響應面法優化枸杞發酵工藝

劉靜鳳，孔維波，陳思敏，劉春秀，付丹陽，梅青剛，姜立春*

（1.綿陽師范學院資源環境工程學院，四川綿陽 621000；2.綿陽師范學院生命科學與技術學院，四川綿陽 621000）

0 引言

寧夏枸杞（LyciumbarbarumL.）為茄科（Solanaceae）枸杞屬（Lycium）落葉灌木［1-2］，由于其富含人體所需的32種微量元素和18種氨基酸［3］，以及枸杞多糖、甜菜堿、類胡蘿卜素等多種活性成分，具有抗氧化、抗疲勞、增強免疫力等功效［4-8］，有較高的藥用保健功能和營養價值，廣泛應用于泡酒、泡茶、煮粥［9-11］.

枸杞果酒是以枸杞為原料經發酵制成的含酒精的飲料，由于其具有較低的酒精度、濃郁的果香味并且還保留了枸杞原有的多糖、氨基酸和礦物質等天然活性成分，且符合當今酒類消費所倡導的以低酒精度取代高酒精度、果酒取代糧食酒的潮流，在酒種的發展中具有很大的潛力［12-13］.目前市售枸杞果酒大多采用干枸杞進行發酵，而對于新鮮枸杞果酒加工工藝優化的報道相對較少.且常用感官評分作為評價指標優化發酵工藝，對于酒香與口感評判具有較強的主觀性，缺乏生物活性物質含量作為客觀的品質指標來指導工藝優化過程.

本試驗以寧夏新鮮枸杞為原料，以枸杞發酵后的酒精度和感官評分值為指標，在單因素試驗的基礎上結合響應面法優化選取枸杞發酵工藝的最優參數條件，使發酵液酒精度和感官評分值達到最佳水平，從而為枸杞發酵產品的研制與開發提供試驗依據與理論支持，對進一步改善枸杞果酒的酒體品質具有一定的借鑒價值.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枸杞（杞利元寧夏枸杞店）、酵母菌（安琪酵母股份有限公司）、果膠酶（河南萬邦實業有限公司）、NaOH（天津市致遠化學試劑有限公司）、濃鹽酸溶液（天津市致遠化學試劑有限公司）.

1.2 儀器

SW-CJ-1FD 超凈工作臺（蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司）、MLS-3020 高壓蒸汽滅菌鍋（上海旦鼎國際貿易有限公司）、SC-3610低速離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司）、LKTC-B1恒溫水浴鍋（常州普天儀器制造有限公司）.

1.3 試驗方法

1.3.1 枸杞發酵工藝 將枸杞剪碎，按照液料比利用蒸餾水浸提以制備枸杞混懸液，而后加入果膠酶并調節pH，進行高壓蒸汽滅菌后，再接種活化酵母菌液，進行恒溫發酵處理.發酵一段時間后進行過濾、高速離心，取發酵上清液進行指標檢測.

1.3.2 單因素試驗 在不改變其他發酵參數的前提下，依次選取不同發酵時間（3、5、7、9、11 d）、發酵溫度（27、29、31、33、35 ℃）、接種酵母質量分數（0.5%、1.0%、1.5%、2%、2.5%）、液料比（10：1、15：1、20：1、25：1、30：1）和pH 值（4.0、5.0、6.0、7.0、8.0）進行單因素發酵試驗，以酒精度、感官評分為評價指標，確定各因素對枸杞發酵液酒精度、感官評分的影響.

1.3.3 酒精度的測定 參考國標《GB/T 15038—2006 葡萄酒、發酵液通用分析方法》的乙醇體積百分數的測定方法，為酒精測度法.

1.3.4 感官評定 離心分離后的枸杞發酵液，參照國標《GB/T 15038—2006 葡萄酒、發酵液通用分析方法》進行感官評定，感官評分標準見表1.

表1 發酵液感官評分標準Tab.1 The standard for sensory evalution of fermentation broth

1.3.5 響應面優化試驗 基于單因素試驗結果，選取發酵時間（A）、發酵溫度（B）以及接種酵母質量分數（C）為考察變量，-1、0、1分別代表變量的水平，并以酒精度（Y1）和感官評分（Y2）作為響應值，利用Design-Expert 13 軟件設計三因素三水平的響應面試驗，試驗設計因素和水平見表2.

表2 響應面試驗因素及水平Tab.2 Response surface test factors and levels

1.4 數據處理

使用Excle、Origin 2021 軟件進行繪圖和數據統計分析，Design-Expert 13 軟件進行響應面優化分析.

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 發酵時間對枸杞發酵的影響 隨著發酵時間的延長，接種的酵母菌逐漸從有氧呼吸增殖過程轉化為無氧呼吸產生酒精，由圖1 可知，發酵時間為5 d 時，枸杞發酵液的酒精度及感官評分達到峰值，分別為2.2% vol 和68 分.當發酵時間低于5 d 時，由于酵母菌的生長時間短，代謝過程中產生酒精的積累量較少，導致酒精度較低，發酵液風味不佳，感官評分值偏低；當發酵時間較長，超過5 d 時，發酵液中其他菌類的繁殖會爭奪所需要的營養為食，從而抑制酵母菌的生長，導致其他代謝物雜質的積累量增加，酒精積累量減少，且隨著發酵時間的延長發酵液中的苦澀味越明顯，導致酒精度和感官評分值均呈現下降趨勢.因此，確定最佳發酵時間為5 d.

圖1 發酵時間對枸杞發酵液酒精度、感官評分的影響Fig.1 Effect of fermentation time on the alcohol content and sensory score of Lycium barbara fermented liquor

2.1.2 發酵溫度對枸杞發酵的影響 枸杞多糖經過糖化轉變為葡萄糖供給酵母菌利用，發酵溫度與糖化速率成正相關，即發酵溫度越高糖化速率越快.于酵母菌而言，當發酵溫度較低時，其生長繁殖和代謝不旺盛，從而導致發酵液的酒精度偏低，且酒香味不醇厚，導致感官評分值較低；當發酵溫度偏高時，雖然對酵母菌的生長繁殖有促進作用，但高溫會導致發酵液中易于揮發的香氣成分加速流失，影響整體香氣，導致感官評分值降低，所以需要尋找合適的溫度來優化發酵產品效果.因培養瓶中已添加了酵母生長繁殖所需的各類營養物質［14］，在此均衡條件下，適宜溫度的選擇對酵母耐受性和發酵性能得到較好體現密切相關，且更有利于發酵產物積累［15］.由圖2 可知，在31 ℃時發酵液以酒精度2.4%vol 和感官評分值72 分達到最高點，當溫度低于或高于31 ℃時都酒精度曲線呈現出明顯下降的趨勢.因此確定31 ℃為枸杞發酵最適溫度.

圖2 發酵溫度對枸杞發酵液酒精度、感官評分的影響Fig.2 Effect of fermentation temperature on the alcohol content and sensory score of Lycium barbara fermented liquor

2.1.3 接種酵母質量分數對枸杞發酵的影響 隨著接種酵母質量分數的增加，酵母菌之間競爭營養物質來滿足自身生長繁殖的狀況越發激烈，可能會產生拮抗作用，反而使糖的利用率降低，導致酒精度積累量減少.由圖3 曲線的變化趨勢可知，接種酵母質量分數對酒精積累量有著顯著影響，當接種量為1.5%時，此時酒精的積累量和感官評分均處于最高水平，分別為2.3%vol 和75 分，營養成分溶出相對較高，當接種量低于1.5%時，酵母菌代謝產物累積量較少，發酵液整體風味不佳，導致酒精度和感官評分值偏低；當接種量超過1.5%后，由于酵母菌對營養物質的競爭作用，使得各自發酵的底物減少，導致酒精度和感官評分值降低［16］.因此確定最佳接種酵母質量分數為1.5%，能夠得到較好的發酵結果.

圖3 接種酵母質量分數對枸杞發酵液酒精度、感官評分的影響Fig.3 Effect of inoculated yeast mass fraction on the alcohol content and sensory score of Lycium barbara fermented liquor

2.1.4 液料比對枸杞果酒發酵液質量的影響 喬博鑫［17］的研究表明，液料比對酵母菌體的增殖存在影響，當液料比較低時，發酵液過于黏稠，可能會因為料液體積較小導致溶氧量不足，使酵母菌繁殖速度減慢，不利于其生長，使發酵液酒精度和感官評分低.而液料比偏大即過度稀釋，可能會因為初始糖濃度不足，也不利于酵母菌的增殖和發酵，會導致酒精積累量較少，且過高的液料比會導致發酵液的口感較差、色澤偏淡，香味物質的辨識度下降，酒精度和感官評分值降低.由圖4 可知，枸杞發酵液的酒精度及感官評分受液料比的影響不顯著，整體呈現較為平穩的狀態.在液料比為20：1時，發酵液的酒精度及感官評分值分別為2.1%vol和77分，因此確定最佳液料比為20：1.

圖4 液料比對枸杞發酵液酒精度、感官評分的影響Fig.4 Effect of liquid-solid ratio on the alcohol content and sensory score of Lycium barbara fermented liquor

2.1.5 pH 對枸杞果酒發酵液質量的影響 當枸杞發酵液的pH 較低時，酵母菌不易在此過酸的條件下生長繁殖，此時其代謝產物累積量較少，導致酒精度偏低；而當pH 偏高時，發酵液中的酸味不足且不利于酵母菌生長.由于酵母菌的代謝繁殖，初期會導致酸性中間產物大量產生，致使發酵液的pH 有所下降，而后中間產物在發酵過程中作為能量物質繼續被利用消耗，pH 值緩慢回升［18］.由圖5 可知，pH 的改變對酒精度和感官評分的影響并不明顯.本試驗與李彩霞［19］等人研究結果相似，酵母菌生長最適pH4.0～5.0 左右，此階段的酒精度與感官評分值均處于較高水平.當pH=5.0 時，枸杞發酵液香氣濃郁，口感良好，酸甜適中，色澤均勻，此時的酒精度為2.0%vol、感官評分為80分，故枸杞發酵最適pH=5.0時可以得到較好結果.

圖5 pH對枸杞發酵液酒精度、感官評分的影響Fig.5 Effect of pH value on the alcohol content and sensory score of Lycium barbara fermented liquor

2.2 響應面優化試驗結果

利用Design-Expert13 軟件，應用Box-Behnken 試驗原理，根據試驗方法1.3.5 進行響應面試驗設計，設計結果見表3.并對其試驗數據采用多元回歸分析，分別獲得Y1、Y2的回歸模型方差分析結果（見表4），再經多元線性回歸方程擬合，所得結果如下：

表3 響應面試驗設計及結果Tab.3 Response surface test design and results

表4 枸杞發酵酒精度及感官評分回歸模型方差分析Tab.4 Variance analysis of regression model for alcohol content and sensory evaluation of Lycium barbara fermentation broth

Y1=2.56+0.150A+0.112 5B+0.237 5C-0.050AB-0.050AC+0.075BC-0.392 5A2-1.07B2-0.517 5C（2R2=0.998 2，P<0.000 1）

Y2=80.40+3.75A+4.13B-0.125C-0.750AB+0.250AC-1.50BC-24.95A2-9.70B2-9.20C（2R2=0.999 6，P<0.000 1）

由響應面的方差分析結果可知，酒精度（Y1）和感官評分（Y2）的回歸模型顯著性結果均顯示為P<0.000 1，均為極顯著，具有統計學意義.且二者的R2值分別為0.998 2、0.999 6，都接近1，可見模型與試驗呈現出高度擬合狀態.失擬項通常用以評估方程的可靠性，若不顯著則方程模擬的較好，反之較差，酒精度（Y1）和感官評分（Y2）的失擬項均 >0.05，均為不顯著，由此可應用本試驗所得擬合回歸方程來替代試驗真實點對枸杞發酵過程中酒精度和感官評分進行推測和分析.根據回歸模型顯著性結果顯示：對于酒精度（Y1），一次項和二次項均為極顯著，其影響酒精度的強弱程度為：B>C>A；交互項BC具顯著性，其余為不顯著，則能夠說明B、C兩者之間的交互作用顯著，因此，在采用該擬合回歸方程模型時應考察二者之間的交互作用.對于感官評分（Y1），一次項C不顯著，其余均為極顯著，二次項又均為極顯著性，其影響酒感官評分的強弱程度為：A>B>C；交互項AB、AC間交互作用極顯著，由此在應用該模型時需要考慮到AB、AC間的交互作用.

2.3 響應面三因素交互作用分析

響應面圖能直觀地反映出兩因素之間的交互作用的大小，其傾斜度程度越大，且對應的等高線圖愈接近橢圓形，說明兩個因素之間的交互作用越顯著［20］，對響應值的影響程度越大；反知當曲面圖的坡度越平緩，對應的等高線越近似于正圓形，則說明這兩個因素之間的交互作用就越弱，對響應值的影響程度越小.由圖6可見，AB、BC間響應面圖的等高線均近于橢圓形，相較而言BC間曲面圖的傾斜程度更大；AC間曲面圖較為平緩，其等高線接近正圓形.結合表4方差分析的結果可知，各交互作用中的F值分別為AB=AC=4.83，BC=10.86，綜上，影響枸杞發酵的酒精度的各因素之間的交互作用大小為BC>AB>AC.

圖6 三因素交互作用對枸杞發酵液酒精度的影響Fig.6 Interaction of the three factors on the alcohol content of Lycium barbara fermented liquor

由圖7可知，AB間響應曲面坡度最為陡峭，且等高線近似于橢圓形，其次AC間曲面傾斜度較高；而BC曲面圖最為平緩，且等高線近正圓形.據表4 可得，兩兩因素交互作用對應的F值分別為AB=10.86，BC=43.45，AC=1.21，故而影響枸杞發酵的感官評分的各因素之間的交互作用大小為AB>AC>BC.

圖7 三因素交互作用對枸杞發酵液感官評分的影響Fig.7 Interaction of the three factors on the sensory evaluation of Lycium barbara fermented liquor

3 驗證試驗

在單因素試驗基礎上，確定枸杞發酵最佳的液料比為20：1 和pH 為5.0.結合響應面試驗進行優化分析，確定了枸杞發酵液的最佳發酵參數分別為發酵時間5.5 d、發酵溫度為31.17 ℃、接種酵母質量分數為1.56%.實際操作中，將各參數條件進行略微調整，實際參數條件及5 次重復驗證試驗，試驗結果見表5.

表5 參數優化后枸杞發酵液酒精度與感官評分值Tab.5 The alcohol content and sensory score of Lycium barbara fermented liquor after parameter optimization

優化發酵條件下，回歸模型所預估的發酵液酒精度為2.56%vol，感官評分為76.3 分；而實際試驗條件下，5 次重復試驗所得到的酒精度與感官評分平均值分別為2.53%vol 和79.7 分.這與回歸方程所得的酒精度與感官評分預測值較接近，表明該回歸方程與實際情況擬合度高，能夠比較準確真實地反映各因素對枸杞發酵液酒精度與感官評分的影響.

4 結論

本研究以枸杞為原料，基于單因素試驗探究五因素對枸杞微生物發酵（酵母菌）的影響，并以響應面分析法加以優化，確定了枸杞發酵制備的最優參數為：發酵時間5.5 d、發酵溫度為31 ℃、接種酵母質量分數為1.6%.在結合液料比20：1、pH5.0條件下，重復進行5次驗證試驗，所測得的實際酒精度和感官評分均值分別為2.53%vol和79.7分，與回歸方程所得的預測值，即酒精度2.56%vol與感官評分76.3分很接近，因此采用響應面法優化枸杞發酵工藝條件合理可靠，可為枸杞以及其他植物資源的果酒制備，實現綜合利用提供一定的借鑒價值.