(reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR) HT22細胞培養于6孔板中,藥物處理24 h后,消化并收集細胞,采用試劑盒提取細胞總RNA,反轉錄合成cDNA,采用SYBR熒光定量PCR試劑盒進行擴增。反應條件為:95℃預變性2 min,95℃變性20 s,60℃退火延伸20 s,共40個循環。以GAPDH作為內參,采用2-△△Ct法計算目的基因的相對表達量。引物由上海Invitrogen公司合成,序列為:RIPK1:5’-CTGTTCCCTGTGCCCAATAA-3’ (sense),5’-ATGACTCTGAAGCTGTCCTTT C-3’ (antisense);MLKL:5’-UCAAGGACGUGAACAGGAATT-3’ (sense),5’-UU CCUGUUCACGUCCUUGATT-3’ (antisense);GAPDH: 5’-CAAGGTCATCCA TGACAACTTTG-3’ (sense),5’-GGCCATCCACAGTCTTCTGG-3’ (antisense)。

1.2.7 免疫印跡(Western blot) HT22細胞培養于6孔板中,藥物處理24 h后,消化并收集細胞,加入RIPA裂解液,超聲破碎10 s,靜置裂解20 min,12 000 g離心20 min,收集上清。采用BCA試劑盒檢測蛋白濃度,加入loading buffer 后于100℃加熱10 min,進行SDS-PAGE凝膠電泳。濕法轉移至PVDF膜,5%脫脂奶粉室溫封閉2 h,加入一抗(RIPK1: 1∶1 000,MLKL:1∶2 000,GAPDH:1∶5 000),4℃搖床孵育過夜。PBST漂洗3次,加入HRP標記的二抗孵育30 min,PBST漂洗3次,滴加ECL顯色液后顯影,計算目的蛋白的相對表達量。

2 結果

2.1 右美托咪定對OGD/R誘導的HT22細胞存活率的影響與對照組比較,右美托咪定濃度在20 μM以上顯著降低了HT22細胞存活率,差異有統計學意義(P<0.05);當濃度低于10 μM時對細胞存活率無影響,因此后續研究選擇10 μM以下濃度。與對照組比較,OGD/R組細胞存活率顯著降低,差異有統計學意義(P<0.001)。與OGD/R組比較,右美托咪定5 μM和10 μM組均顯著提高了細胞存活率,差異有統計學意義(P<0.01,P<0.001)。見圖1。

注:與Control組相比,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001;與OGD/R組相比,##P<0.001,###P<0.001圖1 右美托咪定對OGD/R處理HT22細胞存活率的影響

2.2 右美托咪定對OGD/R誘導的HT22細胞上清LDH含量的影響與對照組比較,OGD/R組細胞上清中LDH含量顯著增加,差異有統計學意義(P<0.001)。與OGD/R組比較,右美托咪定5 μM和10 μM濃度組的LDH含量顯著降低,差異有統計學意義(P<0.001)。見圖2。

注:與Control組比較,***P<0.001;與OGD/R組比較,###P<0.001圖2 右美托咪定對OGD/R處理HT22細胞上清LDH含量的影響

2.3 右美托咪定對OGD/R誘導的HT22細胞凋亡的影響與對照組比較,OGD/R組細胞凋亡率顯著升高,差異有統計學意義(P<0.001)。與OGD/R組比較,右美托咪定5 μM和10 μM濃度組的細胞凋亡率顯著降低,差異有統計學意義(P<0.001)。見圖3。

注:與Control組比較,***P<0.001;與OGD/R組比較,###P<0.001圖3 右美托咪定對OGD/R處理HT22細胞凋亡率的影響

2.4 右美托咪定對OGD/R誘導的HT22細胞RIPK和MLKL的mRNA表達的影響與對照組比較,OGD/R組細胞RIPK1和MLKL的mRNA表達水平均顯著升高,差異有統計學意義(P<0.01);與OGD/R組比較,右美托咪定5 μM和10 μM組RIPK1和MLKL的mRNA表達水平均顯著下調,差異有統計學意義(P<0.01)。見圖4。

注:與Control組比較,**P<0.01;與OGD/R組比較,##P<0.01圖4 右美托咪定對OGD/R處理HT22細胞RIPK和MLKL的mRNA表達水平的影響

2.5 右美托咪定對OGD/R誘導的HT22細胞RIPK和MLKL蛋白表達的影響與對照組比較,OGD/R組細胞RIPK1和MLKL的蛋白表達水平均顯著升高,差異有統計學意義(P<0.01,P<0.001)。與OGD/R組比較,右美托咪定5 μM和10 μM組RIPK1和MLKL的蛋白表達水平均顯著下調,差異有統計學意義(P<0.01)。見圖5。

注:與Control組比較,**P<0.01,***P<0.001;與OGD/R組比較,#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001圖5 右美托咪定對OGD/R處理HT22細胞RIPK和MLKL的蛋白表達水平的影響

3 討論

近年來,IS的發病率逐年上升,我國每年約有190萬人死于IS[8]。及時恢復大腦供血是降低IS病死率的關鍵,但再灌注會造成腦組織新的損傷。因此,合理選擇具有腦保護作用的麻醉藥可有效減輕腦卒中引起的大腦損傷。本研究采用OGD/R處理HT22細胞,發現右美托咪定可顯著減輕OGD/R誘導的神經元凋亡,提高細胞存活率,減少LDH的釋放,與有關研究的結果一致[9]。

大量研究表明,壞死性凋亡是I/R引起大腦神經元死亡的重要方式,而抑制壞死性凋亡可顯著減輕I/R造成的腦損傷[3,6]。壞死性凋亡是一種依賴于RIPK和MLKL的細胞程序性壞死,其中RIPK1是壞死性凋亡的關鍵調控因子,其N端參與激活NF-κB信號,C端可與TNFR1相互作用,而同型作用結構域可與RIPK3結合形成壞死小體并參與誘導壞死性凋亡[2]。研究表明,RIPK1在I/R模型中表達顯著上調,RIPK1抑制劑可顯著減輕I/R引起的小鼠腦組織損傷[4,10]。MLKL是壞死性凋亡的執行者,其N端有個4HB結構域,正常時與C端的假性激酶樣區域結合而保持失活狀態。當RIPK1促使RIPK3活化后,RIPK3與MLKL結合,并使其暴露出4HB結構域,促使MLKL向細胞膜發生異位并寡聚化,影響細胞膜上的離子通道,促使水鈉內流及鉀離子外流,升高細胞內滲透壓,導致細胞壞死性凋亡[11]。另外,寡聚化的MLKL還可以與磷酸肌醇結合,直接破壞細胞膜的完整性而導致細胞壞死[12]。MLKL抑制劑可通過抑制壞死性凋亡,減輕急性缺血性腦損傷[5]。本研究中,RIPK1和MLKL的表達在OGD/R組均顯著升高,表明OGD/R誘導了細胞壞死性凋亡。右美托咪定可通過下調RIPK1的表達抑制MLKL活化,減輕OGD/R誘導的細胞壞死性凋亡。Chen等[13]在心肌細胞中也證實了右美托咪定可抑制低氧/復氧誘導的壞死性凋亡。

綜上所述,右美托咪定可通過抑制壞死性凋亡減輕OGD/R誘導的神經元損傷,不僅揭示了右美托咪定的神經元保護作用機制,也為右美托咪定在臨床麻醉中減輕圍術期IS提供了實驗依據。