中華鱉源按蚊伊麗莎白菌的分離鑒定及藥敏特性研究

王玉柱 蔣巍巍, 劉文舒 路晶晶 唐艷強 肖海紅 郭小澤 李思明

(1. 江西省農業科學院畜牧獸醫研究所, 南昌 330200; 2. 四川農業大學動物科技學院, 成都 611130)

中華鱉(Trionyx sinensis), 隸屬于龜鱉目(Tesudines), 鱉科(Trionychidae), 鱉屬(Trionyx)。作為一種重要的水產養殖品種, 中華鱉在我國湖南、湖北、江西、江蘇等多省份均有分布, 全國商品鱉年產量達37萬噸以上[1]。近年來, 隨著中華鱉養殖規模的擴大和集約化養殖模式的推廣, 養殖密度過高、生產管理和病害防治技術落后等問題引發中華鱉細菌性疾病頻頻暴發[2], 給養殖戶帶來巨大經濟損失。目前, 中華鱉常見的細菌性疾病有嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)、弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacter freundii)、遲緩愛德華菌(Edwardsiella tarda)等致病菌引起的敗血癥、腐皮病、疥瘡病、白底板病等病癥[3—6], 然而, 在中華鱉病害的研究過程中, 仍不斷有致病菌的新型癥狀和新型致病菌被發現[7,8]。

按蚊伊麗莎白菌(Elizabethkingia anophelis), 隸屬于黃桿菌科(Flavobacteriaceae), 伊麗莎白菌屬(Elizabethkingia); 2011年, Peter K?mpfer等[10]首 次從岡比亞瘧蚊腸道中分離鑒定并命名[9]。按蚊伊麗莎白菌被認為是條件致病菌, 自該菌被發現以來,在中國、柬埔寨、丹麥、美國等全世界多個國家和地區報道了其感染人類的案例[11—15], 能夠引起人類敗血癥、腦膜炎等疾病。值得注意的是, 按蚊伊麗莎白菌對多種抗生素具有較強耐藥性[16], 并且根據基因組學分析, 其具有潛在的大規模暴發能力和全球快速傳播能力[17]。

2021年10月, 江西省撫州市南豐縣某中華鱉養殖基地暴發鱉大規模傳染性病害, 癥狀表現為行動遲緩, 頸部腫大, 有腹水, 并伴有腸道出血, 嚴重者可致死。為探究該中華鱉傳染病的病原, 我們以瀕死中華鱉作為樣本, 從中華鱉肝臟、脾臟中分離出一株優勢菌群, 經人工回歸感染試驗證實其具有致病能力。對該致病菌進行形態觀察、生理生化鑒定和16S RNA基因序列測定, 認定該分離株為按蚊伊麗莎白菌。進一步, 我們對該致病菌進行了藥敏試驗和全基因組測定, 并對其毒力因子進行了分析,以期為中華鱉養殖過程中預防和治療相關病害提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

患病中華鱉和人工回歸感染試驗用鱉從江西省撫州市南豐縣某中華鱉養殖基地獲得。

1.2 致病菌分離純化

用75%濃度酒精對瀕死病鱉進行體表消毒, 在無菌環境下解剖, 取部分肝臟、脾臟組織磨成勻漿,用滅菌棉簽蘸取組織勻漿, 劃線接種在LB固體培養基(青島海博生物技術有限公司)上。將培養基封口膜密封后, 轉移至28.5℃恒溫培養箱中培養24h。在培養結束后, 用滅菌接種環挑取培養基中優勢菌落的單菌落, 接種至新的LB培養基上, 再次在28.5℃恒溫培養箱中培養24h, 連續純化3次后, 得到目標菌株EJX2021?，F保存于江西省農業科學院畜牧獸醫研究所和中國典型培養物保藏中心(武漢),保藏編號為CCTCC NO: M 2022507。

1.3 分離株的鑒定

形態學觀察將凍存EJX2021菌株室溫復蘇, 在無菌環境下進行LB培養基劃線培養, 封口膜密封后轉移至28.5℃恒溫培養箱中培養24h。選定獨立菌落進行觀察, 記錄菌落的形狀、大小、顏色、表面特征, 透明度等表型特征。用滅菌接種環將單菌落挑至滅菌LB液體培養基中過夜培養。將部分菌液送至武漢塞維爾生物科技有限公司進行革蘭氏染色觀察和掃描電鏡觀察。

16S RNA基因序列測定將上文部分菌液3000 r/min離心5min, 后棄上清, 只保留細菌沉淀。用無菌PBS吹打重懸, 再次離心。重復2遍后, 收集細菌沉淀, 移送至北京擎科(湖南)生物科技有限公司進行16S RNA基因序列測定。將測定序列在NCBI數據庫(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中進行Nucleotide BLAST對比檢索, 并利用MEGA 7軟件鄰接法構建系統發育樹。

生理生化特性測定生理生化特征指標選定參考《常見細菌系統鑒定手冊》。生理生化鑒定管采購自青島海博生物技術有限公司, 具體操作方法按照說明書進行。

1.4 人工回歸感染實驗

人工回歸感染試驗選取50只幼鱉(50±5) g, 隨機分為5組, 每組10只, 置于暫養箱(72 cm×53 cm×42 cm)內。將EJX2021菌株活化后利用“麥氏比濁法”將菌液稀釋為2×107、1×108、5×108和2.5×109CFU/mL待用, 分別給5組鱉注射200 μL的各濃度稀釋菌液和無菌生理鹽水, 連續觀察15d。每天觀察并記錄中華鱉的死亡情況, 并對瀕死病鱉進行組織切片觀察和半數致死劑量(LD50)計算。

1.5 組織病理學觀察

在1.2和1.4步驟基礎上, 對健康鱉和人工回歸感染試驗瀕死病鱉進行解剖, 取肝、脾、肺、腸組織后分別放入4%多聚甲醛溶液固定, 移送武漢塞維爾生物科技有限公司進行組織HE染色觀察。

1.6 毒力因子分析

將上文收集的部分細菌沉淀移送至深圳微科盟科技集團有限公司進行全基因組測序。應用CAMS&PUMC病原生物學研究所毒力因子數據庫(Virulence factors of pathogenic bacteria, VFDB)(http://mgc.ac.cn/cgi-bin/VFs/v5/main.cgifunc=VFanalyzer)的VFanalyzer在線工具對毒力因子進行篩選。

1.7 抗生素藥物敏感性實驗

選取23種常規抗生素用常規紙片擴散法(Kirby-Bauer)進行藥物敏感性試驗。在無菌條件下, 將分離株菌液調制成1個麥氏單位濃度, 用涂布器將200 μL菌液均勻涂布在LB培養皿(90 mm)上, 每個培養皿貼放3片藥敏紙片(采購自杭州微生物試劑有限公司)。用封口膜將培養皿封口后倒置在恒溫培養箱中28.5℃培養24h, 培養結束后測量抑菌圈直徑。

2 結果

2.1 菌株的鑒定

形態學觀察分離株在LB營養瓊脂平板上28.5℃培養24h后, 菌落形態如圖1A所示。分離株形態呈現白色或微黃色橢圓形, 表面濕潤、光滑,中間隆起, 邊緣整齊, 呈半透明狀, 直徑1—2 mm(圖1A)。經過革蘭氏染色后, 分離株呈現紅色長桿狀, 判定革蘭氏陰性菌(圖1B)。通過掃描電鏡觀察, 菌體直徑約0.65 μm, 成熟個體長度約1.45—1.65 μm, 兩端鈍圓, 菌毛密集, 無鞭毛( 圖1C)。

圖1 分離株菌落形態、革蘭氏染色及掃描電鏡結果Fig. 1 Colony morphology, Gram staining and SEM results of the isolates

16S RNA基因序列測定測序結果表明,EJX2021菌株16sRNA基因片段大小為1282 bp (Gen-Bank: OL989210.1)?；蛐蛄性贜CBI數據庫中的Nucleotide BLAST對比檢索結果顯示, 其與按蚊伊麗莎白菌的16S RNA基因序列(GenBank: AP022313.1、CP046080.1和CP071545.1)相似度為99.92%。選取部分與EJX2021菌株BLAST對比檢索結果相似的菌株和常見水產致病菌株基因序列, 利用MEGA7軟件對EJX2021菌株構建系統進化樹(圖2)。結果顯示, EJX2021菌株與按蚊伊麗莎白菌同屬一個分支。

圖2 EJX2021菌株基于16S RNA基因序列的系統進化樹Fig. 2 Phylogenetic tree of EJX2021 strain based on 16S RNA gene sequence

生理生化特性測定EJX2021菌株的生理生化特征如表1所示。按蚊伊麗莎白菌的生理生化指標在《常見細菌系統鑒定手冊》等鑒定手冊中無記錄, 因此EJX2021菌株生理生化特征指標的選擇參考黃桿菌屬細菌鑒定指標進行測定。結果顯示:糖(醇、苷)發酵試驗中, EJX2021菌株對X-甲基-D-葡萄糖苷、衛矛醇半固體呈陽性反應; 對D-阿拉伯糖醇、D-甘露糖、D-山梨醇、L-鼠李糖、阿東醇、阿拉伯糖、半乳糖、甘露醇、海藻糖、肌醇、麥芽糖、蜜二糖、木糖、乳糖、葡萄糖、水楊苷、松三糖、纖維二糖、蔗糖、淀粉等均呈陰性反應。在明膠和甘油生化試驗中, EJX2021菌株可使明膠生化管呈陽性, 甘油生化試驗呈陰性。此外, VP (伏普試驗)、ONPG (β-半乳糖苷酶試驗)、硫化氫試驗、賴氨酸脫羧酶、鳥氨酸脫羧酶、氧化酶、苯丙氨酸脫氨酶、丙二酸鹽、唾液酸鹽等測定均呈陰性, 硝酸鹽、尿素酶測定呈陽性。

表1 EJX2021菌株的生理生化鑒定Tab. 1 Physiological and biochemical identification of EJX2021 strain

2.2 人工回歸感染實驗

如圖3所示, 中華鱉腹腔注射不同濃度EJX 2021菌株后, 2×107、1×108、5×108和2.5×109CFU/mL注射菌液濃度的15d死亡率分別為10%、40%、70%和100%。2.5×109CFU/mL組在第11天時, 鱉全部死亡。利用改良寇氏法[18]計算EJX2021菌株LD50(表2), LD50=lg-1(Xk-i(∑p-0.5))=1.62×108CFU/mL。95%置信區間為lg-1{[Xk-i(∑p-0.5)]±1.96×108CFU/mL。即EJX2021菌 株 在15d內 的LD50為1.62×108CFU/mL, 95%置信區間為(0.78—3.37)×108CFU/mL。

表2 EJX2021菌株回歸感染試驗結果Tab. 2 Results of EJX2021 strain regression infection test

圖3 不同濃度EJX2021菌株感染中華鱉死亡曲線Fig. 3 Death curves of Trionyx sinensis infected with EJX2021 strain at different concentrations

2.3 組織病理學觀察

如圖4所示，經EJX2021菌株回歸感染后, 鱉腸道、肺臟、脾臟、肝臟等組織出現不同程度病變?；貧w感染后腸管組織發生腫脹, 腸壁明顯變厚;腸絨毛變化表現在杯狀細胞增多, 腸上皮柱狀細胞排列松散, 細胞紋狀緣不明顯或缺失?；貧w感染的肺組織可見肺泡壁明顯纖維化, 肺泡壁上皮細胞的細胞核溶解或消失, 肺泡腔內有炎癥滲出物?；貧w感染的脾臟組織可觀察到巨噬細胞數量增多, 細胞質空泡變性, 細胞核核仁減少; 淋巴細胞體積增大,胞核淡染?；貧w感染肝臟組織的肝小葉中央靜脈可見瘀血, 個別肝細胞發生壞死。

圖4 EJX2021菌株感染中華鱉組織病理學變化(HE染色)Fig. 4 Histopathological changes of Trionyx sinensis infected with EJX2021 strain (HE staining)

2.4 毒力因子分析

如表3所示，預測毒力基因共246個, 相關毒力因子分類包括黏附(Adherence)、分泌系統(Effector delivery system)、外毒素(Exotoxin)、胞外酶(Exoenzyme)、莢膜(Capsule)、運動性(Motility)、營養和代謝(Nutritional/Metabolic factor)、抗逆性(Stress survival)、競爭優勢(Antimicrobial activity/Competitive advantage)、信號調控(Regulation)、炎癥通路(Immune modulation; Inflammatory signaling pathway)、生物膜生成(Biofilm formation)、免疫調節(Immune modulation)、入侵(Invasion)、補體逃逸(Complement evasion/Serum resistance)和其他等16大類。

表3 EJX2021菌株毒力基因預測Tab. 3 Virulence gene prediction of EJX2021strain

2.5 藥物敏感性實驗

如表4所示，在23種抗生素藥物中, EJX2021菌株對6種敏感(多西環素、米諾環素、卡那霉素、哌拉西林、恩諾沙星和氟苯尼考), 2種中度敏感(頭孢曲松和頭孢哌酮), 其余15種耐藥。

表4 23種抗生素對EJX2021菌株的敏感性試驗結果Tab. 4 Sensitivity test results of 23 antibiotics to EJX2021strain

3 討論

3.1 致病菌的分離與鑒定

伊麗莎白菌屬細菌形態學特征明顯, 通常呈兩端鈍圓的桿狀, 大小約0.5 μm×(1.0—2.5) μm, 革蘭氏染色呈陰性; 菌落形態特征呈圓形隆起、半透明或透明。邊緣清晰, 表面光滑[19]。在本試驗中, EJX 2021菌株與伊麗莎白菌屬細菌形態學特征一致。伊麗莎白菌屬設立較晚, 現包含了6個菌種。分別是Kim等[19]在2005年從黃桿菌屬(Chryseobacterium)中重新分類的米爾伊麗莎白菌(Elizabethkingia miricola)和腦膜膿毒性伊麗莎白菌(Elizabethkingia meningoseptica), K?mpfer等[20]在2011年發現的按蚊伊麗莎白菌[9]和2015年發現的Elizabethkingia endophytica(后 經 證 實,Elizabethkingia endophytica歸類于按蚊伊麗莎白菌[21]), Nicholson等[22]在2018年 發 現 的Elizabethella bruuniana、Elizabethella ursingii和Elizabethella occulta?！冻Ｒ娂毦到y鑒定手冊》[23]《伯杰氏細菌鑒定手冊》[24]等快速鑒定手冊成書早于伊麗莎白菌屬的設立, 因此, 參照細菌生理生化特征作為按蚊伊麗莎白菌的鑒定手段有較大局限性。本試驗參考黃桿菌屬等細菌生理生化特征鑒定指標, 對EJX2021菌株進行部分生理生化指標鑒定, 結果顯示其對多數糖、苷、醇類物質不能利用, 對X-甲基-D-葡萄糖苷、衛矛醇等可利用; 可利用明膠, 不可利用甘油; 此外, EJX2021菌株還可分解硝酸鹽、產生尿素酶。細菌的16S RNA基因片段的保守性很高, 且在不同種間存在相對變異區, 在微生物鑒定時具有快速、高效和準確的特點[25]。所以, 測定16S RNA基因序列和構建系統發育樹的方法成為微生物鑒定的常用手段。在本試驗結果中, EJX2021菌株和6株按蚊伊麗莎白菌位于系統進化樹的同一分支(Bootstrap值為94), 證明EJX2021菌株和按蚊伊麗莎白菌屬于同一物種。因此, 通過形態學和分子生物學鑒定, 確認EJX2021菌株為按蚊伊麗莎白菌。

按蚊伊麗莎白菌廣泛分布在自然環境中[26], 自從2011年發現以來, 其持續被報道引起肺炎、菌血癥、新生兒腦膜炎等人類臨床醫學病癥[27,28], 被認為是醫院等環境中的重要條件致病菌[29]。在水產養殖中, 伊麗莎白菌屬的米爾伊麗莎白菌和腦膜膿毒性伊麗莎白菌導致蛙類等水產動物病害的報道屢見不鮮[30,31], 但是按蚊伊麗莎白菌感染水產動物的現象沒有報道。本研究首次發現了按蚊伊麗莎白菌感染中華鱉。在早期按蚊伊麗莎白菌屬的研究中, 對其生理生化鑒定手段缺乏, 基因序列對比已有伊麗莎白菌屬基因序列和相關報道, 往往引起伊麗莎白菌屬物種菌種鑒定的不準確判斷[32], 這可能是按蚊伊麗莎白菌在水產動物上報道較少的原因之一。

3.2 EJX2021菌株感染中華鱉組織病理學觀察

組織病理學觀察能夠直接、準確地反映器官、組織和細胞的病理學變化, 是研究自然發生和實驗誘導疾病形態特征和病變程度的最可靠、敏感和全面的測定方法之一[33]。關于按蚊伊麗莎白菌引起的動物機體病理學觀察報道較少, 本試驗觀察顯示, 按蚊伊麗莎白菌可造成中華鱉腸道、肺臟、脾臟和肝臟等組織器官不同程度的病理損傷。水產動物的細菌性感染往往呈現綜合性病癥,會引起肝、腸等部位細胞變性、組織崩潰、形成炎癥[34]。腸道、肺臟、肝臟、脾臟等是機體重要的免疫和代謝器官, 持續感染造成的組織器官漸進性損傷, 可能會引起中華鱉的呼吸障礙、營養吸收障礙、體液循環障礙等功能性障礙, 嚴重可致死[35]。按蚊伊麗莎白菌引起的組織器官病變可能是導致人工回歸感染中華鱉死亡的原因之一, 有待進一步驗證。

3.3 EJX2021菌株的致病性

中華鱉致病菌種類繁多, 致病力各不相同。前人實驗驗證, 蘇云金芽孢桿菌(Trionyx sinensis)在10—15 g中華鱉上的LD50為1×104.87—105.30CFU/mL[36], 蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)在200 g中華鱉上為4.91×106CFU/mL[37], 遲鈍愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)在150 g中 華 鱉 上 為2.45×106CFU/mL[38], 摩氏摩根菌(Morganella morganii)在4—6 g中華鱉上為1×107.24CFU/mL[39], 奇異變形桿菌(Proteus mirabilis)在150 g中華鱉上為1×107.83CFU/mL[40],嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)在500 g中華鱉上為1.5×108CFU/mL[41], 弗氏檸檬酸桿菌(Pelodiscus sinensis)在30 g中華鱉上為9.3×104CFU/g[6]。在本試驗中, 按蚊伊麗莎白菌在50 g中華鱉上的LD50為1.62×108CFU/mL。與上述常見致病菌相比,本研究中按蚊伊麗莎白菌對中華鱉的致死能力較弱。但是, 按蚊伊麗莎白菌不同亞種在不同地域環境中的毒性還缺乏研究支撐, 其對水產動物的潛在危險性仍不容忽視。

自從2011年被發現以來, 按蚊伊麗莎白菌在全球至少有4次以上的中到大規模暴發, 然而, 人們對按蚊伊麗莎白菌的認識仍不夠全面[42]。利用全基因組學對按蚊伊麗莎白菌毒力因子進行預測有助于我們深入了解和解釋其致病機制和臨床表現。Perrin等[43]對美國威斯康星州在2015—2016年暴發的細菌感染中分離的按蚊伊麗莎白菌樣本進行毒力因子預測, 結果顯示人源按蚊伊麗莎白菌株含有67個毒力基因, Teo等[44]在新加坡暴發疫情的按蚊伊麗莎白菌中預測得到關于脂多糖合成、鐵載體合成、血紅素攝取等分類毒力基因共216個。本試驗對比VFDB數據庫, 預測得到按蚊伊麗莎白菌的毒力基因246個, 共16類。前人研究結果顯示按蚊伊麗莎白菌的毒力因子涉及莢膜構成、脂多糖和脂質生物合成代謝、轉運蛋白、分泌系統、應激反應等多個方面[45]。細菌莢膜是位于細胞壁外的一層物質, 對細菌在動物機體中的依附、入侵和免疫逃避等有重要影響, 是引發腦膜炎等病癥的主要細菌毒力因素[46]。Perrin等[43]在威斯康星州樣本中發現了5類莢膜蛋白合成有關的基因, 本研究中發現了25個莢膜相關毒力基因。另外, 本試驗發現按蚊伊麗莎白菌中檢測到的部分毒力因子是許多致病菌的共同特征。例如,katG和zmp1因子能夠參與應激反應和結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)的發病過程[47,48],IlpA誘導產生的細胞因子在創傷弧菌引起的敗血病中起重要作用[49],clpP、tuf、rmla和dnak等毒力基因在一種擬香味類香味菌(Myroides odoratimimus)中可能參與了機體的入侵和防御等步驟[50]。同時, 我們還在按蚊伊麗莎白菌的毒力基因中發現了巨噬細胞感染和存活所需要的Mip蛋白[51]編碼基因。本研究對中華鱉源按蚊伊麗莎白菌毒力因子的預測顯示, 該菌株具有比人類臨床按蚊伊麗莎白菌更多且與人類致病菌高度重合的毒力因子群體, 表明中華鱉源按蚊伊麗莎白菌可能具有人類致病潛力。

3.4 EJX2021菌株的藥敏特性

水產養殖過程中抗生素的不合理使用往往導致水體致病菌出現廣泛耐藥性[52]。為檢驗EJX2021菌株的耐藥特征, 本試驗采用23種常見抗生素進行藥敏試驗, 結果顯示EJX2021菌株對四環素類的多西環素、米諾環素抗生素敏感, 對氨基糖苷類的卡那霉素敏感, 對β-內酰胺類的哌拉西林敏感, 對喹諾酮類的恩諾沙星和氟苯尼考敏感; 對頭孢菌素類的頭孢曲松和頭孢哌酮中度敏感; 對其他15種抗生素不敏感。本試驗結果與Pavel等[53]、王小龍等[54]的研究有較大差異, Pavel等[53]在俄羅斯產牛奶中分離出的按蚊伊麗莎白菌對哌拉西林、卡那霉素均不敏感; 王小龍等[54]在蘇州地區肺部感染者體內分離得到的按蚊伊麗莎白菌對頭孢曲松、頭孢哌酮、哌拉西林敏感, 對米諾環素中度敏感, 對卡那霉素、多西環素不敏感。上述結果說明EJX2021菌株為多重耐藥菌株, 且在不同環境中篩選出了耐藥性差異; 并且, 隨著按蚊伊麗莎白菌新品系不斷產生[55], 其耐藥性可能隨之增強。因此, 根據藥敏試驗結果判定按蚊伊麗莎白菌的治療方法顯得尤為重要。