柱層析提取黑果腺肋花楸原花青素、維生素C及體外活性研究

劉君宇，王曉林，鐘方麗，陳 浩

（吉林化工學院化學與制藥工程學院，吉林吉林 132022）

0 引言

黑果腺肋花楸（簡稱黑果），又稱野櫻莓［1］，原產于北美、北歐地區，生長于濕樹林和沼澤地帶［2］，其含有豐富的花青素、維生素等多種活性物質，對人體抗腫瘤、抗氧化、抗衰老具有顯著功效［3］.隨著社會的飛速發展，人類生活質量不斷提高，日益重視身體健康狀態，標志著天然產物具有非常廣泛的發展前景［4］.黑果作為營養豐富的優等經濟林作物，對天然保健食品的研究和開發具有重要意義［5］.

原花青素具有特殊的分子結構，主要由不同數量的表兒茶素和兒茶素構成，可以有效提高維生素C 的吸收率，對抗氧化及抑制DNA 損傷有出奇的效能［6］.可通過有機溶劑提?。?］、微波輔助提?。?］、超聲波提?。?］等方法提取黑果中原花青素，其果實中所富含的活性成分可有效防治心血管疾病、防止機體氧化，此類經濟林作物在醫藥、保健食品等領域［10］已廣泛應用.本研究采用柱層析循環聯合法對黑果中原花青素及維生素C進行聯合提取，探究其最佳提取工藝，追求消耗更少提取溶劑，得到更高提取效率，為黑果系列研究提供數據參考.

1 試驗材料與儀器

1.1 主要試驗材料

黑果（吉林省黑果花楸農業科技開發公司）；兒茶素標準品（上海寶曼生物科技有限公司）；抗壞血酸標準品、氨基苯磺酸（分析純，天津永大化學試劑有限公司）；鹽酸萘乙二胺（分析純，上?；瘜W試劑有限公司）；黃嘌呤氧化酶（上海寶曼生物科技有限公司）；甲醇、無水乙醇（分析純，天津大茂化學試劑有限公司）.

1.2 主要儀器與設備

TU-1950 型紫外-可見分光光度儀（北京普析通用儀器有限責任公司）；CHA-S 型數顯恒溫振蕩器（金壇華城開元試驗儀器廠）；H1850型臺式高速離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）；RE-52C型旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）；XMTD-8222型電熱鼓風干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）.

2 試驗方法

2.1 維生素C質量標準曲線的繪制

抗壞血酸接觸空氣易氧化，但在酸性環境中稍慢，為減緩其氧化速度，用較穩定的2 %的偏磷酸溶液將0.05 g抗壞血酸溶解于500 mL容量瓶中，蒸餾水定容，充分搖勻后即可得到維生素C 對照品溶液（100 μg/mL），吸取維生素C 對照品溶液0.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL 于50 mL容量瓶中，蒸餾水定容，紫外可見分光光度儀在246 nm處測其吸光度值，繪制標準曲線為：

其中，y為被測物吸光度值，x為維生素C的質量濃度（μg/mL）.

2.2 原花青素質量標準曲線的繪制

用甲醇將10 mg 兒茶素溶解與10 mL 容量瓶中，甲醇定容，充分搖勻后即可得兒茶素對照品溶液（1 mg/mL）.吸取兒茶素對照品溶液0.00、0.10、0.25、0.50、1.00、1.50 mL 于10 mL 容量瓶中，甲醇定容.取鹽酸與正丁醇（體積比為5：95）的混合溶液6.0 mL到錐形瓶中，加不同濃度的兒茶素對照品溶液1.0 mL、2 %硫酸鐵銨溶液0.2 mL，沸水浴回流反應40 min，立即冷卻至室溫，紫外可見分光光度儀在546 nm處測吸光度值，繪制標準曲線為：

其中，y為被測物吸光度值，x為原花青素的質量濃度（mg/mL）.

2.3 樣品上柱前工藝參數的確定

2.3.1 最佳提取溶劑的確定 取1.0 g的黑果果粉6份，以10 mL不同體積比乙醇水溶液為提取溶劑，200 r/min 條件下室溫搖床振蕩1 h，6 000 r/min 條件下低溫離心10 min，即得供試品溶液，按2.1和2.2的方法測定原花青素與維生素C的質量濃度，確定黑果不同活性成分的最佳提取溶劑.

2.3.2 吸漲率的確定 稱取1.0 g黑果粉末12份，6份一組，分別加入10 mL原花青素或維生素C 的提取溶劑，200 r/min 條件下室溫搖床振蕩0.5、1、2、3、4、5 h，分別按時取出，6 000 r/min 條件下低溫離心10 min，測定各份上清液體積，計算黑果原花青素、維生素C的吸漲率.

2.3.3 浸泡平衡時間的確定 分別測定2.3.2上清液中原花青素、維生素C的含量，以確定原花青素、維生素C在相應溶劑中溶解達到平衡時的浸泡時間.

2.4 柱層析分別提取黑果原花青素與維生素C

稱取黑果粉末5.0 g，濕樣上柱到直徑為2.0 cm 的玻璃層析柱中，充分混勻，保持乙醇溶液沒過樣品，保持室溫條件下靜置至浸泡平衡時間，確定的黑果的吸漲總體積為一個收集單位，控制流速為0.4 mL/min，收集3份洗脫液，剩余殘渣超聲提取1 h后抽濾，得殘渣超聲提取液，測定洗脫液和提取液中原花青素的質量濃度.

同樣方法，純水上樣，與洗脫原花青素不同的是，洗脫維生素C時層析柱需黑布包裹避光，收集3份水洗脫液和1份殘渣超聲提取液，測定洗脫液和提取液中維生素C的質量濃度.

2.5 柱層析循環聯合提取黑果原花青素與維生素C

黑果原花青素、維生素C 的提取連續進行，方法與2.4 單獨提取方法相同，選取4 根直徑為2.0 cm的玻璃層析柱，稱取黑果粉末5.0 g，共4份，濕樣上柱，收集洗脫液，在原花青素收集最后一份時，更換為維生素C的提取溶劑純水，繼續收集洗脫液，各洗脫液的最后一份，作為下一根層析柱的第一份洗脫液，從第二根柱開始，不浸泡至平衡時間，如此循環，測定各洗脫液中原花青素與維生素C的質量.分別合并原花青素與維生素C的洗脫液，濃縮，制成干浸膏.

2.6 黑果提取物的體外活性研究

2.6.1 黑果提取物對黃嘌呤氧化酶抑制能力的測定 參考文獻［11］的方法，向酶促反應體系中加入0.2 mL 濃度為2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mg/mL 黑果原花青素或維生素C 供試液.用紫外分光光度計測定加入黑果供試液前后樣品的吸光度值.通過式（3）計算提取物對黃嘌呤氧化酶的抑制率，由此可知從黑果中提取的原花青素、維生素C對黃嘌呤氧化酶抑制能力.

其中，C為黑果提取物對黃嘌呤氧化酶抑制率（%），A樣加入供試液時樣品吸光度，A空為無供試液對照組吸光度.

2.6.2 黑果提取物總抗氧化能力的測定 取2.13 g 磷酸鈉、0.99 g 鉬酸銨、6.67 mL 硫酸溶于200 mL 水中，混勻，即鉬酸銨反應體系.按0.02、0.04、0.08、0.12、0.16、0.20 mg/mL 的濃度梯度配制維生素C對照品溶液，取0.5 mL各濃度的對照品溶液，分別加入到5.0 mL鉬酸銨反應體系中，95 ℃水浴反應90 min 后，立即冷卻至室溫，紫外可見分光光度儀在695 nm 處測定吸光度值.以對照品溶液濃度為縱坐標，吸光度為橫坐標繪制標準曲線.將干浸膏溶解并且配制成濃度為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/mL 的原花青素或維生素C 樣品溶液，取不同濃度的樣品溶液 0.5 mL，加入5 mL 鉬酸銨反應體系，95 ℃水浴反應90 min后，快速冷卻至室溫，紫外可見分光光度儀在695 nm 處測定吸光度.被測物的總抗氧化能力以相當于多少濃度的維生素C來表示.

2.6.3 黑果提取物清除亞硝酸鹽能力的測定 將干浸膏溶解并稀釋，配制成濃度為0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mg/mL原花青素供試品溶液或濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL的維生素C供試品溶液，向試管中分別加入不同濃度的供試品溶液1.0 mL、10 μg/mL 的NaNO2溶液2.5 mL、由1.0 g NaCl 加蒸餾水溶解定容到500 mL 容量瓶，加少量濃HCl 調pH 至3.0 的模擬胃酸7.5 mL，37 ℃水浴反應30 min 后，迅速加入0.4 %對氨基苯磺酸溶液0.5 mL，靜置反應15 min，依次加入0.2 %鹽酸萘乙二胺溶液0.25 mL、蒸餾水7.0 mL，繼續靜置反應15 min.紫外可見分光光度儀在538 nm處測吸光度值.

將維生素C 對照品配置成濃度為0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL 的對照品溶液，于538 nm 處測得吸光度值.通過式（4）計算黑果提取物對亞硝酸鹽的清除率.以維生素C 對照品溶液和供試品溶液的清除率為縱坐標，質量濃度為橫坐標繪制標準曲線.分別計算維生素C對照品溶液和供試品溶液的IC50值.

其中，W為黑果提取物對亞硝酸鹽的清除率（%），A樣品為加入樣品溶液的吸光度，A空白為不加樣品溶液對照組吸光度，A對照為樣品溶液的本底值.

3 結果與討論

3.1 樣品上柱前工藝參數確定的試驗結果

3.1.1 最佳提取溶劑確定的試驗結果 如圖1 所示，分別以40 %乙醇水溶液和純水作為黑果原花青素和維生素C的最佳提取溶劑，提取液中原花青素和維生素C的質量分別達到最大值61.17、50.59 mg.

圖1 溶劑濃度的確定Fig.1 Determination of solvent concentration

圖2 吸漲率的確定Fig.2 Determination of suction rate

圖3 浸泡平衡時間的確定Fig.3 Determination of immersion equilibrium time

3.1.2 吸漲率確定的試驗結果 如圖 2 所示，黑果對40%乙醇水溶液和純水具有不同的吸收量，原花青素與維生素 C 的吸漲率分別為2.6、3.2 mL/g.故提取原花青素和維生素C 時，分別以2.6倍、3.2倍的果肉質量收集提取液.

3.1.3 浸泡平衡時間確定的試驗結果 如圖 3 所示，黑果提取液中原花青素與維生素C 的質量隨浸泡時間的延長逐漸增大，而浸泡時間分別達到3 h和2 h 后，兩種活性成分的質量基本保持不變，以此為參考，即黑果原花青素與維生素 C 的浸泡平衡時間為分別為3 h 和2 h；兩種活性成分以柱層析法同時提時，選擇較長浸泡時間3 h效果更好.

3.2 柱層析分別提取黑果原花青素和維生素C的試驗結果

分別測定3 份洗脫液及1 份殘渣超聲提取液中原花青素、維生素C 的質量，其總和視為100%，當洗脫液中相應的組分達到總量的95%以上時，視為完全提取，試驗結果見圖4.前3 份洗脫液及1份殘渣超聲提取液中原花青素和維生素C的總量分別為150.95、10.66 mg，且前2份洗脫液分別達到總量的95.81%、95.58%，總含量均大于95%.而第3份洗脫液含量較低，故只收集前2份洗脫液，第3份洗脫液作為下一根層析柱的提取溶劑.

圖4 分別提取原花青素和維生素C的試驗結果Fig.4 Experimental results of extracting anthocyanins and vitamin C separately

3.3 柱層析循環聯合提取黑果原花青素和維生素C

如圖5 所示，循環聯合提取黑果原花青素及維生素C 時，原花青素的前3 輪提取率分別為86.06%、88.56%、94.08%，第4 輪提取率高達99.31%.維生素C 前3 輪提取率分別為89.51%、90.71%、94.73%、第4輪提取率高達98.62%.結果表明，以此方法進行循環提取可用少量溶劑而得到較高濃度的洗脫液，大幅度增加生產效率.

圖5 循環聯合提取原花青素、維生素C的試驗結果Fig.5 Experimental results of proanthocyanidins and vitamin C by combined cycle

3.4 體外活性研究的試驗結果

3.4.1 抑制黃嘌呤氧化酶能力的試驗結果 如圖6 所示，以黑果原花青素、維生素C 供試液濃度為橫坐標，對黃嘌呤氧化酶抑制率為縱坐標，分別進行線性擬合：y=3.918x+30.496，R2=0.879 6，IC50值為4.978 mg/mL；y=4.106x+20.486，R2=0.999 6，IC50值為7.188 mg/mL.由試驗數據可知，隨著加入供試液中原花青素、維生素C 濃度的增大，對黃嘌呤氧化酶的抑制率隨之增高，且原花青素提取物對黃嘌呤氧化酶的抑制能力強于維生素C提取物.

圖6 黑果提取物對黃嘌呤氧化酶的抑制率Fig.6 Inhibition rate of xanthine oxidase by Aronia melanocarpa extract

3.4.2 總抗氧化能力測定的試驗結果 對維生素C對照品的抗氧化能力進行線性擬合：y=2.415 8x-0.043 8，R2=0.996 8.用黑果原花青素及維生素C提取物配制供試品溶液，測得其吸光度值，并代入標準曲線方程，如圖7所示，以相同吸光度值的維生素C對照品當量濃度來表示兩種提取物的抗氧化活性.當原花青素供試液濃度為2.41 mg/mL，維生素C供試液濃度為2.90 mg/mL，維生素C對照品溶液的當量濃度為0.3 mg/mL.說明黑果提取物具有一定的抗氧化能力.

圖7 黑果提取物總抗氧化能力測定的試驗結果Fig.7 Experimental results for determination of total antioxidant capacity of Aronia melanocarpa extract

3.4.3 清除亞硝酸鹽能力的試驗結果 如圖8 所示，兩種提取物原花青素、維生素C 的濃度越大，其清除亞硝酸鹽能力越強.原花青素、維生素C 提取物與對亞硝酸鹽清除率的線性擬合方程分別為：y=391.42x-26.398，R2=0.933 0，IC50值為0.195 mg/mL；y=111.06x+1.57，R2=0.986 2，IC50值為0.436 mg/mL.維生素C 對照品與對亞硝酸鹽的清除率線性擬合方程為：y=924.42x+3.97，R2=0.992 3，IC50值為0.047 mg/mL.結果表明原花青素提取物清除亞硝酸鹽的能力強于維生素C提取物，但兩種提取物對亞硝酸鹽的清除能力均弱于對照品維生素C.

圖8 黑果提取物清除亞硝酸鹽的試驗結果Fig.8 Experimental results of scevenging nitrite by Aronia melanocarpa extract

4 結論

在提取溶劑分別為40%乙醇水溶液和純水，吸漲率分別為2.6 mL/g和3.2 mL/g，浸泡平衡時間分別為3 h 和2 h 的條件下，經柱層析循環聯合提取后黑果原花青素及維生素C 的提取率均可達到95%以上.通過柱層析循環聯合法提取活性物質，可克服只提取一種物質的缺陷，且提取條件簡單，不破壞天然產物中的熱敏物質，原料消耗少，達到低耗高效的目的.

體外活性試驗表明，黑果原花青素及維生素C提取物均具有抑制高尿酸血癥、抗腫瘤能力和一定的抗氧化活性.以柱層析循環聯合法探究提取黑果原花青素及維生素C 的最佳工藝條件，從而進行活性成分的高效提取，可應用于研制具有抗衰老、抗腫瘤、降尿酸功能的輔助醫療產品.試驗結果為黑果這種經濟林作物的進一步研究開發與應用提供數據參考.