胸腺肽α1對衰老小鼠肌肉減少癥的調控機制

亞森江·買買提,買買提吐爾洪·吐爾遜,蘇婷,穆克達斯·阿布力提甫,祖力菲亞·阿吉木,徐紅

(新疆維吾爾自治區人民醫院老年醫學中心,烏魯木齊830001)

肌少癥是一種以運動能力降低和肌肉量減少為特征的疾病,該病可增加人們致殘和致死的風險[1,2]。已知肌肉纖維在40歲后加速流失,到80歲時,肌肉將減少近30%,且難以有效治療,嚴重影響患者的生活質量[3]。因此,亟待深入研究有效治療肌少癥的藥物。胸腺肽α1是一種從小牛胸腺中分離出來高度保守的小肽段[4],在不同的生理和病理條件下(如感染、癌癥、免疫缺陷、衰老),胸腺肽α1具有恢復體內平衡的特殊能力,根據宿主的炎癥或免疫功能障礙狀態,胸腺肽α1作為多任務蛋白發揮作用[5,6]。然而,胸腺肽α1對衰老導致的肌少癥的作用并不清楚。本研究在地塞米松誘導的成肌細胞肌管直徑減少模型和快速衰老型小鼠(SAMP8小鼠)中探討胸腺肽α1對肌肉生成和肌肉萎縮的治療作用,報道如下。

1 材料與方法

1.1 研究材料

小鼠成肌細胞(C2C12)購于武漢普諾賽生物科技有限公司;地塞米松(dexamethasone, DEX)和胸腺肽α1購于美國Sigma公司;杜氏改良培養基(Dulbecco′s modified eagle medium, DMEM)和10%胎牛血清購于美國Gibco公司;30只無特定病原級別(specified pathogen free, SPF)的雄性SAMP8小鼠(28.20±1.80)g購于北京華阜康生物科技股份有限公司;Lipofectamine 2000購于美國Invitrogen公司;小干擾RNA針對沉默p62的重組載體(p62沉默載體)購于上海吉瑪公司;細胞計數試劑盒-8(cell counting kit-8, CCK-8)購于上海碧云天生物科技有限公司;SQSTM1/p62的第一抗體購于英國Abcam公司;肌球蛋白原D(myosinogen D, MyoD)、肌原細胞轉錄因子(myogenin, MyoG)、肌球蛋白重鏈(myosin heavy chain, MyHC)、肌肉RING-指蛋白1(muscle ring-finger protein 1, MuRF1)、肌肉萎縮相關蛋白(muscle atrophy related protein, MAFbx)的第一抗體均購于英國Abcam公司,所有對應的第二抗體均購于英國Abcam公司;TRIzol試劑購于美國Invitrogen公司;聚偏二氟乙烯膜購于美國Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1 C2C12的培養和分組 C2C12在37°C的5% CO2培養箱中進行培養,培養基為含10%胎牛血清的DMEM,每2天更換一次培養基。為了誘導C2C12肌管形成,細胞在2%馬血清誘導下培養6d,然后將細胞分為4組,包括對照組(PBS處理)、地塞米松組(50μmol/L地塞米松處理)、地塞米松+胸腺肽α1組(50μmol/L地塞米松聯合50ng/ml胸腺肽α1處理)及地塞米松+胸腺肽α1+p62沉默組(50μmol/L地塞米松、50ng/ml胸腺肽α1、聯合p62沉默載體和Lipofectamine 2000混合處理),每組各處理24h。所有各組的細胞在37℃、5% CO2的穩定環境中培養。用顯微鏡標尺策略各組細胞肌管的直徑。

1.2.2 CCK-8檢測各組細胞的增殖活性 根據生產商提供的說明,將處理好的對照組、地塞米松組、地塞米松+胸腺肽α1組的C2C12接種于96孔板(5×103個細胞/孔)中過夜,然后與10μl CCK-8溶液在37℃下反應3h。隨后,用酶標儀測定450nm處的吸光度(相對OD值)來表示細胞活力。

1.2.3 快速衰老SAMP8小鼠治療和分組 將30只雄性SAMP8小鼠按照隨機數表法分為SAMP8組、SAMP8+胸腺肽α1組、胸腺肽α1+p62沉默+SAMP8組,每組10只。每組的處理方法如下:(1)SAMP8組的SAMP8小鼠接受靜脈注射PBS;(2)胸腺肽α1+SAMP8組的SAMP8小鼠靜脈注射10mg/kg的胸腺肽α1;(3)胸腺肽α1+p62沉默+SAMP8組的SAMP8小鼠靜脈注射10mg/kg的胸腺肽α1和5μg/kg p62沉默載體。

所有動物每天注射1次,注射7d,第7天對每組小鼠進行瘦體質量(lean body mass, LBM)和總體質量的測量,隨后對所有動物進行安樂死,取小鼠比目魚肌組織用于Western blotting實驗檢測。本研究中所有的動物實驗通過新疆維吾爾自治區人民醫院倫理委員會的批準(倫理審查號:202207024)。

1.2.4 Western blotting 用放射免疫沉淀分析(radio-immunoprecipitation assay, RIPA)緩沖液裂解對照組、地塞米松組、地塞米松+胸腺肽α1組、地塞米松+胸腺肽α1+p62沉默組細胞和SAMP8組、SAMP8+胸腺肽α1組、p62沉默+胸腺肽α1+SAMP8組小鼠肌肉組織的勻漿液。用二辛可寧酸(bicinchoninic acid, BCA)法定量提取液的濃度。將20μg蛋白樣品用聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)凝膠分離,轉移到聚偏二氟乙烯膜上,用5%脫脂牛奶密封1h。將膜與一抗在4°C孵育24h,一抗包括p62 (1∶1000)、MyoD (1∶1000)、MyoG (1∶1000)、MyHC (1∶1000)、MuRF1 (1∶1000)、MAFbx (1∶500)。將膜與辣根過氧化物酶(horse radish peroxidase, HRP)偶聯的山羊抗兔IgG (1∶2000)一起孵育1h。與HRP偶聯的二抗在37°C孵育2h。最后,應用電化學發光(electrochemiluminescence, ECL)試劑顯示蛋白條帶,并用ImageJ軟件分析每個條帶的灰度值。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 胸腺肽α1對小鼠成肌細胞C2C12增殖活性的影響

與對照組(1.00±0.13)比較,地塞米松組的增殖活性(0.82±0.09)降低,差異有統計學意義(P<0.05)。與地塞米松組(0.82±0.09)比較,地塞米松+胸腺肽α1組增殖活性(1.46±0.17)增加,差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2 胸腺肽α1通過激活自噬活性抑制性信號SQSTM1/ p62對小鼠成肌細胞肌管形成的影響

與對照組比較,地塞米松組中p62的表達水平顯著降低,差異有統計學意義(P<0.05);與地塞米松組比較,地塞米松+胸腺肽α1組中p62的表達水平顯著增加,差異有統計學意義(P<0.05);與地塞米松+胸腺肽α1組比較,地塞米松+胸腺肽α1+p62沉默組中p62的表達水平顯著降低,差異有統計學意義(P<0.05;圖1,表1)。

表1 4組小鼠成肌細胞中SQSTM1/p62表達水平的比較

圖1 Western blotting檢測自噬活性抑制信號SQSTM1/p62的表達Figure 1 Western blotting detection of the expression of autophagy inhibitory signal SQSTM1/p62GAPDH: glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase.

2.3 胸腺肽α1對小鼠成肌細胞肌管形成的影響

與對照組比較,地塞米松組的肌管直徑顯著減少,差異有統計學意義(P<0.05);與地塞米松組比較,地塞米松+胸腺肽α1組肌管細胞形成的肌管直徑顯著增加,差異有統計學意義(P<0.05); 與地塞米松+胸腺肽 α1 組比較,地塞米松+胸腺肽 α1+p62沉默組的肌管直徑顯著減少,差異有統計學意義(P<0.05; 表2)。

表2 4組小鼠成肌細胞所形成肌管直徑的比較

2.4 胸腺肽α1通過激活SQSTM1/p62信號對分化相關蛋白和肌少癥相關蛋白表達的影響

與對照組比較,地塞米松組MyoD、MyoG、MyHC的表達水平顯著降低,而MuRF1和MAFbx的表達水平顯著增加,差異均有統計學意義(P<0.05);與地塞米松組比較,地塞米松+胸腺肽α1組MyoD、MyoG、MyHC的表達水平顯著增加,而MuRF1和MAFbx表達水平均顯著降低,差異有統計學意義(P<0.05);與地塞米松+胸腺肽α1組比較,地塞米松+胸腺肽α1+p62沉默組MyoD、MyoG、MyHC的表達水平顯著降低,而MuRF1和MAFbx表達水平均顯著增加,差異有統計學意義(P<0.05;圖2,表3)。

表3 4組小鼠成肌細胞中MuRF1、MAFbx、MyoD、MyoG及MyHC表達的比較

圖2 C2C12細胞中細胞分化和肌少癥相關蛋白的表達Figure 2 Expression of proteins associated with cell differentiation and sarcopenia in C2C12 cells MuRF1: muscle ring-finger protein 1; MAFbx: muscle atrophy related protein; MyoD: myosinogen D; MyoG: myogenin; MyHC: myosin heavy chain; GAPDH: glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase.

2.5 胸腺肽α1通過激活自噬活性抑制信號SQSTM1/p62抑制SAMP8快速衰老小鼠的肌少癥

與SAMP8組比較,胸腺肽α1+SAMP8組的p62顯著上調,差異有統計學意義(P<0.05);與胸腺肽α1+SAMP8組比較,胸腺肽α1+p62沉默+SAMP8組的p62顯著降低,差異有統計學意義(P<0.05);與SAMP8組比較,胸腺肽α1+SAMP8組的瘦體質量(lean body mass, LBM)/體質量(body mass, BM)占比顯著上調,差異有統計學意義(P<0.05);與胸腺肽α1+SAMP8組比較,胸腺肽α1+p62沉默+SAMP8組的LBM/BM占比顯著降低,差異有統計學意義(P<0.05);與SAMP8組比較,胸腺肽α1+SAMP8組的MuRF1和MAFbx的表達水平顯著下調,差異有統計學意義(均P<0.05);與胸腺肽α1+SAMP8組比較,胸腺肽α1+p62沉默+SAMP8組的MuRF1和MAFbx的表達水平顯著上調,差異有統計學意義(均P<0.05;圖3,表4)。

表4 胸腺肽α1治療后SAMP8小鼠中p62和肌少癥相關蛋白MuRF1、MAFbx的相對表達水平

圖3 Western blotting檢測胸腺肽α1治療后SAMP8小鼠中p62和肌少癥相關蛋白MuRF1、MAFbx的表達Figure 3 Western blotting analysis of p62 and sarcopenia related proteins MuRF1 and MAFbx in SAMP8 mice after thymosin α1 treatment MuRF1: muscle ring-finger protein 1; MAFbx: muscle atrophy related protein; GAPDH: glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase.

3 討 論

骨骼肌占人體質量的40%以上,在生命中承擔著重要的體力、能量消耗和代謝任務,但是衰老引起的肌肉萎縮和減少導致活動能力下降、跌倒的風險增加,最終影響生活質量;因此,肌肉萎縮也會增加肌少癥發病率和死亡率[7]。此外,作為重要的內分泌器官,肌肉功能障礙也可引起肝臟和脂肪代謝紊亂。因此,預防或延緩肌肉萎縮的發生非常重要。然而,肌少癥目前還沒有有效的治療方法[8]。在本研究中,胸腺肽α1在體內和體外均能有效改善肌少癥相關特征;其中胸腺肽α1可以逆轉因地塞米松誘導所導致的成肌細胞肌管直徑減少,上調成肌相關蛋白MyoD、MyoG、MyHC的表達。而在體內,胸腺肽α1顯著抑制了衰老小鼠的肌少癥相關蛋白MuRF1、MAFbx的表達并提高了小鼠瘦體質量在總體質量中的占比。這說明胸腺肽α1改善了衰老導致的肌少癥。

地塞米松是一種常見的糖皮質激素藥物,用于治療多種炎癥性疾病[9]。糖皮質激素對骨骼肌的作用是一把雙刃劍。一方面,糖皮質激素通過協調葡萄糖、脂質和蛋白質的代謝來維持代謝平衡;另一方面,長期和高劑量使用糖皮質激素可能導致許多被動效應,包括肌少癥[10,11]。在使用類固醇藥物超過4周的患者中,非炎癥肌病的發生率超過50%[12]。由于導致肌少癥的病因的多因素變化,肌少癥的潛在發病機制尚不完全清楚。目前的研究發現,地塞米松誘導活性氧上調,通過糖皮質激素受體激活泛素-蛋白酶體和溶酶體途徑,導致肌肉萎縮[13]。本研究中,給藥地塞米松導致成肌細胞的肌管直徑減少,且肌少癥相關蛋白MuRF1和MAFbx的表達都顯著增加,這表明體外地塞米松處理成肌細胞可以形成肌少癥的細胞特征。另外,地塞米松組中成肌相關蛋白MyoD、MyoG、MyHC的表達明顯減少,而當單獨使用胸腺肽α1治療后,肌管直徑和成肌相關蛋白MyoD、MyoG、MyHC的表達都明顯增加,而肌少癥相關蛋白MuRF1和MAFbx的表達都減少。已知MyoD、MyoG、MyHC等是肌生成的標志物和關鍵調節因子[14]。MuRF1和MAFbx則是與肌肉萎縮相關的蛋白,研究表明,MuRF1和MAFbx水平在肌少癥的早期上調,并在整個肌肉萎縮期保持高水平。MuRF1和MAFbx的敲除對小鼠去神經支配誘導的肌肉萎縮具有保護作用[15,16]。這表明了地塞米松誘導的體外肌少癥可以被胸腺肽α1所部分逆轉。

自噬是真核生物細胞質中極為保守的分解代謝過程,異常細胞器被轉運到溶酶體中降解,進行細胞器的再循環和更新。因此,自噬是維持細胞穩態所必需的,在代謝、結構重建、生長發育中起著重要作用[17]。已有研究表明,自噬的功能狀態與骨骼肌萎縮密切相關,自噬過度和自噬不足均可導致肌肉萎縮[18]。本研究檢測到無論地塞米松誘導成肌細胞還是SAMP8快速衰老小鼠,只要經過胸腺肽α1的治療,均可以顯著提高自噬活性抑制信號SQSTM1/p62的表達。而當沉默p62后,則逆轉了因胸腺肽α1治療對MyoD、MyoG、MyHC的表達促進作用,并且明顯抑制小鼠的MuRF1和MAFbx的表達以及顯著減少LBM在總體質量中的占比。這表明,抑制細胞自噬的活性是胸腺肽α1治療肌少癥中必不可少的過程。

綜上所述,本研究發現胸腺肽α1能有效抑制肌管和肌肉萎縮。進一步的機制探索證實,胸腺肽α1通過激活成肌細胞和衰老小鼠體內的自噬活性抑制的信號SQSTM1/p62從而發揮改善肌少癥的作用。本研究為衰老導致的肌少癥提供了有前途的治療靶點。